人工飼養條件下黃額閉殼龜的繁殖行為研究

曹鑫盛， 黃凱， 路斌， 潘建洲， 曹嘉慧， 張震， 陳成勛*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，南寧530004； 2. 天津農學院，水產學院，天津300384；3. 天津贊蘭科技有限公司，天津300384； 4. 廣西防城港東興市北投集團，廣西防城港538100)

黃額閉殼龜Cuoragalbinifrons屬地龜科Geoemydidae閉殼龜屬，在中國僅分布于廣西、海南(周婷，李丕鵬，2013)。相關研究表明，野外生境破碎化日益嚴重與猖獗的偷獵現象導致黃額閉殼龜野外種群逐漸衰亡(武正軍，李義明，2003；汪繼超等，2011)。黃額閉殼龜被國際自然保護聯盟(IUCN)、中國脊椎動物紅色名錄列為極危(CR)物種(蔣志剛等，2016；IUCN，2018)，同時被收錄入瀕危野生動植物國際貿易公約(CITES)附錄Ⅱ(曾巖，2011)。

面對野生資源逐漸枯竭的現實，對黃額閉殼龜的繁殖習性進行研究，不僅可以對該物種進行人工繁育，用于補充自然資源，維持野外種群基數，同時還能滿足寵物市場的需求，創造經濟價值。與野外資源枯竭及市場需求相對應的是目前國內外均無對人工養殖條件下黃額閉殼龜繁殖習性的研究報道，目前有記錄的人工孵化個體僅為野生待產種龜在人工暫養時繁殖并人工孵化而來，不能認為已成功對該物種進行人工繁殖。綜上所述，對人工養殖條件下黃額閉殼龜的繁殖行為進行研究，為該物種的人工保育及后續產業化發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

于2013年查閱相關資料，擬定研究方法，儲備飼養相關工具、材料，并建設試驗場所(2014年場地建設完畢)。2014年由廣西壯族自治區東興市專業養殖戶劉洪高、潘建洲協助引種黃額閉殼龜親龜7只，經過2014—2016年的預飼養，并改進、添加相關物資，2017—2019年正式開始對人工繁殖條件下黃額閉殼龜的繁殖行為進行研究。

選擇人工隔離飼養2年以上非待產黃額閉殼龜性成熟個體，共7只(5雌2雄)。分別使用150T型電子數顯卡尺(Meinaite)、DT2000型電子天平(美國雙杰)測定6個可量性狀(圖1)：腹甲寬(plastron width，PW)、腹甲長(plastron length，PL)、背甲寬(carapace width，CW)、背甲長(carapace length，CL)、體高(carapace height，CH)和體質量(weight，WT)；測定龜卵的5個可量性狀：卵長徑(L1)、卵短徑(L2)、卵殼質量(L3)、卵殼厚(L4)和卵質量(weight of egg，WE)，長度測量值精確至0.01 mm，質量測量值精確至0.01 g。

圖1 黃額閉殼龜背甲及腹甲形態指標測量Fig. 1 Measurement of the morphological indexof Cuora galbinifrons

1.體高， 2. 背甲長， 3. 背甲寬， 4. 腹甲寬， 5. 腹甲長

1. carapace height， 2. carapace length， 3. carapace width， 4. plastron width， 5. plastron length

1.2 飼養環境及方式

黃額閉殼龜養殖條件參照曹鑫盛等(2018)飼養繁殖鋸緣閉殼龜C.mouhotii的養殖環境進行設置，區別在于通風窗朝向東北，日常光照強度最高為11 000 lx。

黃額閉殼龜與鋸緣閉殼龜習性相近，生境與分布地區部分重疊(周婷，李丕鵬，2013)，因此，餌料配方及投喂方式均參考曹鑫盛等(2018)的方法，不同的是在12月轉移養殖區至SPX-450BE人工氣候培養箱(天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠)內，參照海南省五指山市(黃額閉殼龜野外生境)控制箱內溫濕度，光照時間7～9 h，光照強度250～400 lx。試驗中觀察到黃額閉殼龜喜好攝食綠化遮陽種植的紅薯Ipomoeabatatas，因此每日增加投放新鮮紅薯葉片供其采食，該飼養條件下親龜年均體質量增長率為6.37%，生長狀況良好。

1.3 繁殖及孵化

雄性黃額閉殼龜的領地意識極強，經常被觀察到相互攻擊現象，因此為避免雄性之間的相互爭斗造成損傷，同一時間雌性養殖區域僅有1只雄性；而雌性黃額閉殼龜有嚙噬同類龜卵的習性，在產卵前也會表現出較強的領地性，因此雌性在產卵前也單獨飼養。交配及求偶行為的記錄以李敏(2014)和魏玉峰(2015)中的方法為依據，通過H9W 4K高清紅外線相機(新佰)對養殖區內黃額閉殼龜進行24 h攝錄觀察并記錄。

黃額閉殼龜龜卵孵化方法參考曹鑫盛等(2018)，不同的是溫度設置為27 ℃±0.2 ℃，空氣相對濕度為85%±5%。

2 結果

2.1 親龜的可量性狀與繁殖

在試驗過程及對其他養殖戶的走訪過程中發現，黃額閉殼龜交配和繁殖行為的出現，不能僅以親龜的體質量為參考，還需要參考親龜的體型。

人工養殖條件下，對初次出現交配、繁殖行為的黃額閉殼龜進行研究(表1)。以其體質量為因變量，背甲長、背甲寬、腹甲長、腹甲寬、體高為自變量，進行多元回歸分析：WT=8.92CL+9.81CW+7.77PL-7.80PW-2.56CH-2 164.53(式1)(Multiple R=0.99，R Square=0.98，Adjusted R Square=0.89，標準誤差=46.37；n=7)。

表1 黃額閉殼龜親龜可量性狀Table 1 Measurable characteristics of Cuora galbinifrons

2.2 求偶及交配行為

2014—2016年人工養殖條件下，黃額閉殼龜非冬眠期間均可見交配行為，而2018年的交配高峰期為5—6月(占全年交配次數的41.94%)，交配成功率最高峰也在5—6月(50%)(表2)。黃額閉殼龜交配行為多發生在16∶00—18∶00，陰雨天氣(空氣濕度≥90%)時，交配次數顯著上升。雄性黃額閉殼龜在交配高峰期爭斗次數顯著上升，在水流噴濺刺激下外陰莖易伸出。雌性在交配期食欲上升，且偏愛高蛋白的鮮活餌料(如昆蟲、蚯蚓、螯蝦等)，遇刺激易發生后足撐地，泄殖孔擴張的行為，在此期間體質量輕微提高。

黃額閉殼龜的交配行為(表3)可在陸地或淺水中進行，交配行為依次為：

表2 2018年黃額閉殼龜交配及雄性爭斗行為記錄Table 2 Mating behavior and male fight behaviorrecord of Cuora galbinifrons in 2018

雄性：

感受：聞嗅到雌性的氣味，輕嚙口部發出“咔咔”聲，抬頭觀望、尋找雌性。

接近：看到雌性時，快速爬行接近雌性。

追逐：當雌性逃跑時，以快速爬行的方式追逐，并會從口部呼出大量氣體發出“呼呼”聲。

嗅探：接近雌性后，會環繞其爬行，并不時聞嗅雌性身軀多處。

爬跨：從后方爬上雌性背部并用前肢爪子緊抓雌性背甲邊緣。偶有發生從前端趴背雌性，出現兩龜朝向不一的現象。

制服雌性：調整體位，緊抓在雌性背甲邊緣，同時伸縮脖子咬嚙其頭部和頸盾，迫使雌性將頭部縮入殼內尾部更多的伸出殼外。同時尾基部緊貼雌性泄殖腔區域，觸探雌性泄殖孔。

攻擊：當雌性反抗交配時，會攻擊性地撕咬雌性的背甲邊緣和四肢，易對雌性造成傷害。

交配：制服雌性后，用前肢撐起身體的前半部，此時2只龜身體角度45～50°。同時移動后肢抓住雌性背甲邊緣，后伸出陰莖緊勾雌性尾部，并輔助下插入泄殖腔，偶有發生在陰莖插入后雄性向后仰倒。

雌性：

逃離：當雄性朝自己移動或發生接觸時或反抗交配后，迅速遠離雄性。

反抗交配：當雄性移動到身邊或爬到背上時，試圖逃跑或攻擊性地撕咬雄性，強烈地掙扎、爬行，將雄性甩離，不接受交配。

接受交配：當雄性移動到身邊或爬到背上時，保持安靜，無逃離或反抗，偶有輕微掙扎(不影響正常的交配行為)，泄殖孔擴張，接受雄性的求偶。

2.3 產卵行為

人工養殖條件下，雌性黃額閉殼龜每年產卵1次，每次1～2枚，全年最大產卵量2枚，產卵高峰期在6—7月，在產卵前1～10 d會表現出明顯的食欲下降，但均未發現食物廢絕的現象。黃額閉殼龜的2次繁殖間隔積溫為197 230～207 955 ℃·h(n=5)，產卵前表現出極強的攻擊性，排斥周圍的所有同類，產卵時用后腿挖掘3～4 cm的坑穴，埋藏深度為0.5～1 cm(n=5)。產卵行為持續時間為 107～237 min(n=5)，雖未表現出顯著的天氣傾向性，但表現出了明顯的時間傾向性(10∶00—18∶00)。黃額閉殼龜在產卵后當天即攝食，產卵后的1～15 d攝食欲望顯著增加，攻擊性增加的現象消失。

表3 黃額閉殼龜求偶交配行為的持續時間Table 3 Courtship and mating duration ofCuora galbinifrons

人工養殖條件下，黃額閉殼龜的產卵行為(表4)完全在陸地進行，產卵過程依次為：

觀察：雌性在產卵前伸長頸部四處觀望、搜索適宜的產卵區域。優先選擇光照強度低(200 lx以下)的松軟區域，用前腿挖掘并聞嗅該區域(該過程不會使用后腿挖掘產卵區)。

驅散：雌性停止嗅探，匍匐于產卵區域觀察四周，并通過啃咬和撞擊將產卵區直徑0.5 m內的其他動物，尤其是同類驅離該范圍。

營巢：雌性使用后腿在產卵區挖掘出3～4 cm的坑穴，尾部下垂朝向坑穴內準備產卵(此過程中雌性頸部無持續性前伸，泄殖孔未出現擴張)。如受到驚嚇，雌性大概率會放棄該產卵區。

產卵：雌性頸部持續前伸，泄殖孔反復收縮、擴張，在巢穴內產出1～2枚龜卵，龜卵表面有黏液，此階段對外界刺激不敏感。

掩埋：產卵后，雌性泄殖孔收縮，后腿快速挖掘泥土掩埋龜卵，掩埋后雌性常見呆立于原地休憩，體能恢復后離開，試驗對象均未表現出護巢習性。

表4 黃額閉殼龜產卵行為的持續時間Table 4 Spawning behavior duration of Cuora galbinifrons

2.4 龜卵形態及孵化

2016年3號、4號黃額閉殼龜分別產出3枚龜卵，其中受精卵2枚，沿用鋸緣閉殼龜人工飼養條件下的孵化方法(溫度28 ℃±0.2 ℃，相對濕度85%±5%)進行孵化(曹鑫盛等，2018)，發育至37 d時，卵內胚胎全部死亡。參考與黃額閉殼龜野外棲息地重疊的鋸緣閉殼龜卵的自然孵化溫度(22～28 ℃)(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)，在正式試驗時使用恒溫27 ℃±0.2 ℃孵化黃額閉殼龜卵。

2017—2019年的正式試驗中共獲得黃額閉殼龜卵9枚，其中受精卵5枚，平均受精率55.56%(表5)。龜卵為硬殼卵，長徑39.78～51.36 mm，短徑26.93～31.13 mm，卵質量22.78～32.09 g，卵殼厚0.57～0.63 mm。

共孵化黃額閉殼龜稚龜3只，總孵化率60.00%，孵化周期為118～136 d，孵化積溫為76 464～88 128 ℃·h，1日齡稚龜體質量為17.92～21.46 g(表6)。1日齡稚龜背甲長57.14～62.21 mm，背甲寬36.67～38.69 mm(圖2)。

表5 黃額閉殼龜產卵與孵化情況Table 5 Circumstances of the eggs and incubationof Cuora galbinifrons

表6 黃額閉殼龜受精卵孵化數據Table 6 Eggs incubation data of Cuora galbinifrons

3 討論

3.1 人工養殖條件下黃額閉殼龜可量性狀應用

本地林業局曾向筆者提出“近年來常有走私者使用‘野生動物馴養繁殖許可證’作為掩護，有關部門對查獲的黃額閉殼龜是否為野生個體進行判別時存在較高的難度”相關問題。本試驗階段對越南分布的黃額閉殼龜進行野外調查，共測量、記錄野生性成熟黃額閉殼龜個體12只，代入式1計算。野生黃額閉殼龜的實際W值均小于計算結果，且差異有高度統計學意義(P<0.01)。這或許與野生動物在人工圈養后食物的充裕、營養充足以及運動消耗量降低，會在養殖初期內出現體質量顯著增長后逐漸趨于平穩的過程(馬澤芳，2004)有關。

圖2 黃額閉殼龜卵及稚龜形態Fig. 2 The morphological characteristics ofCuora galbinifrons’s eggs and juveniles

a、b. 龜卵； c. 破殼中的稚龜； d. 1日齡的稚龜

a， b. eggs； c. turtles that are hatching； d. 1-day old turtle

試驗中發現，當黃額閉殼龜在消化道感染變形蟲、細菌性腸炎等疾病時，也會出現短時間內體質量顯著降低的現象。而雌性在產卵前則會出現短時間內體質量顯著上升的現象。其可量性狀回歸方程或可用于對成熟親龜健康狀況和發育狀況的判定。但本試驗樣本數較少，后續將對更多不同性別、生長階段的個體可量性狀進行更深入的研究，為人工養殖條件下黃額閉殼龜健康狀況、生長及營養狀況的判定提供參考。

3.2 黃額閉殼龜卵受精率與孵化

相關研究表明，動物的受精率(受孕率)受到交配溫度(陳紹孟等，2012)和交配頻率(高富友，2008)的影響，過高的溫度和交配頻率將使動物的受精率(受孕率)降低。在試驗結果中，人工養殖條件下黃額閉殼龜卵受精率僅為55.56%，顯著低于人工養殖條件下其他閉殼龜類的受精率(李貴生，唐大由，2002；楊治國，2005；曹鑫盛等，2018)。結合野外種群分布數據(汪繼超等，2011)與溫度數據(Fischeretal.，2010；李敏，2014)，分析其野外相遇、交配概率、交配溫度，為獲得更高的龜卵受精率，或可適當降低黃額閉殼龜交配強度及養殖環境溫度。

同時針對黃額閉殼龜孵化率不理想的現象，我們了解到黃額閉殼龜產地海南吊羅山保護區，龜卵孵化期營巢地溫度為18.5～24 ℃，平均溫度20.7 ℃，溫度波動5.5 ℃(Fischeretal.，2010；Wangetal.，2011)。該孵化溫度區間與其他同屬龜類的孵化條件(22～28 ℃)差異較大(李貴生，唐大由，2002；楊治國，2005)，試驗中未敢貿然采用該溫度。因此，黃額閉殼龜受精卵的最適發育溫度也將是后續研究的方向。

本試驗在參照黃額閉殼龜的人工養殖方法的基礎上，首次于全人工條件下連續3年成功繁殖、孵化出子一代個體，平均受精率、孵化率分別為55.56%、60.00%。雖然成功突破了黃額閉殼龜的繁殖方法，但是較低的受精率、孵化率仍是目前制約其人工繁殖、保育的關鍵因素。后續我們將對黃額閉殼龜受精率、孵化率低下等原因進行深入研究，為這種瀕臨滅絕動物的保護提供有力的幫助。