肝細胞癌親環素J的表達及其作用

[摘要]目的 探討親環素J（CYPJ）在肝細胞癌（HCC）組織中的表達及其作用。方法 應用UALCAN和cBioPortal在線網站分析CYPJ在HCC中表達及其與臨床病理特征關系，并通過實時熒光定量PCR（qPCR）檢測40例HCC進行驗證。分析CYPJ在HCC中mRNA表達水平，并通過Kaplan-Meier生存曲線評估病人預后。將CYPJ-RNAi克隆入慢病毒載體（LV），并構建陰性對照（NC-LV），分別轉染SK-Hep1細胞，qPCR方法驗證轉染效率。用MTT法檢測不同感染復數（MOI）對SK-Hep1細胞生長的影響。結果 HCC組織中CYPJ mRNA表達高于癌旁正常組織（t=2.759，Plt;0.05），且與腫瘤病理分級有關（t=2.557，Plt;0.05）。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CYPJ mRNA高表達病人預后差（χ2=9.464，Plt;0.01）;通過沉默CYPJ基因表達可以抑制SK-Hep1細胞生長（t=3.231、8.976，Plt;0.01）。結論 CYPJ mRNA高表達在HCC生長過程中具有重要作用，并影響病人預后。

[關鍵詞] 癌，肝細胞;親環素J;細胞增殖;預后

[中圖分類號] R730.261 [文獻標志碼] A [文章編號] 2096-5532（2020）04-0404-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.080[HT]

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200417.0940.012.html;2020-04-18 16：48

EXPRESSION AND ROLE OF CYCLOPHILIN J IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA

GAO Honghong， WANG Jiahui， WANG Zhipeng， CHEN Jian

（Department of Oncology， the Affiliated Yantai Yuhuangding Hospital of Qingdao University， Yantai 264000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression and role of cyclophilin J （CYPJ） in hepatocellular carcinoma （HCC）. [WTHX]Methods UALCAN and cBioPortal online websites were used to analyze the expression of CYPJ in HCC and its association with clinicopathological features， and the results were verified by quantitative real-time PCR analysis of 40 patients with HCC. The mRNA expression of CYPJ in HCC was analyzed and the Kaplan-Meier survival curve was used to evaluate patients’ prognosis. CYPJ-RNAi was cloned into lentivirus vector （LV） and a negative control （NC-LV） was established， and then they were transfec-ted into SK-Hep1 cells， respectively. The transfection efficiency was verified by qPCR. MTT assay was used to observe the effect of multiplicity of infection （MOI） on the growth of SK-Hep1 cells. Results The expression of CYPJ in HCC tissue was significantly higher than that in adjacent normal tissue （t=2.759，Plt;0.05）， which was associated with the pathological grade of tumor （t=2.557，Plt;0.05）. The Kaplan-Meier survival curve analysis showed that the patients with high expression of CYPJ tended to have poor prognosis （χ2=9.464，Plt;0.01）. Silencing of the CYPJ gene inhibited the growth of SK-Hep1 cells （t=3.231，8.976;Plt;0.01）.Conclusion High expression of CYPJ plays an important role in HCC tumor growth and affects patients’ prognosis.

[KEY WORDS] carcinoma， hepatocellular; cyclophilin J; cell proliferation; prognosis

原發性肝癌死亡率在消化系統惡性腫瘤中位居第3位，其病理類型中以肝細胞型多見。在我國慢性病毒性肝炎是肝細胞癌（HCC）的主要危險因素，HCC發生是一個多步驟的過程[1]。基因測序技術揭示了許多遺傳變化，包括復發突變基因和信號通路失調[2]，這些都與肝癌的發生和發展有關。但是肝癌仍然是一種致命的疾病，術后復發率高，關于其預測、診斷、治療和預后監測仍有許多問題亟待解決[3]。親環素家族（CYPs）在生物界廣泛存在，其中親環素A（CYPA）是發現最早、研究最深入的一個家族成員[4]。相關的研究結果已表明，CYPA 在許多惡性腫瘤組織中高表達，并與腫瘤生長、轉移和耐藥等密切相關[5-6]。新環素J（CYPJ）為近期研究發現的新成員，又稱PPIL3，包括PPIL3a和PPIL3b 兩條可變的剪切體[7]。CYPJ與CYPA序列相似度約為50%[8]，參與免疫反應、細胞增殖和凋亡等過程[9-10]。然而，關于CYPJ在HCC的生物學功能尚不清楚。本實驗研究CYPJ在HCC中表達情況及其與病人臨床病理特征及預后的關系，并通過沉默CYPJ基因表達抑制SK-Hep1細胞生長，為評估病人預后和開發新的靶向藥物提供依據。

1 材料和方法

1.1 數據來源和分析

利用UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu）在線網站，通過輸入“PPIL3（CYPJ）”基因名稱，分析 TCGA 數據庫中HCC組織（371例）和癌旁正常組織（50例）中CYPJ mRNA表達情況，及其與臨床病理分級的關系。利用cBioPortal（http：//www.cbioprtal）在線網站，選擇 TCGA 數據庫中HCC，分析PPIL3表達情況與HCC病人預后的關系。

1.2 實驗樣本

HCC癌組織和癌旁正常組織樣本40對，均來自煙臺毓璜頂醫院腫瘤科2012年3月—2013年4月收治病人，入組前未接受放療或化療。其中37例HCC病人乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性，31例HCC病人有肝硬化。40例病人中男35例，女 5例;年齡40～71歲，平均（51.83±8.85）歲。電話隨訪，開始時間為病人確診時間，結束時間為病人死亡或隨訪截止時間（2018年4月）。SK-Hep1細胞購自ATCC細胞庫。本研究獲得了病人或其家屬的書面知情同意，并得到了我院倫理委員會的批準。

1.3 實驗材料

RPMI-1640 培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司產品）;Trizol試劑、逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）;MTT試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.4 構建慢病毒介導的CYPJ基因沉默

攜帶短發夾狀干擾RNA（shRNA）的慢病毒載體由上海吉凱基因化學技術有限公司構建，其正向序列為：gCTGGAAGAGGAGGCAACAG;其反向序列為：CTGTTGCCTCCTCTTCCAGc;接頭序列為：TTCAAGAGA。含有3′dUdU的小干擾RNA（siRNA）片段si-CYPJ（5′-CUGGAAGAGGAGGC-AACA-3′）和si-control（5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′）均由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，并用Blast進行序列對比，檢測結果顯示構建的si-CYPJ序列與其他CYPS的mRNA沒有顯著的同源性，連接病毒載體進行下一步實驗。

1.5 細胞培養與轉染

SK-Hep1細胞用25 cm×25 cm的培養瓶培養，置于37 ℃、含體積分數0.05 CO2的培養箱中，培養基為含體積分數0.01胎牛血清的RPMI-1640 5 mL。取對數生長期的SK-Hep1細胞，經消化、離心，以每孔2×105個細胞密度接種于6孔板中。隨機分為實驗組和對照組，待細胞生長至70%融合時按照慢病毒轉染試劑盒說明書進行轉染。實驗組轉入CYPJ表達干擾的慢病毒（CYPJ-RNAi-LV組），對照組轉入空載慢病毒（NC-LV組）。轉染完成后于培養箱中繼續培養，為后續實驗做準備。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測組織和細胞中CYPJ mRNA表達水平

取40對HCC癌組織和癌旁正常組織研磨，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，加入引物進行qPCR。引物及其序列見表1。PCR的最佳條件為：95 ℃預變性5 min，擴增40周期（95 ℃、50 s，63 ℃、1 min，72 ℃、30 s），以25 μL體積（內含SYBR Premix Ex 12.5 μL，TapⅡ1 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，7.5 μL dH2O）進行PCR反應。實驗重復 3 次，用2-△△Ct法計算HCC癌組織和癌旁正常組織中CYPJ mRNA相對表達量。

細胞轉染48 h后，收集CYPJ-RNAi-LV組和NC-LV組細胞，提取細胞總RNA，檢測各組CYPJ mRNA表達水平，實驗步驟同上。實驗重復3次。

1.7 MTT法檢測沉默CYPJ對SK-Hep1細胞增殖的影響

取對數生長期的SK-Hep1細胞接種于96孔板，分為CYPJ-RNAi-LV組和NC-LV組，每組設3個復孔。將病毒上清液分別加入到各組細胞中，感染復數（MOI）設置為0、0.2、2.0、20.0和200.0，孵育96 h后，各組細胞每孔加入MTT溶液20 μL（濃度為5 g/L），置于培養箱中培養4 h，然后每孔加入Formazan溶解液100 μL，混勻并使結晶溶解，在細胞培養箱內繼續孵育4 h。用酶聯免疫檢測儀檢測各孔570 nm波長處光密度（OD）值，繪制細胞生長曲線，以細胞增殖率（ODCYPJ-RNAi-LV組/ODNC-LV組×100%）表示細胞增殖情況。

1.8 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計數資料結果以[AKx-D]±s形式表示，組間比較采用t檢驗;采用Kaplan-Meier生存曲線進行生存分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HCC癌組織和癌旁正常組織中CYPJ mRNA表達水平比較

qPCR檢測結果顯示，40對HCC癌組織和癌旁正常組織中CYPJ mRNA的相對表達量分別為0.894±0.422、0.668±0.303，HCC癌組織中CYPJ mRNA表達高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（t=2.759，Plt;0.05）。該結果與TCGA 數據庫分析結果一致。見圖1。

2.2 HCC癌組織CYPJ mRNA表達與臨床病理特征關系

HCC癌組織中CYPJ mRNA相對表達量與病人性別、年齡、甲胎蛋白（AFP）、腫瘤大小、HBsAg、有無肝硬化和有無癌栓等無相關性（Pgt;0.05），而與臨床病理分級有關（t=2.557，Plt;0.05）。該結果與TCGA數據庫分析結果一致。見表2。

2.3 HCC病人CYPJ mRNA表達與預后關系

以CYPJ mRNA表達水平中位數0.754為截點，將HCC病人分為低表達組和高表達組，采用Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，低表達組和高表達組生存時間分別為（53.8±10.1）、（36.1±14.2）個月;中位生存時間分別為55.3、28.9個月，5年生存率分別為55.0%、22.5%。Log-rank檢驗顯示，低表達組病人的總生存時間（OS）較高表達組病人延長，兩組比較差異有顯著性（χ2=9.464，Plt;0.01），與cBioPortal在線網站分析結果一致。見圖2。

2.4 CYPJ-RNAi-LV與NC-LV組細胞CYPJ mRNA相對表達量比較

CYPJ-RNAi-LV組和NC-LV組細胞的CYPJ mRNA 相對表達量分別為0.414±0.047和0.846±0.542，兩組相比較差異有顯著意義（t=10.409，Plt;0.01）。

2.5 沉默CYPJ基因表達對SK-Hep1細胞生長的影響

MTT法檢測結果顯示，MOI為20.0、200.0時CYPJ-RNAi-LV組OD值明顯低于NC-LV組，差異有統計學意義（t=3.231、8.976，Plt;0.01）。沉默CYPJ基因表達可抑制SK-Hep1細胞增殖。見圖3。

3 討 論

HCC多起病隱匿，多數病人就診時已屬中晚期，術后復發和肝內外轉移是導致HCC預后不良的主要原因，因此需要早發現和早治療以提高治療效果[11]。導致HCC發生的危險因素有很多，包括肝炎病毒（HBV或HCV）感染、病毒性肝炎、乙醇性肝硬化以及非乙醇性脂肪性肝炎等[12]。據統計約有80%的HCC病人是HBV攜帶者，這表明HBV感染在肝癌的發生、發展中具有重要作用[13]。有研究結果顯示，早期HCC病人通過有效的治療5年生存率可顯著提高[14]。常用的腫瘤標志物為AFP，但其靈敏度和特異度較低[15]。隨著基因組學和蛋

白質組學等技術的應用，有望獲得特異性肝癌腫瘤標記物，為肝癌的早期發現提供依據[16]。CYPs家族具有肽基脯氨酰基順反式異構酶（PPlase）活性和分子伴侶功能，在多種疾病中發揮重要作用[17]。其中，CYPA參與病毒感染[18]、炎性疾病[19]和腫瘤形成[6]等病理過程。CYPA與環孢素A（Cs A）具有高度親合力[17]，二者在細胞內相互作用可以形成CYPA-Cs A復合物，該復合物可以阻斷絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）/p38信號通路的活化，從而抑制細胞的增殖[20]。另有研究發現，CYPA在非小細胞肺癌（NSCLC）中高表達，可以促進細胞增殖、侵襲和遷移，p38抑制劑SB 203580可以抑制細胞的遷移[21]。在治療晚期NSCLC病人時發現，Cs A與吉非替尼組合比單獨應用吉非替尼更有效[22]。ZHAO等[23]研究發現，含喹喔啉的ZX-J-19及其衍生物ZX-J-19j和ZX-J-19l可抑制PPIase活性，對腫瘤細胞生長有顯著的抑制作用，且效果比Cs A好。還有研究發現，HCC病人CYPA高表達與耐藥相關基因的表達及化療耐藥產生有關[24]。這些研究表明，CYPA在腫瘤發生、發展中具有重要作用，并與耐藥產生有關，而親環素抑制劑在治療腫瘤方面具有重要的意義。由于CYPA和CYPJ序列相似度高，可能在某些功能上極為相似，CYPJ在腫瘤發生發展中的作用值得探討。

在2005年，已有研究者通過基因芯片技術將CYPJ作為差異性基因，從腦膠質瘤組織中篩選出來[25]。另有研究通過對11項全基因組相關研究進行分析發現，CYPJ（2q33）可作為乳癌的風險基因，該研究結果有助于提高乳癌家族發病風險的預測[26]。PHILIPPE等[27]的研究結果顯示，親環素抑制劑（CRV431）可以抑制親環素PPlase的活性，從而抑制小鼠肝臟內的HBV DNA水平。HBV感染是HCC最常見的危險因素，這一研究結果為HCC治療帶來了啟示。GONG等[28]應用免疫組化實驗對120例胃癌組織和癌旁組織研究發現，CYPJ在胃癌組織中高表達，且與腫瘤分化程度有關，在腫瘤生長過程中具有重要作用。本研究通過UALCAN在線網站分析顯示CYPJ在HCC中高表達，與臨床病理分級有關，并通過qPCR實驗進一步驗證了數據庫分析的結果。有研究結果表明，在癌細胞中CYPJ與凋亡蛋白相互作用，影響其發揮作用，為研究凋亡蛋白在細胞中的定位機制提供了新的方向[29]。SELMANSBERGER等[30]在對核輻射后甲狀腺癌研究時發現，CLIP2參與細胞凋亡、MAPK信號傳導和遺傳不穩定性等致癌過程，且影響CYPJ的表達水平。本文研究結果顯示，通過沉默CYPJ基因的表達可以抑制SK-Hep1細胞的生長，證明了CYPJ可以促進癌細胞增殖，其具體作用機制有待下一步實驗。本研究結果還顯示，CYPJ基因高表達HCC病人預后差，結果與cBioPortal在線網站分析結果一致。其次，本文結果還顯示，沉默CYPJ基因表達可抑制SK-Hep1細胞增殖，并選擇高效率MOI為后續實驗做準備;CYPJ在腫瘤生長過程中具有重要作用，并影響病人預后。目前關于CYPJ在肝癌中作用研究較少，值得進一步研究。

總之，CYPJ基因在HCC癌組織中表達升高，并影響病人預后。沉默CYPJ基因表達可以抑制細胞增殖，其作用機制可能與MAPK/p38信號通路有關，有待下一步研究證實。CYPJ可能成為評估病人預后、開發新型抗癌藥物的潛在靶點。

[參考文獻]

[1]ISLAMI F， CHEN W， YU X Q， et al. Cancer deaths and cases attributable to lifestyle factors and infections in China， 2013[J]." Annals of Oncology， 2017，28（10）：2567-2574.

[2]NIU Zhaoshan， NIU Xiaojun， WANG Wenhong. Genetic alterations in hepatocellular carcinoma： an update[J]." World Journal of Gastroenterology， 2016，22（41）：9069-9095.

[3]WEN T F， JIN C， FACCIORUSSO A， et al. Multidisciplinary management of recurrent and metastatic hepatocellular carcinoma after resection：an international expert consensus[J]." Hepatobiliary Surgery and Nutrition， 2018，7（5）：353-371.

[4]FENG Wenhua， XIN Yan， XIAO Yuping， et al. Cyclophilin a enhances cell proliferation and xenografted tumor growth of early gastric cancer[J]." Digestive Diseases and Sciences， 2015，60（9）：2700-2711.

[5]QIAN Zhe， ZHAO Xiaoting， JIANG Mei， et al. Downregulation of cyclophilin A by siRNA diminishes non-small cell lung cancer cell growth and metastasis via the regulation of matrix metallopeptidase 9[J]." BMC Cancer， 2012，12：442.

[6]NIGRO P， POMPILIO G， CAPOGROSSI M C. Cyclophilin A： a key player for human disease[J]." Cell Death amp; Disease， 2013，4（10）：e888.

[7]ZHOU Z， YING K， DAI J， et al. Molecular cloning and cha-racterization of a novel peptidylprolyl isomerase （cyclophilin）-like gene （PPIL3） from human fetal brain[J]." Cytogenetics and Cell Genetics， 2001，92（3/4）：231-236.

[8]HUANG Lili， ZHAO Xuemei， HUANG Chaoqun， et al. Structure of recombinant human cyclophilin J， a novel member of the cyclophilin family[J]." Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography， 2005，61（Pt 3）：316-321.

[9]SHENG Chunjie， YAO Chen， WANG Ziyang， et al. Cyclophilin J limits inflammation through the blockage of ubiquitin chain sensing[J]." Nature Communications， 2018，9（1）：4381.

[10]CHEN J， LIEFKE R， JIANG L X， et al. Biochemical features of recombinant human cyclophilin J[J]." Anticancer Research， 2016，36（3）：1175-1180.

[11]CHEN W Q， ZHENG R S， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]." CA-A Cancer Journal for Clinicians， 2016，66（2）：115-132.

[12]HLADY R A， ROBERTSON K D. Genetic and epigenetic he-terogeneity in normal liver homeostasis and its implications for liver disease and hepatocellular cancer[J]." Seminars in Liver Disease， 2018，38（1）：41-50.

[13]LI Zhiqin， WANG Hongyan， ZENG Qinglei， et al. p65/miR-23a/CCL22 axis regulated regulatory T cells recruitment in hepatitis B virus positive hepatocellular carcinoma[J]." Cancer Medicine， 2020，9（2）：711-723.

[14]VILANA R， FORNER A， GARCA A， et al. Hepatocellular carcinoma： diagnosis， staging， and treatment strategy[J]." Radiologia， 2010，52（5）：385-398.

[15]WANG Ting， ZHANG Kunhe， HU Piaoping， et al. Combination of dual serum fluorescence， AFP and hepatic function tests is valuable to identify HCC in AFP-elevated liver diseases[J]." Oncotarget， 2017，8（58）：97758-97768.

[16]LI Bo， LI Boan， GUO Tongsheng， et al. The clinical values of serum markers in the early prediction of hepatocellular carcinoma[J]." BioMed Research International， 2017， 2017：5358615.

[17]DAVIS T L， WALKER J R， CAMPAGNA-SLATER V， et al. Structural and biochemical characterization of the human cyclophilin family of peptidyl-prolyl isomerases[J]." PLoS Bio-logy， 2010，8（7）：e1000439.

[18]KIM K， DAUPHIN A， KOMURLU S， et al. Cyclophilin a protects HIV-1 from restriction by human TRIM5α[J]." Nature Microbiology， 2019，4（12）：2044-2051.

[19]GARIMELLA V， MCVOY J S， OH Unsong. The contribution of cyclophilin A to immune-mediated central nervous system inflammation[J]." Journal of Neuroimmunology， 2020，339（339）：577118.

[20]BUKRINSKY M. Extracellular cyclophilins in health and di-sease[J]." Biochimica et Biophysica Acta， 2015，1850（10）：2087-2095.

[21]GUO Yinan， JIANG Mei， ZHAO Xiaoting， et al. Cyclophilin a promotes non-small cell lung cancer metastasis via p38 MAPK[J]." Thoracic Cancer， 2018，9（1）：120-128.

[22]SHOU Jiawei， YOU Liangkun， YAO Junlin， et al. Cyclosporine a sensitizes human non-small cell lung cancer cells to gefitinib through inhibition of STAT3[J]." Cancer Letters， 2016，379（1）：124-133.

[23]ZHAO Xuemei， XIA Chengcai， WANG Xiaodan， et al. Cyclophilin J PPIase inhibitors derived from 2，3-Quinoxaline-6 amine exhibit antitumor activity[J]." Frontiers in Pharmacology， 2018，9：126.

[24]CHEN Shuai， ZHANG Mingjun， MA Honghui， et al. Oligo-microarray analysis reveals the role of cyclophilin A in drug resistance[J]." Cancer Chemotherapy and Pharmacology， 2008，61（3）：459-469.

[25]QI Zhenyu， HUI Guozhen， LI Yao， et al. cDNA microarray in isolation of novel differentially expressed genes related to human glioma and clone of a novel full-length gene[J]." Chinese Medical Journal， 2005，118（10）：799-805.

[26]COUCH F J， KUCHENBAECKER K B， MICHAILIDOU K， et al. Identification of four novel susceptibility loci for oestrogen receptor negative breast cancer[J]." Nature Communications， 2016，7：11375.

[27]GALLAY P， URE D， BOBARDT M， et al. The cyclophilin inhibitor CRV431 inhibits liver HBV DNA and HBsAg in transgenic mice[J]." PLoS One， 2019，14（6）：e0217433.

[28]GONG Zhaohua， MU Yuling， CHEN Jian， et al. Expression and significance of cyclophilin J in primary gastric adenocarcinoma[J]." Anticancer Research， 2017，37（8）：4475-4481.

[29]HUO Dehua， YI Lina， YANG Jin′e. Interaction with Ppil3 leads to the cytoplasmic localization of apoptin in tumor cells[J]." Biochemical and Biophysical Research Communications， 2008，372（1）：14-18.

[30]SELMANSBERGER M， FEUCHTINGER A， ZURNADZHY L， et al. CLIP2 as radiation biomarker in papillary thyroid carcinoma[J]." Oncogene， 2015，34（30）：3917-3925.

（本文編輯 黃建鄉）

[收稿日期]2019-10-22; [修訂日期]2020-02-12

[基金項目]中華國際醫學交流基金會先聲抗腫瘤治療專項科研基金項目（Z20140615325）

[第一作者]高紅紅（1989-），女，碩士研究生。

[通信作者]陳劍（1973-），男，主任醫師，碩士生導師。E-mail：chenjianyt@163.com。