聚苯乙烯微塑料暴露對稀有鯽仔魚生長的影響

侯淼淼， 王春伶， 徐椿森， 3， 邱寧， 3， 夏治俊， 3， 蘇良霞， 3， 王劍偉*

(1. 大連海洋大學，遼寧大連116023； 2. 中國科學院水生生物研究所，武漢430072； 3. 中國科學院大學，北京100049)

塑料因具有防水、耐用、質輕、絕緣、抗腐蝕等諸多優點，在人類生產生活中得到廣泛使用。據統計，全球每年的塑料使用量不少于3×108t，但塑料制品在自然環境下難以降解，大量使用導致生態環境中的廢棄塑料或塑料制品越來越多。截止2014年，全球僅海洋表面漂浮的塑料垃圾超過2.5×105t(Eriksenetal.，2014)。環境中的塑料經過物理、化學或生物作用可分解為更小的塑料顆粒或碎片，加上直接排入環境中的微小塑料顆粒或碎片，造成了環境中嚴重的微塑料污染(Thompsonetal.，2004)。微塑料通常指尺寸在100 nm～5 mm的小塑料碎片，這一定義被多數人認同和采用(Law & Thompson，2014；丁劍楠等，2017；Toussaintetal.，2019)。調查結果表明，從南極到北極、從內陸到海洋、從水體到沉積物，皆能發現不同程度的微塑料污染(Ivar do Suletal.，2014；Wagner & Lambert，2017；徐向榮等，2018)，甚至在人體中也檢測到了微塑料的存在(van Cauwenberghe & Janssen，2014；Smith-Llera，2019)。

作為一類新型污染物，微塑料已受到國內外學者和公眾的高度關注，關于微塑料污染的研究已成為目前國際上的研究熱點之一(Koelmansetal.，2016；Toussaintetal.，2019)。近年來，有關微塑料來源、類型、分布以及對水生生物毒理學效應等方面的研究報道日益增多(Andrady，2011；丁劍楠等，2017；陳啟晴等，2018)。已有研究表明，微塑料能夠賦存于水生生物體內，并通過物理性損傷、載體效應(如增塑劑釋放、富集其他污染物等)、生物積累與食物鏈傳遞等途徑危害水生生物健康(Oliveiraetal.，2013；Wrightetal.，2013；Bateletal.，2016)，在個體水平(如攝食率、繁殖率、存活率、生長速率等)、組織水平(如炎癥反應、氧化損傷、脂肪空泡等)、細胞水平(如肝細胞壞死等)、基因水平(如內分泌干擾基因表達變化等)表現出毒性效應(von Moosetal.，2012；H?meretal.，2014；Rochmanetal.，2014；周倩等，2015)。但總體來看，關于微塑料本身對水生生物毒性效應的研究較少，魚類僅見于斑馬魚Daniorerio、青鳉Oryziaslatipes、挪威舌齒鱸Dicentrarchuslabrax等少數物種(Rochmanetal.，2013，2014；Mazuraisetal.，2015；Luetal.，2016；Leietal.，2018)，因此，亟需積累更多的魚類毒理學數據，進一步解析微塑料毒性作用機制，以期更準確評價環境中微塑料的生態風險。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.2 試驗方法

暴露試驗參照美國環境保護局的黑頭軟口鰷Pimephalespromelas仔魚7 d生長存活試驗(USEPA，2002)，試驗容器為500 mL圓形玻璃結晶皿，每個試驗容器放試驗液400 mL、初孵仔魚30尾，每個濃度設置3個平行，為暴露組，并設置空白對照組。結晶皿置于控溫的水浴中，實驗期間每天監測水溫。暴露期間每天10∶00和16∶00投喂新孵豐年蟲Artemianauplii無節幼體，每天更換90%以上的暴露溶液，換液前使用HACH水質分析儀(HQ30d，美國)隨機抽測3個結晶皿中的溶解氧。7 d后統計仔魚的存活率并將存活個體全部用100 mg·L-1中性MS-222麻醉后在解剖鏡下測量全長，從每個濃度組隨機選取3尾仔魚放置于熒光顯微鏡下拍攝帶熒光信號的照片，并使用ImageJ對熒光強度進行半定量分析。之后從每個結晶皿中隨機挑選10尾魚再進行7 d凈化試驗。凈化試驗中各濃度組更新溶液為與空白對照組相同的稀釋水，其他控制條件與7 d亞慢性毒性試驗期間相同。凈化7 d后從每個濃度組隨機挑選3尾仔魚用MS-222麻醉后置于熒光顯微鏡下觀察熒光微塑料的分布情況，拍攝照片并分析熒光強度。

參考他人關于微塑料環境濃度調查和微塑料對水生生物的毒性效應的相關研究(Zhaoetal.，2014；Luetal.，2016；涂燁楠，2018)設置濃度組，7 d亞慢性毒性試驗中暴露濃度分別為0.055 μg·L-1、0.55 μg·L-1、5.5 μg·L-1、55 μg·L-1、550 μg·L-1，采用血球計數板法實測微塑料濃度(豐度)。

1.3 數據統計與分析

采用SPSS Statistics 20進行數據分析。運用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Dunnett’s多重比較分析空白對照組與暴露組在存活率、全長等指標上的差異水平；采用獨立樣本t檢驗分析空白對照組與暴露組體內熒光強度的差異性；所有結果表示為-x±SD，當P<0.05時認為差異有統計學意義。使用ImageJ對熒光強度進行半定量分析，使用Origin 8.5及PhotoShop CS6作圖。

2 結果

2.1 PS微塑料對稀有鯽仔魚存活、生長的影響

2.2 PS微塑料在稀有鯽仔魚體內的累積和清除

暴露7 d后，除空白對照組外，各暴露組仔魚體內均發現熒光微塑料賦存(圖版Ⅰ：A、C、E)。微塑料主要存在于暴露組仔魚的鰓部和消化道，在身體其他部位或組織中未見。熒光半定量分析表明，熒光強度與暴露濃度正相關(圖1)，其回歸方程為：0.1 μm PS微塑料：y=8 819.9e0.820 5lgx(R2=0.970 3，P<0.05)；1 μm PS微塑料：y=3 448.9e1.024 2lgx(R2=0.900 1，P<0.05)；10 μm PS微塑料：y=7 373.7e0.639 6lgx(R2=0.825 3，P<0.05)。

凈化7 d后，各組仔魚體內PS微塑料均顯著減少(圖版 Ⅰ：B、D、F)，在0.055 μg·L-1、0.55 μg·L-1濃度暴露后，仔魚對3種粒徑微塑料的7 d清除率達到100%，其他3個較高濃度暴露后的清除率也在60%以上，但微塑料粒徑與暴露后清除效果關系并不明確(圖1)。

表1 3種粒徑聚苯乙烯微塑料暴露7 d后稀有鯽仔魚的存活率和全長Table 1 Survival rate and full length of Gobiocypris rarus larvae after exposure to3 sizes of polystyrene microplastics for 7 days

注： 同一列中具有不同字母表示差異有統計學意義(P<0.05)； 0.1 μm的微塑料顆粒在顯微鏡下難以計數， 此處為根據質量濃度換算的標稱豐度

Notes： Different letters in the same column indicate there is a significant difference (P<0.05); as it is difficult to count 0.1 μm microplastic particles under the microscope， the nominal abundance was calculated by mass concentration

3 討論

3.1 PS微塑料在稀有鯽初孵仔魚體內的攝入和清除

圖版Ⅰ 聚苯乙烯微塑料在稀有鯽仔魚體內的累積與清除Plate Ⅰ Accumulation and removal of polystyrene microplastics in Gobiocypris rarus larvae

1.空白對照組， 2～6. 0.055 μg·L-1濃度組， 0.55 μg·L-1濃度組， 5.5 μg·L-1濃度組， 55 μg·L-1濃度組， 550 μg·L-1濃度組； 聚苯乙烯(PS)微塑料暴露7 d后， PS微塑料粒徑： A. 0.1 μm， C. 1 μm， E. 10 μm； 凈化7 d后， PS微塑料粒徑： B. 0.1 μm， D. 1 μm， F. 10 μm

1. control group， 2-6. exposure concentration of 0.055 μg·L-1， 0.55 μg·L-1， 5.5 μg·L-1， 55 μg·L-1， 550 μg·L-1group； after exposed to polystyrene (PS) microplastics for 7 days， PS microplastic size： A. 0.1 μm， C. 1 μm， E. 10 μm； after exposed for 7 days and then purified for 7 days， PS microplastic size： B. 0.1 μm， D. 1 μm， F. 10 μm

3.2 PS微塑料對稀有鯽初孵仔魚的7 d亞慢性毒性效應

圖1 綠色熒光聚苯乙烯微塑料在稀有鯽仔魚體內的相對表達量(A、B、C)和清除率(D)Fig. 1 Relative expression (A， B， C) and purification rate (D) of green fluorescent polystyrene microplasticsin Gobiocypris rarus larvae