銅脅迫對抗蟲轉基因水稻根際土壤微生物的影響①

王宵宵，鐘文輝，李 磊，洪 鑫，劉 標，韓 成*

銅脅迫對抗蟲轉基因水稻根際土壤微生物的影響①

王宵宵1,2，鐘文輝1，李 磊1,2，洪 鑫1,2，劉 標3，韓 成1*

(1 南京師范大學地理科學學院，江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點實驗室，南京 210023；2 南京師范大學環(huán)境學院，南京 210023；3 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學研究所，國家環(huán)境保護生物安全重點實驗室，南京 210042)

根際土壤微生物群落是聯(lián)系土壤環(huán)境與作物生長的重要紐帶，也是轉基因作物環(huán)境安全評價的主要指標，而Cu脅迫對轉基因水稻根際土壤微生物的影響目前尚不清楚。本研究基于盆栽試驗，采用高通量測序等技術研究Cu脅迫(Cu含量100 mg/kg)對抗蟲轉基因水稻華恢1號(HH)及其親本非轉基因水稻明恢63(MH)農(nóng)藝性狀及成熟期根際土壤微生物的影響，并以不施加Cu脅迫處理為對照。結果顯示：Cu脅迫顯著降低了水稻株高、生物量及產(chǎn)量；Cu脅迫改變了水稻根際土壤總氮、銨態(tài)氮含量及氧化還原電位值，而種植轉基因水稻僅降低了根際土壤氧化還原電位值；Cu脅迫沒有影響水稻根際土壤細菌豐度，但降低了細菌群落Alpha-多樣性，改變了水稻根際土壤細菌群落組成和群落結構；相同Cu含量脅迫下，HH和MH水稻生長指標及根際土壤細菌群落結構及組成差異較小。上述研究表明，Cu脅迫抑制了水稻農(nóng)藝性狀及根際土壤細菌群落，但種植抗蟲轉基因水稻沒有影響水稻植株及根際土壤細菌群落對Cu脅迫的抗性。

銅脅迫；細菌群落；轉基因水稻；根際土壤；環(huán)境安全評價

近年來，含Cu礦產(chǎn)的開采、冶煉廠三廢的排放，含Cu殺菌劑的長期大量使用和城市污泥的堆肥利用，使土壤含Cu量達到原始土壤的幾倍甚至幾十倍[1]。我國農(nóng)田土壤Cu污染現(xiàn)象日益嚴重，已威脅到環(huán)境生態(tài)的穩(wěn)定及人類的安全，甚至對植物、動物及土壤微生物產(chǎn)生危害，引起了國內(nèi)外很多科研人員的關注。Cu是水稻生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素。但當土壤中Cu含量超過一定量時，將對水稻生長發(fā)育及產(chǎn)量產(chǎn)生影響[2]。趙江寧等[3]的研究表明，水稻成熟期土壤可交換態(tài)Cu含量與Cu脅迫下水稻抽穗和成熟期推遲的天數(shù)以及莖蘗發(fā)生、單位面積穗數(shù)、每穗穎花數(shù)和產(chǎn)量的下降幅度均呈顯著或極顯著正相關。因此，提高水稻的耐Cu性是應對農(nóng)田土壤Cu污染的重要育種方向。土壤微生物活性和群落結構的變化能敏感地反映土壤質(zhì)量和健康狀況，是土壤環(huán)境質(zhì)量評價不可缺少的重要生物學指標[4]。當Cu含量超過一定量時，微生物的生長代謝將會受到抑制，土壤微生物數(shù)量和群落結構發(fā)生改變。Wang等[5]利用DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，土壤中重金屬Cu不同提取態(tài)的含量與微生物多樣性Shannon指數(shù)呈負相關，且由于生物可利用的重金屬含量超過土壤微生物的忍耐極限而導致微生物基因突變及種群更新。Liu等[6]采用PLFAs分析發(fā)現(xiàn)，高含量的Cu脅迫下，土壤總細菌數(shù)量、微生物生物量碳及酶活性顯著降低。Cu脅迫下，李月靈等[7]發(fā)現(xiàn)接種土壤微生物可以減輕Cu脅迫對植株造成的傷害，提高植株耐受Cu脅迫的能力。目前應用較多的分子生物學技術為PCR-DGGE技術、RFLP分析及定量PCR分析等[8]，這些手段往往通量低、信息量小，本研究采用Illumina Hiseq測序技術，可以更加全面準確地分析Cu脅迫下水稻根際土壤微生物群落結構。

在環(huán)境惡化及水稻可種植面積縮小等農(nóng)業(yè)問題的挑戰(zhàn)下，轉基因技術成為增產(chǎn)增收的重要手段和途徑[9]。轉基因水稻具有較強的抗逆性，崔榮榮等[10]研究發(fā)現(xiàn)，無論在適宜季節(jié)或非適宜季節(jié)，轉基因水稻的生存競爭能力和繁育能力高于親本。轉基因技術帶來經(jīng)濟利益的同時，其環(huán)境安全評價備受關注。土壤生態(tài)研究是轉基因作物環(huán)境安全評價中的重要內(nèi)容，目前證明轉基因作物對生物多樣性的潛在影響與非轉基因作物存在本質(zhì)不同的科學依據(jù)較少[11]。吳立成等[12]研究表明抗蟲轉基因水稻對根際土壤微生物的影響較小，且不持續(xù)。相比于外源基因的插入，生長環(huán)境的變化更易引起轉基因水稻性狀的改變[13]。然而，Cu脅迫是否會影響抗蟲轉基因水稻根際土壤微生物群落尚不清楚。根據(jù)我國土壤環(huán)境質(zhì)量標準(GB15618—2008)，一級、二級、三級農(nóng)田土壤的Cu含量標準分別為35、100、400 mg/kg，且目前Cu污染稻田土壤Cu含量可高達101.2 mg/kg[14]。由此，本研究以抗蟲轉基因水稻華恢1號及其親本水稻明恢63為研究材料，施加Cu含量100 mg/kg的Cu脅迫，測定不同處理下水稻的農(nóng)藝性狀，并采用定量PCR和Illumina Hiseq高通量測序技術對水稻根際土壤細菌群落豐度和結構變化情況進行探究，以明確Cu脅迫對抗蟲轉基因水稻農(nóng)藝性狀及根際土壤微生物群落結構的影響。

1 材料與方法

1.1 供試土壤及水稻種子

供試土壤為南京師范大學仙林校區(qū)(118°55′E，32°06′N)內(nèi)未經(jīng)人為干擾的自然土壤，去除表面植被、落葉及顆粒物后，采集0 ~ 15 cm深度土壤，室內(nèi)自然風干后研磨過篩(2 mm)，混勻后備用。土壤基本理化性質(zhì)為：pH 7.77，全氮 0.41 g/kg，總有機碳 2.7 g/kg，有機質(zhì) 4.65 g/kg，有效磷 3.53 mg/kg，銨態(tài)氮 0.28 mg/kg。該土壤未檢測到Cu等重金屬污染。供試水稻品種為明恢63(簡稱MH)和華恢1號(簡稱HH)，其中明恢63為非轉基因水稻，華恢1號是將抗蟲基因/轉入明恢63中獲得的轉基因水稻。水稻種子由華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院提供。

1.2 試驗設置及樣品采集

本試驗選用15 cm × 25 cm PVC塑料桶作為水稻盆栽用桶，每桶稱取相當于5.0 kg干土重的風干土壤，添加自來水使得盆栽桶中淹水4 ~ 5 cm，并添加不同量Cu對土壤進行為期30 d的預處理。盆栽桶口覆膜以減少水分揮發(fā)，膜上有孔以維持通氣狀態(tài)。試驗設置2個Cu含量脅迫處理，為Cu0和Cu100處理，Cu(II)添加形態(tài)為CuCl2·3H2O，添加量分別為0、100 mg/kg(以Cu(II)含量計)，每個處理設置4個重復。

重金屬預處理后，每桶施入N︰P︰K為1︰1︰1的復合肥作基肥，添加量為0.5 g/kg。將培養(yǎng)30 d后的HH和MH水稻幼苗分別移栽至桶中，每桶3株。水稻生長期間桶內(nèi)保持4 ~ 5 cm淹水層，于移栽后12 d追施氮肥(尿素，0.05 g/kg)，于移栽后30 ~ 37 d(水稻分蘗后期)進行曬田，其他管理措施與田間相同。

于移栽后112 d(水稻成熟期)對水稻植株進行破壞性采樣，并測定株高、生物量、籽粒重金屬含量等水稻農(nóng)藝性狀。水稻成熟期破壞性采樣后，根據(jù)土壤在水稻根系表面抖落和粘著的程度區(qū)分根際土壤及非根際土壤[15]。采集時仔細地從土壤中移出水稻根系，劇烈、快速抖動根系以將非根際土壤抖落，直至無法抖落土壤且可看清水稻根系；用無菌刮板輕輕刮取粘著在根系上的土壤(< 2 mm)，盡可能剔除植物殘留碎片及根系后混勻作為一個根際土壤樣品。一部分根際土立即裝入2 ml的離心管中于–80 ℃保存，用于微生物分子生態(tài)學分析；一部分根際土用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 土壤理化指標的測定

土壤無機氮采用2 mol/L KCl溶液按5︰1(/)的水土比浸提，在20 ℃、200 r/min條件下振蕩1 h過濾，濾液用流動分析儀(Skalar San Plus, Netherlands)測定；土壤pH用蒸餾水按2.5︰1(/)的水土比浸提，振蕩10 min，靜置30 min，采用臺式pH計(Mettler- Toledo)測定；土壤有效磷采用鹽酸-氟化銨按10︰1(/)的土水比浸提，鉬銻抗比色法測定；土壤全氮采用凱氏消煮法測定；土壤總有機碳采用TOC分析儀(島津TOC-L)測定。成熟期破壞性采樣前，采用微電極分析儀(Unisense Microsensor Multimeter Version 2.01)測定水稻盆栽水–土界面下3.8 cm處水稻根際土壤氧化還原電位值，測定方法參考文獻[16]。

1.4 土壤及植物各器官Cu含量的測定

土壤樣品采用0.1 mol/L鹽酸溶液按5︰1(/)的水土比浸提，在25 ℃、250 r/min條件下振蕩1 h過濾，濾液由ICP-AES測定；植物樣品采用濃硝酸-高氯酸消煮，ICP-AES測定，測定方法參考文獻[17]。

1.5 土壤總DNA提取

本研究采用試劑盒(FastDNA? Spin Kit for Soil, MP, Biomedicals, USA)提取土壤總DNA，按試劑盒的說明，每個土壤樣品稱取鮮土0.5 g。DNA溶液的質(zhì)量和濃度采用NanoDrop 2000(Thermo, USA)進行測定，提取好的DNA樣品稀釋10倍后保存于–20 ℃。

1.6 實時熒光定量PCR分析

采用基于SYBR green染料法的實時熒光定量PCR技術測定土壤細菌16S rRNA基因豐度來表征細菌群落豐度。測定機器為Biorad CFX96 Real-time PCR system(Biorad, USA)，SYBR green試劑選用2 × SYBR Premix Ex Taq(Takara, Japan)，采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)/907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)從土壤微生物DNA中擴增16S rRNA基因。qPCR反應體系為20.0 μl，包括10.0 μl的2 × SYBR Premix Ex Taq、上下游引物(20 pmol/μl)各0.3、1.0 μl樣品DNA模版(9.3 ~ 23.9 ng/μl)及8.4 μl滅菌超純水。反應程序為：94 ℃預變性，5 min；40個循環(huán)(94 ℃變性30 s；52 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s)，每循環(huán)結束后采集熒光數(shù)據(jù)；40輪擴增后，采用溶解曲線分析擴增產(chǎn)物的特異性，分析程序為：溫度從65 ℃上升到95 ℃，此期間每上升0.5 ℃便采集熒光數(shù)據(jù)。以含有細菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標準DNA模版，根據(jù)質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)計算該基因的拷貝數(shù)，分別以10倍梯度稀釋各模板制作標準曲線，其濃度范圍為9.61×102~ 9.61×108copies/μl。每個樣品3個技術重復，擴增效率為99.6%(2為0.992)，同時設置3個無模板樣品為陰性對照。

1.7 高通量測序分析

以提取的基因組DNA為模板，采用V4 ~ V5區(qū)引物(515F/907R)擴增16S rRNA基因以鑒定細菌群落組成及多樣性，高通量測序分析委托廣東美格基因科技有限公司采用Illumina Hiseq 2500平臺進行分析。利用Trimmomatic軟件對Raw Reads數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾，得到質(zhì)控后的pair-end clean reads，采用FLASH拼接Hiseq測序產(chǎn)生的pair-end數(shù)據(jù)，最小overlap長度設置為10 bp，拼接序列最大錯配比率為0.1，過濾后得到有效的拼接片段Clean Tags[18]。利用usearch軟件(http://www.drive5.com/usearch/)對所有Clean Tags進行聚類，默認以97% 的一致性將序列聚類成為OTU，在門(Phylum)水平上將相對豐度小于1% 細菌類群和無法分類的細菌類群合并在Others。進行Alpha-多樣性、Beta多樣性分析，其中Chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度，Shannon指數(shù)綜合考慮群落中物種的豐富度和均勻度。

1.8 數(shù)據(jù)處理

本研究采用SPSS 16.0(IBM, USA)進行數(shù)據(jù)分析，采用獨立樣本T檢驗分析比較同一水稻品種各處理間的顯著性差異；采用雙因素方差分析比較不同處理及不同品種水稻農(nóng)藝性狀、根際土壤理化性質(zhì)、根際土壤細菌微生物群落組成及結構的差異；采用Bray-Curtis距離及多變量統(tǒng)計學方法主坐標分析(PCoA，Principal coordinates Analysis)比較不同樣品間細菌群落結構差異。

2 結果與分析

2.1 Cu脅迫對水稻根際土壤理化性質(zhì)及水稻農(nóng)藝性狀的影響

Cu脅迫處理下水稻根際土壤理化性質(zhì)發(fā)生明顯改變(表1)。與Cu0處理相比，Cu100處理下水稻根際土壤全氮、銨態(tài)氮含量顯著降低，水稻根際土壤有效Cu含量顯著升高，MH水稻根際土壤氧化還原電位值顯著上升；但水稻根際土壤pH、總有機碳含量無顯著性差異。相同Cu脅迫處理下，HH及MH水稻根際土壤pH、全氮、總有機碳、銨態(tài)氮及有效Cu含量均無顯著性差異，但HH水稻根際土壤氧化還原電位顯著低于MH水稻。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤全氮、銨態(tài)氮含量僅受Cu脅迫顯著影響，根際土壤氧化還原電位值受水稻品種與Cu脅迫的交互影響顯著。可見，Cu脅迫改變了水稻根際土壤全氮、銨態(tài)氮含量及氧化還原電位值，而種植轉基因水稻僅降低了根際土壤氧化還原電位值。

表1 不同處理水稻根際土壤理化性質(zhì)

注：表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤(= 4)；同列不同小寫、大寫字母分別表示HH水稻和MH水稻各指標獨立樣本T檢驗結果顯著(< 0.05)；ND表示未檢測到Cu(II)；*和**分別代表在< 0.05和< 0.01水平影響顯著。

各處理水稻農(nóng)藝性狀顯著不同(圖1)。與Cu0處理相比，Cu100處理水稻株高、產(chǎn)量、生物量均顯著性降低。在Cu0處理下，移栽7周后HH水稻株高均顯著高于MH水稻，但HH與MH水稻成熟期生物量及產(chǎn)量無顯著差異；而Cu100處理下，HH與MH水稻株高、生物量及產(chǎn)量均無顯著差異。Cu脅迫下，兩種水稻各器官重金屬含量分布規(guī)律均為：根>莖>葉>籽粒(未檢測到)，無Cu脅迫處理水稻各器官中未檢測到Cu。HH水稻根部Cu含量顯著低于MH水稻，而葉中Cu含量顯著高于MH水稻。可見，Cu脅迫顯著降低了水稻株高、生物量及產(chǎn)量，品種對水稻生長影響較小；HH和MH水稻對Cu的吸收富集程度不同。

(圖中誤差線用標準誤表示，n = 4；圖1D中同一簇不同字母表示Cu脅迫下兩種水稻同一器官內(nèi)Cu含量具有顯著性差異，P < 0.05)

2.2 Cu脅迫對水稻根際土壤細菌群落豐度及Alpha-多樣性的影響

土壤16S rRNA基因數(shù)量可反映土壤中細菌群落豐度。HH-Cu0、MH-Cu0、HH-Cu100和MH-Cu100處理下水稻根際土壤細菌16S rRNA基因豐度分別為2.05 × 1010、1.80 × 1010、1.65 × 1010和1.95 × 1010拷貝數(shù)/g。不同含量Cu脅迫處理下，水稻根際土壤細菌群落豐度無顯著差異；同一處理下，HH與MH水稻根際土壤細菌群落豐度也無顯著差異。可見，Cu脅迫及水稻品種對水稻根際土壤細菌群落豐度無顯著影響。

細菌群落OTU數(shù)量的稀釋曲線能夠反映細菌群落的多樣性。Cu100處理下水稻Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)顯著低于Cu0處理，同一處理下，兩種水稻Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)無顯著性差異(圖2)。說明無Cu脅迫水稻根際土壤細菌群落多樣性、豐富度及均勻度顯著高于Cu脅迫處理水稻。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤細菌群落多樣性僅受Cu處理的顯著影響。可見，Cu脅迫沒有影響水稻根際土壤細菌豐度，但降低了細菌群落Alpha-多樣性；水稻品種對土壤微生物無顯著影響。

2.3 Cu脅迫對水稻根際土壤細菌群落組成及群落結構的影響

土壤16S rRNA基因在分類水平上的相對豐度能反映土壤中細菌群落結構和組成。本研究4個處理共獲取15個相對豐度高于1% 的門水平上的細菌類群(圖3)。各處理中Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)共5個優(yōu)勢細菌群落，占總細菌群落的70% 以上。其中Proteobacteria相對豐度最高，占總細菌群落的29.8% ~ 49.7%；Chloroflexi其次，占7.1% ~ 23.2%。與Cu0處理相比，Cu100處理下HH水稻Nitrospirae (硝化螺旋菌門)相對豐度顯著下降，根際土壤Bacteroidetes相對豐度顯著上升；與Cu0處理相比，Cu100處理下MH水稻根際土壤Actinobacteria相對豐度顯著下降，Bacteroidetes、OP11、TM7相對豐度顯著上升；同一處理下，兩種水稻根際土壤門水平上的細菌類群相對豐度無顯著差異。雙因素方差分析顯示，水稻根際土壤Actinobacteria、Bacteroidetes、Nitrospirae、OP11、TM7細菌門的相對豐度僅受Cu脅迫的顯著影響。上述結果表明，Cu脅迫并沒有改變水稻根際土壤中Proteobacteria、Chloroflexi、Acido-bacteria等類群的相對豐度，但改變了Actinobacteria、Bacteroidetes、Nitrospirae、OP11、TM7等類群的相對豐度。可見，Cu脅迫改變了水稻根際土壤細菌群落組成，且Cu脅迫下HH與MH水稻根際細菌群落相對豐度顯著改變的門類不同；相同重金屬處理下，水稻品種沒有影響細菌群落組成。

圖2 成熟期水稻根際土壤細菌群落豐富度和多樣性指數(shù)稀釋曲線

(右表顯示Cu脅迫處理和水稻品種對細菌各門類群相對豐度影響的雙因素方差分析結果，*和**分別代表在P < 0.05和P < 0.01水平影響顯著)

PCoA圖中每個點(樣品)間的空間距離表示細菌群落結構的差異程度(圖4)。其中，第1、2主坐標的方差貢獻率分別為22.92% 和8.25%。樣品在第1、2主坐標排序中分為兩類，HH-Cu0和MH-Cu0處理樣品明顯聚為一組，兩者的Bray-Curtis相似度指數(shù)為0.12(=0.63)；HH-Cu100和MH-Cu100處理樣品明顯聚為一組，兩者的Bray-Curtis相似度指數(shù)為0.18(=0.87)。這兩組樣品點顯著分開，其中HH-Cu0與HH-Cu100處理的Bray-Curtis相似度指數(shù)為1(< 0.05)，MH-Cu0與MH-Cu100處理的Bray-Curtis相似度指數(shù)為1(<0.05)，顯示Cu0與Cu100處理水稻根際土壤細菌群落結構差異顯著。而同一Cu脅迫處理下，兩種水稻根際土壤細菌群落結構相似。可見，Cu脅迫改變了水稻根際土壤細菌群落結構；相同重金屬處理下，水稻品種沒有影響根際土壤細菌群落結構。

(RAdonis代表非參數(shù)多因素方差分析(nonparametric MANOVA)指數(shù)，由基于Bray-Curtis距離計算而來；P值指示兩兩處理間的顯著差異)

3 討論

Cu是水稻生長必需的微量元素，它在蛋白質(zhì)構成、光合電子轉移、線粒體呼吸和細胞壁新陳代謝等方面起著重要作用，但過量的Cu會對水稻產(chǎn)生毒害作用。Cu脅迫對水稻的影響主要包括以下兩個方面：①Cu脅迫對水稻農(nóng)藝性狀的影響；②Cu脅迫對水稻根際土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落組成、結構及多樣性的影響。本研究以轉基因水稻華恢1號(HH)及其親本水稻明恢63(MH)為材料，根據(jù)我國土壤環(huán)境質(zhì)量標準中規(guī)定的二級農(nóng)田土壤Cu含量標準，添加100 mg/kg Cu(II)進行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)Cu脅迫改變了根際土壤理化性質(zhì)，降低了水稻農(nóng)藝性狀、根際土壤微生物多樣性、群落結構及組成，但HH和MH水稻上述指標無顯著差異。

3.1 Cu脅迫對水稻農(nóng)藝性狀的影響

本研究結果顯示Cu脅迫后，水稻株高、產(chǎn)量、生物量均顯著降低，且兩種水稻各器官重金屬含量分布規(guī)律均為：根>莖>葉>籽粒(未檢測到)。徐加寬等[19]研究表明，土壤Cu處理使水稻產(chǎn)量顯著低于對照，且隨著土壤Cu含量的提高水稻產(chǎn)量及生物量下降幅度顯著增大；與本研究不同的是，Cu含量100 mg/kg處理對水稻株高幾乎沒有影響。Yan等[2]研究發(fā)現(xiàn)，Cu含量100 mg/kg處理下幾種水稻的平均產(chǎn)量均顯著降低，且水稻產(chǎn)量與水稻穗數(shù)和每穗花穎數(shù)呈正相關；與本研究不同的是，其檢測到水稻籽粒中Cu含量顯著高于對照，但未超過綠色大米Cu含量限制(10 mg/kg)[20]，表明Cu含量100 mg/kg的水稻土不會通過食物鏈影響人類食物安全。顏士敏等[21]研究顯示，施加400 mg/kg Cu脅迫對不同品種水稻產(chǎn)量及結實率影響差異很大。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Cu含量100、300 ~ 500、1 000 mg/kg脅迫下，水稻產(chǎn)量分別下降10%、50%、90%，高濃度的Cu嚴重抑制了水稻的生長，且受Cu脅迫危害最大的水稻器官為根部；與本研究結果不同的是，其發(fā)現(xiàn)當Cu含量低于150 ~ 200 mg/kg時，水稻籽粒中Cu含量隨土壤Cu含量上升而升高。劉光榮等[23]研究顯示，Cu在水稻植株各部分的富集情況是：根>莖葉>籽粒，這與本研究結果相同。郭家文等[24]研究表明甘蔗根、莖、枯葉、梢頭對Cu的積累能力總體表現(xiàn)為根>莖>枯葉>梢頭。楊桂芬和李德波[25]的研究表明，高濃度Cu在水稻根部累積，會使水稻根系變粗，根毛變少，影響根系對養(yǎng)分的吸收，谷粒不飽滿，造成減產(chǎn)；水稻各器官Cu累積量隨土壤施Cu量的增加而增加，其分配規(guī)律為：根>莖葉>籽粒。轉基因植物由于外源基因的導入，對重金屬積累模式會有深遠的影響[26]。本研究中Cu脅迫降低了水稻的農(nóng)藝性狀，兩種水稻對Cu的吸收富集程度不同，其中HH水稻根部Cu含量顯著低于MH水稻，造成兩種水稻根部對Cu吸收富集程度差異的機制，及其是否與外源基因的轉入、根際土壤微環(huán)境不同有關等相關問題有待于進一步研究。

3.2 Cu脅迫對水稻根際土壤理化性質(zhì)、微生物群落組成及結構的影響

本研究結果顯示，Cu脅迫后MH水稻根際土壤氧化還原電位值顯著上升，根際土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化，這與Ben等[27]及Song等[28]的研究結果相似，Song等[28]認為這可能與海藻糖的凈化機制相關。徐家寬等[29]研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤Cu含量的增加，水稻拔節(jié)期、抽穗期和成熟期吸氮量均顯著下降，本研究中Cu脅迫后水稻根際土壤全氮含量顯著上升，是否與水稻受Cu脅迫后吸氮量降低相關？這有待進一步對水稻植株氮素吸收利用等問題進行論證。

本研究還發(fā)現(xiàn)Cu脅迫沒有影響水稻根際土壤細菌豐度。然而，王秀麗等[30]研究表明，冶煉廠周圍農(nóng)田土壤的全Cu含量隨離廠區(qū)距離的增加而漸降，土壤微生物生物量則隨離廠區(qū)距離的增加而增大；Ellis等[31]也報道，隨著土壤中全Cu含量的提高，土壤中的可培養(yǎng)微生物總量顯著減少，研究結果的差異可能與供試土壤、Cu脅迫濃度不同有關。本研究采用Illumina Hiseq高通量測序技術發(fā)現(xiàn)Cu脅迫降低了水稻根際土壤細菌多樣性，相似地，Mao等[32]通過向水稻根際土壤中添加Cu(II)脅迫，土壤中產(chǎn)甲烷菌及甲烷氧化菌群落多樣性和豐富度顯著降低；Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)在Cu、Zn冶煉廠周圍，土壤微生物多樣性隨重金屬濃度增加而降低；張雪晴[34]利用PCR- DGGE研究發(fā)現(xiàn)，隨著土壤Cu污染程度的加大，細菌群落豐富度及Shannon指數(shù)降低，細菌群落多樣性下降；Li等[35]利用T-RFLP技術研究Cu含量0 ~ 3 200 mg/kg 脅迫下土壤微生物群落組成及多樣性，其中Cu含量100 mg/kg脅迫下，土壤16S rRNA基因、氨氧化古菌和細菌群落數(shù)量顯著下降；微生物群落PCoA多樣性分析結果顯示，同一含量Cu脅迫樣品明顯聚為一組，且低Cu脅迫與高Cu脅迫樣品顯著分開，Cu脅迫改變了土壤微生物數(shù)量及多樣性。這些研究均表明，一定的Cu脅迫會降低土壤細菌群落多樣性。

本研究中，Cu脅迫改變了水稻根際土壤細菌群落組成及群落結構。Choudhary等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在Cu等重金屬的脅迫下，由于凈化機制，脯氨酸、丙二醛和超氧化物歧化酶含量上升，藻青菌(Cyanoba-cterium)的生長受到抑制。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)在距離Cu冶煉廠200 m處土壤磷酸酶活性明顯降低，通過PCR-DGGE分析證明重金屬影響土壤細菌及放線菌的群落結構。本研究Cu脅迫下，HH水稻根際土壤細菌中Nitrospirae(硝化螺旋菌門)相對豐度顯著下降，根際土壤Bacteroidetes(擬桿菌門)相對豐度顯著上升；MH水稻根際土壤Actinobacteria(放線菌門)相對豐度顯著下降，Bacteroidetes、OP11、TM7相對豐度顯著上升。謝家輝等[37]利用DGGE技術對采集的Cu礦污染土壤樣品進行微生物分子生態(tài)多樣性進行研究，表明不同重金屬濃度對微生物多樣性的影響不是簡單的線性關系，重金屬污染可能改變原有微生物群落內(nèi)種群間的關系，新的耐受菌種產(chǎn)生，而原優(yōu)勢種群失去優(yōu)勢作用。本研究中HH與MH水稻根際土壤細菌群落相對豐度顯著改變的門類不同，說明兩種水稻根際土壤內(nèi)Cu脅迫影響的優(yōu)勢種群不同，新的耐受菌種也不同，而造成這種差異的原因，及其是否與水稻品種、水稻根際土壤微環(huán)境的變化有關等問題還有待進一步研究。另外，土壤微生物的演變是長期且復雜的過程，Cu脅迫對抗蟲轉基因水稻根際土壤微生物的影響需要長期連續(xù)種植后進行驗證，且其影響機制也需要進一步探究。

4 結論

相比于不施加Cu脅迫對照，Cu脅迫顯著抑制了水稻株高、生物量及產(chǎn)量，降低了根際土壤細菌群落Alpha-多樣性，改變了水稻根際土壤細菌群落組成和群落結構；相比于親本非轉基因水稻，種植抗蟲轉基因水稻僅影響了水稻根際土壤氧化還原電位，改變了重金屬在水稻各器官的吸收富集程度。即Cu脅迫抑制了水稻農(nóng)藝性狀及根際土壤細菌群落，抗蟲轉基因水稻和親本非轉基因水稻在Cu脅迫抗性上無明顯差異。本研究可為抗蟲轉基因水稻生態(tài)安全評價提供實驗數(shù)據(jù)。

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Effects of Cu Stress on Rhizosphere Soil Microorganisms of Insect-resistant Transgenic Rice

WANG Xiaoxiao1,2, ZHONG Wenhui1, LI Lei1,2, HONG Xin1,2, LIU Biao3, HAN Cheng1*

(1 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Materials Cycling and Pollution Control, School of Geography Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 School of Environment, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 3 State Environmental Protection Key Laboratory of Biosafety, Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment of the People’s Republic of China, Nanjing 210042, China)

Soil environment and crop growth can be connected in rhizosphere soil, which is also the main indicator of the environmental safety assessment of the transgenic rice, but the effect of Cu stress on rhizosphere microorganisms of insect- resistant transgenic rice is still unclear. A pot experiment was conducted in this study and the Illumina Hiseq pyrosequencing technology was carried out to investigate the rhizosphere microbial community of insect-resistant transgenic rice Huahui1 (HH) and its non-transgenic parent line Minghui63 (MH) with or without 100 mg/kg Cu stress (abbreviated as Cu100 and Cu0, respectively). Results showed that Cu stress significantly reduced rice height, biomass and yield, and changed total N content, ammonium content and redox potential value in rice rhizosphere soil. Cu stress did not change the bacterial community abundance, but altered the composition and structure of bacterial community and decreased the Alpha-diversity of bacterial community. No effect on the rice growth and composition and structure of bacterial community was observed between HH and MH varieties with or without Cu stress. These findings indicate that Cu stress can suppress the agronomic traits of rice and the rhizosphere bacterial community, but planting insect-resistant transgenic rice does not change the resistance of rice and rhizosphere bacteria to Cu stress.

Cu stress; Bacterial community; Transgenic rice; Rhizosphere soil; Environmental safety

S154.3；Q938.1

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.01.017

王宵宵, 鐘文輝, 李磊, 等. 銅脅迫對抗蟲轉基因水稻根際土壤微生物的影響. 土壤, 2020, 52(1): 119–126.

農(nóng)業(yè)部轉基因生物新品種培育重大專項項目(2016ZX08012005)資助。

王宵宵(1994—)，女，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事土壤生態(tài)與環(huán)境微生物多樣性研究。E-mail：151302147@stu.njnu.edu.cn