食品中羊肉源性成分微滴數字PCR定量方法的建立

陳傳君，金鷺，林華，胡濱*，韓國全*，陳世界，張婧，安微，楊苗

1(四川農業大學 食品學院，四川 雅安，625000)2(成都海關，四川 成都，610041)3(食品安全檢測四川省重點實驗室，四川 成都，610041)

肉及肉制品的摻假事件是國內外廣泛關注的食品安全問題之一。肉類摻假不僅嚴重干擾肉類市場流通，侵害消費者權益，而且還影響消費者的健康甚至宗教信仰[1]。羊肉產品沒有文化和宗教禁忌，因其具有肉質細嫩、味道鮮美，同時又營養豐富而備受消費者青睞。利用價格低廉的原料肉如鴨肉、豬肉、老鼠肉制造假羊肉，已是屢見報道[2]。因此，檢測肉制品中羊源性成分含量的方法具有重要意義。

目前，針對肉源性成分的檢驗方法主要有電子鼻法、紅外光譜法、酶聯免疫吸附法、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)法等，其中實時熒光定量PCR法(real-time quantitative PCR，qPCR)的應用較為廣泛[3]。但qPCR技術通過Ct值和標準曲線對起始模板只能達到相對定量分析，其檢測靈敏度和準確性還達不到精細定量要求[4]。目前我國行業標準采用實時熒光PCR定性檢測肉品中某種動物源性成分，但不能精確定量檢測樣品中所含有的肉源性成分含量，這使得在肉品摻假檢測過程中，很難判定是故意摻假，還是生產或取樣過程中意外污染所致[5]。因此，數字PCR(digital PCR，dPCR)作為一種對核酸進行精確定量的全新方法應運而生，因為其高通量、高靈敏度、高特異性被廣泛運用于生物學、醫學和食品科學等領域。dPCR可以分為3種類型，即微孔板數字PCR法、微流控芯片數字PCR 法和微滴數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)法。其中ddPCR法是利用油包水技術將其分割為數萬個納升級大小的微滴，每一個微滴都是一個獨立的PCR反應體系，當PCR擴增完成后，利用微滴分析儀逐個對每個微滴進行檢測。再根據統計學中的泊松分布原理分析陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度，從而實現對低至單個拷貝核酸分子的絕對定量[6]。REN等[7]通過將ddPCR法與rPCR法應用于檢測綿羊和山羊肉制品中的雞源性成分，研究表明ddPCR法在不同熱處理和超高的溫度下具有良好重復性和穩定性，明顯優于qPCR法。因此，對于食品源性成分的鑒定來說，ddPCR在定性和定量檢測方面都具有明顯的優勢。但是，ddPCR應用于肉源性成分定量檢測的難點在于如何將PCR擴增得到的基因拷貝數轉換成肉的質量。如CAI等[8]利用ddPCR方法檢測肉制品中豬肉和雞肉質量時，發現生肉質量與DNA質量以及DNA質量和DNA拷貝數之間呈線性關系，能夠根據DNA拷貝數建立計算生肉質量的公式。NOH等[9]采用ddPCR技術對海產品中阿拉斯加鱈魚的含量進行測定，通過確立原始樣品質量、DNA濃度和DNA拷貝數之間的線性關系，建立了基于DNA拷貝數的樣本質量計算公式。由于該方法需要建立2組標準曲線進行兩步轉化，實驗步驟增加，容易導致實驗誤差加大。因此，如何將基因拷貝數轉換成肉的質量是值得深入研究的問題。

目前在有關肉品摻假檢測報道中，多是檢測某類肉中容易摻假的其他肉類，如在羊肉及其制品中檢測摻入的鴨肉含量，但市售摻假肉中多為2種或2種以上肉類的摻雜混合，這就給定量檢測帶來困難。由于直接對肉品中羊肉ddPCR精準定量的報道較少，因此本研究將通過向樣品中添加牛肉作為內標，采用ddPCR對羊肉的單拷貝基因進行定量檢測，根據基因拷貝數建立食品中羊肉源性成分ddPCR的定量檢測方法，以便為摻假肉的監督管理提供一些技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料與試劑

主要樣品：山羊肉、綿羊肉、鴨肉、水牛肉、黃牛肉、牦牛肉、豬肉、鹿肉、狐貍肉、貂肉、兔肉、雞肉、鵝肉、鴿肉、火雞肉、鱈魚、大黃魚、虹鱒魚、銀鱈魚、大菱鲆，以上樣品均由四川出入境檢驗檢疫局提供，-70 ℃保存。

Premix Ex Taq(probe qPCR)預混液，TaKaRa公司；蛋白酶K(20 mg/mL)，拓樣生物有限公司；Droplet Generator DG8 CartndgeDroplet Gene rator，BIO-RAD公司；ddPCR Supermix for Probes (no dutp)，BIO-RAD公司；ddPCR Droplet Generation Oil，BIO-RAD公司；DG8 GasketPierceable Foil Heat Seal，BIO-RAD公司。

1.1.2 儀器與設備

FastPrep樣品研磨器，印度MP公司；Thermomixer Comfort恒溫混勻儀，德國eppendorf公司；X3R高速冷凍離心機，Thermo公司；CFX96 Real-time PCR 儀，Bio-Rad公司；QX100 Droplet Digital PCR系統，BIO-RAD公司；

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

取新鮮羊肉樣品的肌肉組織，絞肉機絞碎后于100 ℃烘干至恒重。在研缽中加入液氮，將烘干樣品研磨至粉末狀，室溫條件下保存于干燥皿中。準確稱取處理后的肉粉100 mg，采用實驗室自制的動物組織基因組磁珠法提取試劑盒進行DNA提取，所得基因組DNA質量通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀評價[10]。

1.2.2 羊肉、牛肉源性引物探針篩選設計

1.2.2.1 引物探針的選擇與設計

分別選定羊、牛的單拷貝生長激素基因GH(序列號分別為NC-019468、NC-000077)設計引物探針，再根據NCBI等網站中公布的不同物種間各基因序列進行序列比對，設計的引物探針委托成都擎科梓熙生物技術有限公司進行合成。

1.2.2.2 特異性驗證

分別提取山羊、綿羊、水牛、黃牛、牦牛、豬、鹿、狐貍、鵝、兔、鴿、鱈魚、大黃魚、鴨、火雞、虹鱒魚、貂、雞、銀鱈魚、多寶魚等動物肌肉DNA作為模板，分別對所設計篩選的羊源性、牛源性引物進行特異性驗證。同時設立用ddH2O代替核酸的1個陰性對照驗證其對引物的特異性。當陰性對照為陰性時整個試驗有效，可進一步判定結果。實驗重復3次，每次2個平行。

1.2.2.3 靈敏度驗證

將提取的羊肉、牛肉DNA模板分別按梯度進行稀釋，均稀釋至濃度為100、 10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，進行qPCR擴增，實驗重復3次，每個梯度2個平行，驗證該方法靈敏度。

1.2.3 ddPCR定量方法的建立

1.2.3.1 ddPCR操作步驟

具體程序與步驟為：將各物種的反應體系轉移至微滴生成卡中，并在反應用油加樣孔加入70 μL的微滴成專用油；加樣完成后，將微滴生成卡轉移至微滴生成器中進行微滴的生成；將生成微滴后的40 μL反應體系轉移至96孔板中并封膜進行擴增，PCR擴增程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，50個循環；98 ℃加熱10 min使酶滅活。擴增結束后，將96孔板取出，置于Droplet reader微滴讀取儀中進行微滴熒光讀取；采用FAM/VIC雙通道熒光采集微滴信號，并通過分析熱點圖確定熒光閾值限以確定陰性微滴和陽性微滴。

以提取的羊DNA(約50 ng/μL)為模板，用ddPCR擴增后的拷貝數確定羊源性特異性基因引物和探針最優濃度，以及最佳退火溫度。最后用微滴分析儀對擴增產物進行計數分析，最終以平均值確定羊肉核酸標準品的基因拷貝數。通過比較ddPCR微滴生成數，微滴分布狀態、微滴熒光信號強度等來確定優化的結果。

1.2.3.2 ddPCR反應體系和程序

ddPCR擴增體系為：ddPCRTMSupermix for probes，10 μL；上游引物(10 p)，1.8 μL；下游引物(10 p)，1.8 μL；探針(10 p)，0.5 μL；模板(50 ng/μL)，2.0 μL；ddH2O，3.9 μL。

ddPCR擴增程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，50個循環；98 ℃加熱10 min使酶滅活，擴增結束。

1.2.3.3 羊、牛源性引物探針的ddPCR特異性驗證

以提取的羊肉基因組DNA為研究對象，牛、豬、驢、馬、狐貍、兔DNA為對照模板進行ddPCR擴增，驗證引物探針的ddPCR特異性，同時設置陰性對照孔。

以提取的?；蚪MDNA為研究對象，山羊、驢、豬、鹿、貂、鴨肉的DNA為對照模板進行ddPCR擴增，驗證引物探針的ddPCR特異性，同時設置陰性對照孔。

反應程序及反應體系參照1.2.2.2。

1.2.3.4 ddPCR反應條件的優化

ddPCR體系中羊、牛源性引物濃度優化：羊、牛源性引物的ddPCR體系的引物濃度優化處理方式相同，PCR反應體系20 μL：ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，上、下游引物各1μL，設置上下游引物摩爾濃度0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μmol/L，加入探針0.5 μL(0.4 μmol/L)，DNA模板2 μL，加ddH2O補足20 μL體積。在體系充分混勻后加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，油包水微滴生成按照說明書進行。將生成的微滴全部轉入96孔PCR反應板中，進行擴增。擴增條件確定為：預變性95 ℃，10 min；變性94 ℃，30 s；60 ℃，1 min，40個循環；固化微滴98 ℃，10 min。

ddPCR體系中羊、牛源性探針濃度優化：羊、牛源性引物的ddPCR體系的引物濃度優化處理方式一致，PCR反應體系20 μL：ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，上、下游引物各1 μL(0.9 μmol/L)，探針0.5 μL，設置探針摩爾濃度梯度為100、150、200、250、300 nmol/L，DNA模板2 μL，加ddH2O補足20 μL體積。應在體系充分混勻后加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，油包水微滴生成按照說明書進行。將生成的微滴全部轉入96孔PCR反應板中，進行擴增。擴增條件確定為：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火延伸1 min，40個循環；固化微滴98 ℃，10 min。

ddPCR體系中羊、牛源性引物退火溫度優化:羊、牛源性引物的ddPCR反應程序的退火溫度優化處理方式一致，設置退火溫度為58、59、60、61、62、63、64和65 ℃等8個梯度，最后通過比較分析ddPCR的拷貝數和微滴情況來分別確定羊和牛源性特異性引物ddPCR最佳退火溫度。每個樣品每個處理做2個平行。

ddPCR靈敏度驗證:將提取的羊肉DNA 模板進行10倍梯度稀釋，分別稀釋至濃度為10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，進行ddPCR靈敏度的驗證。ddPCR實驗重復3次，每次2個平行。

ddPCR定量方法的建立:肉的質量與樣品DNA溶液中的基因的拷貝數及單位質量的基因拷貝數有關，如公式(1)所示：

Q=M×C

(1)

式中：M，肉的質量；Q，基因拷貝數；C，單位質量肉的基因拷貝數)

不同肉種的質量比按公式(2)計算：

(2)

由于進行固定條件下干燥處理，同一肉種的細胞密度和基因組大小是固定的，因此，Cb/Ca為常數命名為k，只要測得基因拷貝數，即可獲得2組分比例[11]。

以羊肉作為研究對象，將羊肉與鴨肉、豬肉按表1配制成含有1%、4%、10%、30%、50%、60%和95%羊肉成分和10 mg內標牛肉的混合樣品(共110 mg干物質)，分別取5.5 mg干物質提取DNA，進行ddPCR檢測，分別測得羊源性成分和內標牛源性成分基因拷貝數，計算K值和相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)，構建質量與拷貝數的數學關系。每個樣品重復3次，每次2個平行，相關系數R2的計算用Excel自動生成。

1.2.4 定量方法靈敏度驗證

為驗證ddPCR內標定量方法的靈敏度，將羊肉干物質分別按0.5%、0.25%、0.01%與鴨肉、豬肉的干物質混合后加10%內標物質牛肉干物質，進行混合后提取DNA，并對羊源性成分及內標牛源性成分進行雙重ddPCR檢測。具體混合比例見表2。

1.2.5 定量線性范圍和方法的重復性和準確性驗證

針對檢測體系，按照表3制備不同摻假含量和不同摻假種類的模擬混合樣品，提取 DNA后進行ddPCR定量檢測，測得的羊與內標拷貝數帶入公式(1)計算，得出羊的質量。實驗重復3次，每次2個平行。

表1 ddPCR定量方法的建立中各肉樣混合比例

注：“/”表示不含該成分(下同)

表2 ddPCR內標定量方法實際靈敏度驗證的樣品混合比例

表3 模擬混合樣品的混合比例(內標法)

1.2.6 ddPCR檢測市售樣品羊源性成分的含量

為了驗證所建立的ddPCR定量方法在實際羊肉樣品檢測中的可行性，以2018～2019年成都海關技術中心動檢實驗室保存的四川省內隨機抽取的28個羊肉及其制品作為檢測對象，樣品主要來源于超市及農貿市場，包括13個羊肉片(卷)、8個羊肉串、7個羊肉樣品。準確稱取經前處理干燥后的1 g待檢樣品，加入100 mg內標干物質混合均勻后，取7 mg進行DNA提取，采用現行定性檢測標準SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測方法進行定性檢測，檢測結果顯示為陽性的樣品再利用建立的ddPCR內標定量方法進行定量檢測，進一步驗證所建方法的準確性和應用能力。

2 結果與分析

2.1 羊、牛源性引物探針篩選設計

2.1.1 單拷貝基因的篩選

參考相關文獻，并查詢NCBI上基因的相關信息，確定以生長激素基因(GH)為目的基因，分別進行羊、牛源性引物探針的設計，羊肉、牛肉的GH基因在染色體上的位置及數量分別如圖1所示。

2.1.2 不同物種GH基因序列比對

利用序列分析軟件DNA Man6.0 對山羊、綿羊、水牛、瘤牛、黃牛的生長激素基因序列進行比對分析，選取羊的特異性保守區域進行引物探針的設計，各物種序列比對結果如圖2所示。

圖1 羊肉、牛肉的單拷貝GH基因

圖2 羊與其他物種GH基因序列比對

利用序列分析軟件DNA Man6.0 對水牛、瘤牛、黃牛、牦牛、山羊、綿羊的生長激素基因序列進行比對分析，選取牛的特異性保守區域進行引物探針的設計，各物種序列比對結果如圖3所示。

圖3 牛肉與其他物種GH基因序列比對

2.1.3 引物探針的設計

利用軟件Oligo 6.0、DNAMan對牛的引物探針進行設計與分析，表4、表5分別是設計的羊源性引物探針和牛源性引物探針的基本信息。

表6和表7分別為設計的羊、牛源性GH基因引物探針的序列。合成的引物進行PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后對產物進行測序，測序結果進行Blast同源性數據庫比對后結果顯示同源性均在96%以上。

2.2 gPCR驗證引物探針特異性

2.2.1 羊源性引物探針特異性驗證

由圖4可以看出，在引物特異性實驗中，只有綿羊和山羊的DNA檢測到了擴增信號，平均Ct值分別為24.93和25.77，未出現非特異性擴增，說明所設計引物的特異性良好，能同時對綿羊和山羊成分進行檢測。

表4 羊源性引物探針基本信息

表5 牛源性引物探針基本信息

表6 羊GH基因引物探針序列

表7 牛肉的GH基因引物探針序列

圖4 羊源性引物探針qPCR特異性驗證

2.2.2 牛源性引物探針特異性驗證

由圖5可以看出，牛源性引物的特異性實驗中，只有水牛、黃牛和牦牛的DNA檢測到了擴增信號，平均Ct值分別為26.63、28.05和30.89，未出現非特異性擴增，說明所設計的引物特異性良好且能同時對水牛、黃牛和牦牛成分進行檢測。

圖5 牛源性引物探針qPCR特異性

2.3 ddPCR驗證羊、牛源性引物探針特異性

羊肉和牛肉DNA的ddPCR擴增結果分別如圖6、圖7所示，空白對照未出現擴增，說明體系未污染，且每個樣品生成微滴數均大于12 000個，符合泊松分布計算需要。羊引物探針特異性良好，只擴增出羊DNA，其他非目標物種肉樣均沒有出現擴增；牛源性引物探針特異性良好，只有牛DNA發生擴增，未出現非特異性擴增。表明該ddPCR鑒別體系特異性良好，2對引物均可用于后續ddPCR定性和定量檢測。

圖6 羊源性引物探針ddPCR特異性

圖7 牛源性引物探針ddPCR特異性

2.4 ddPCR反應條件優化

ddPCR反應條件的優化結果為：20 μL反應體系中引物體系終摩爾濃度0.9 μmol/L，探針體系終摩爾濃度0.25 μmol/L，ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，DNA模板2 μL，最后用ddH2O補足至20 μL。反應程序最佳退火溫度為60 ℃。

2.5 ddPCR靈敏度驗證

由圖8可看出，當DNA質量濃度為0.01 ng/μL時，檢測為0.05 copies/μL，質量濃度為0.001 ng/μL時，未出現擴增，因此ddPCR檢測羊DNA的靈敏度為0.01 ng/μL，靈敏度滿足定量檢測需要。

圖8 ddPCR檢測羊肉的靈敏度

2.6 ddPCR定量方法的建立

羊源性成分的檢測結果如圖9所示，羊肉樣品含量在1%～95%，羊肉的拷貝數隨羊肉含量的增大而增加；內標牛肉的拷貝數檢測結果如圖10所示，隨羊肉含量的增大，牛肉的拷貝數幾乎無差異。

圖9 ddPCR內標法檢測1%～95%的羊肉拷貝數

圖10 ddPCR檢測10%內標牛肉的拷貝數

得到羊肉靶基因拷貝數與內標物種牛靶基因拷貝數后計算2個拷貝數比值，以該比值與對應的羊肉實際質量作為橫、縱坐標繪制標準曲線，標準曲線如圖11所示。羊肉的含量與羊肉與內標牛肉的基因拷貝數之比呈線性響應，相關系數R2=0.997 3，計算如公式(3)所示：

y= 0.042 5x+0.015 2

(3)

式中：y表示羊肉的質量，x表示羊與內標牛肉的基因拷貝數之比，通過該公式可將羊肉的基因拷貝數轉化為質量，該回歸方程即可作為羊肉質量的計算方程。

圖11 羊肉與內標的拷貝數比值和羊肉含量的函數關系

2.7 ddPCR內標法檢測羊肉的實際靈敏度

由圖12可看出，空白對照未出現擴增，說明體系未污染，且每個樣品生成的微滴數均大于15 000個，滿足泊松分布統計需要。當羊肉含量為0.01%時，檢測結果為0.12 copies/μL。結果表明，該方法具有良好的靈敏度，可以檢測出含有0.01%羊肉的樣品。

圖12 ddPCR內標法檢測羊肉的實際靈敏度驗證

2.8 定量線性范圍和方法的重復性和準確性驗證

測得的羊肉拷貝數和牛肉拷貝數分別如圖13、圖14所示。

圖13 ddPCR定量方法的準確性及重復性驗證

圖14 ddPCR檢測10%內標牛肉的拷貝數

羊肉與牛肉的拷貝數之比見表8。由表8可看出5個處理的樣品6次測量值均有很好的重復性，RSD均小于8.7%。當羊肉含量為1%時，定量的相對誤差較大，為155.8%；當羊肉含量大于5%時，測定值與實際值相對誤差較小，均在6.6%以內。說明該方法在羊肉含量5%以上時，具有良好的準確性和重復性。

表8 ddPCR定量檢測方法檢測混合肉中羊肉含量的最低檢測限、重復性及準確性

2.9 ddPCR檢測市售樣品羊源性成分含量的結果

利用建立的ddPCR絕對定量方法對樣品中的羊源性成分進行定量檢測，結果表9所示。由表9可知，農貿市場出售的2個羊肉片(卷)和1個羊肉串檢測出了非羊源性成分。2個被檢出非羊源性成分的羊肉片(卷)樣品中羊肉所占比例均<95%，說明樣品被其他動物成分污染，這可能是加工環節或者樣品流通中出現的無意沾染，而非故意添加。1個被檢出非羊源性成分的羊肉串樣品中羊肉所占比例僅為65.1%，可確定為摻假，這表明了現有的市售樣品存在一定的摻假情況。

3 討論

近年來，以核酸為標志物的動物種類鑒別檢測方法獲得了快速發展，尤其dd PCR技術的出現為qPCR檢測核酸提供了一種獨特的方法，尤其適用于低水平檢測。該方法不需要依靠標準曲線或參照基因，可直接得出DNA拷貝數，是對樣品的絕對定量[12]。MORISSET等[13]研究了ddPCR在食品和飼料樣品常規分析中的適用性，認為ddPCR檢測在低靶濃度下顯示出更好的重復性，它的定性和定量檢測限比傳統定量PCR低，能分別達到5個和6個拷貝數，而不需要標準曲線。因此，ddPCR在準確性、特異性和重復性較之于傳統定量PCR存在更大的優勢，在肉源成分檢測方面已經取得一定的成績。由于ddPCR對待檢肉樣的精確定量是利用DNA濃度作為中間變量，從而確定肉樣質量和微滴拷貝數之間的標準曲線。如SHEHATA等[14]采用ddPCR方法，對食品和飼料樣品中牛、豬、雞和火雞的DNA進行定量檢測，是先將基因拷貝數轉換為DNA質量，再從DNA質量換算為肉的質量。苗麗等[5]和陳晨等[15]采用ddPCR方法對肉制品中羊肉和豬肉定量分析，也是以DNA濃度作為中間換算值，得到肉質量和DNA 拷貝數之間的換算關系。但BALLIN等[16]在研究肉類產品的物種標簽時認為，相同質量的不同肉種其DNA基因拷貝數不相同，如果直接將基因拷貝數之比作為肉質量之比，結果會出現較大差異。因此，本研究選擇直接利用2種肉基因拷貝數之比的固定值，一步實現了基因拷貝數之比與肉質量之比的轉化，而實現對羊源性成分的精確定量。

表9 ddPCR對市售樣品的檢測結果

此外，線粒體基因作為靶基因在物種的定性檢測中得到了廣泛應用，但線粒體基因在同一物種的不同組織中含量差異巨大，這給定量檢測帶來困難。FLOREN等[17]認為以線粒體DNA(mtDNA)為靶點進行物種量化具有局限性，因為每個細胞的mtDNA含量有5倍的組織間變異，容易導致物種DNA含量被低估或高估。而單拷貝基因與線粒體基因相比，具有拷貝數少且數量相對恒定等特點，不會因為樣品部位的不同導致定量結果的偏差，適合于對肉類產品進行定量檢測。KOPPEL等[18]利用單拷貝基因設計特異性引物，定量分析了食品中牛、豬等動物源性成份，取得了滿意效果。因此，本研究選擇單拷貝持家基因作為靶基因，利用ddPCR技術對肉中羊源性成分進行精確定量。

由于目前市場上肉制品種類繁多，僅從感官上無法識別肉制品的真實性，更無法識別肉制品是人為故意摻假還是無意污染。為了驗證本實驗建立ddPCR法的準確性和實用性，將ddPCR法與SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測方法》對比進行市售樣品的檢測，結果表明ddPCR能夠對樣品中羊源性成分的含量比例進行了準確定量，這有利于食品檢測部門對樣品中肉源性成分的真偽做出判定。

4 結論

本研究建立了基于DNA拷貝數與樣品質量間線性關系，對羊源性成分進行ddPCR內標定量的方法，實現了從靶基因拷貝數到樣品質量間的一步轉化。實驗證明該方法在檢測出0.01%的羊肉源性成分時，檢測結果達0.12 copies/μL；對于含量5%以上的羊肉源性成分，具有很好的準確性和重復性?？偟膩砜矗痉椒ㄔ谌饧叭庵破分醒蛉庠葱猿煞謾z測和摻假鑒別方面具有較大的應用潛力。