P38 MAPK信號通路在金黃色葡萄球菌誘導U937細胞凋亡中的作用

肖楚麗

邵陽學院，湖南 邵陽 422000

金黃色葡萄球菌（SA）屬于化膿性球菌的一種類型，也是造成院內感染的主要原因，一旦患者出現感染，可能引發食物中毒、假膜性腸炎以及燙傷樣皮膚綜合征，對住院患者的治療造成非常大的威脅。金黃色葡萄球菌能調節人體的逃避宿主免疫防御系統，直至死亡，但是，其引發死亡的作用機制并不明確，所以，研究金黃色葡萄球菌中細胞走向凋亡的重要介導因子，具有重要的意義，也是目前臨床研究的一個重要方向。目前，僅有少數學者發現，可能與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性高低有關，在信號通路的傳導中，有著重要的促進作用，但是，MAPK是如何通過信號通路，產生作用，其作用機制和原理，還有待深入的分析，所以，對P38MAPK信號傳導通路誘導金黃色葡萄糖球菌，至細胞凋亡的作用進行分析，是一項重要的研究課題[1]。本文對P38 MAPK信號通路在金黃色葡萄球菌誘導U937細胞凋亡中的作用進行分析，內容如下：

1 材料與方法

1.1 材料 100株金黃色葡萄球菌均自實驗室中獲取，菌株由實驗室提供，并在不含有抗生素的5%小牛血清RPMI1640培養基重懸并進行稀釋。試劑選擇：P38 MAPK、PHOSPHO-P38MAPK抗體，P38 MAPK抑制劑，凋亡試劑盒、細胞培養試劑。

1.2 方法

①細胞培養以及抑制劑加入。將U937（人巨噬細胞）中置入10%小牛血清，與2mmol/L L-谷氨酸鈉、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素放于RPMI1640培養基中，進行培養箱培養，溫度為37℃，并在SA感染前1h加入不同濃度的P38 MAPK抑制劑。

②SA感染U937細胞。感染前需要使用不含抗生素的RPMI1640培養基將U937進行細胞的清洗并進行重懸，調整濃度，細胞與細菌的比例為1:20，之后分別培養0/15/30/60min，連續2次進行離心處理，將未吞沒的細菌標本清洗干凈，將其放入青霉素、鏈霉素清RPMI1640的培養皿中進行培養，放置3h后，進行感染細胞提取，對其進行定性分析。

連續離心2次，清洗未吞噬的細菌標本，放置于2倍小牛血清、青霉素以及鏈霉素的清RPMI1640培養基中，3h后提取感染的U937細胞，觀察變化。

③雙染分析。使用流式細胞分析儀，將106細胞加入含有an-nexinV的緩和液中，緩和液劑量為60μL，在4℃溫度下避光15分鐘，注意區分早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞以及壞死細胞，并在實施檢查之前同時染an-nexinV與PI，結合測試儀分析結果。

④Western免疫印跡。在U937細胞處理過一段時間后，實施PBS洗滌，在3次后將其中裂解液進行重懸，時間為20min，之后使用同樣數量的蛋白12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用蛋白轉印系統將蛋白轉印至膜上，60min后使用5%奶粉在三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水中進行封閉，并按照說明書的操作要求，對其進行Tween20洗滌，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。

1.3 觀察指標 對比U937細胞凋亡百分比在不同時間段的表現。

1.4 統計學處理 本次研究數據均采用統計學軟件SPSS20.0進行處理，計數資料采用χ2表示，P檢驗，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

隨著時間的增加，U937細胞凋亡百分比顯著提升，詳見表1。

表1 對比不同時間下U937細胞凋亡百分比

3 討論

金黃色葡萄糖球菌的抵抗力是最強的，屬于一種無芽胞菌，在人體中大量的存在，其生存條件簡單，如皮膚表面附著，鼻腔內部附著等。研究顯示，MAPK的存在途徑非常多樣化，被學者知曉的目前就有4種，P38 MAPK信號通路是其中一種，主要通過絲氨酸以及蘇氨酸同時磷酸化之后出現激活，因此需要對該方面進行分析。根據學者研究指出，p38MAPK可介導、分化細胞的分化和增殖，并且大量的存在于對中生物學效應中，有時候，甚至可以產生抑制等相反的作用，但是，其具有很強的細胞依賴性，在致病性細菌侵襲的細胞中，p38MAPK信號通路均表現出很強的活躍性。例如，p38MAPK在巨噬細胞中，能參與脂多糖（LPS）的活化活動，或者是大腸桿菌感染上皮細胞中，p38MAPK在李斯特菌、沙門菌等致病菌中，能借助這些病菌的誘導作用，p38MAPK被活化。而根據學者研究發現，在大腸桿菌標準株ATC25922能誘導U937細胞逐漸走向凋亡，而此時p38MAPK磷酸化水平也隨著時間的延長，而逐漸增長，該學者研究表示，p38MAPK在U937細胞凋亡過程中，發揮著重要的作用。所以，對于金黃色葡萄球菌中p38MAPK是否也發揮著同樣的作用，是一個值得深入研究的問題。

而通過本文研究，也再次證實隨著時間的增加，U937細胞凋亡百分比顯著提升。分析原因：絲裂原激活的蛋白激酶（MAPKS）又稱為絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，介導信號自細胞表面向核內傳遞，屬于一種信號系統，在細胞的生長、增殖、分化以及凋亡的過程中起到非常重要的作用，而P38 MAPK屬于MAPKS的組成部分，主要介導炎癥、應激、損傷等信號的傳遞，可以被炎細胞因子、毒素等應激因素激活，因此其在調節炎癥反應等方面發揮的作用較為顯著，同時P38通路異常過度激活可能導致細胞正常停滯或者凋亡；而激活P38 MAPK的原因可能是因為患者受到應激性的刺激，或病理性損傷，引發介導細胞死亡，因此一些細胞可在P38 MAPK的介導下出現分化以及增殖，并且在活化之后生物效應多樣化顯著，有些甚至與原本屬性相反，可能存在依賴性，此時，研究P38MAPK信號通路在金黃色葡萄糖球菌中的誘導作用，有著重要的意義。

通過研究發現，金黃色葡萄球菌誘導U937細胞死亡時，其細胞的死亡率，是隨著時間延長而逐漸升高的，可見金黃色葡萄球菌可以將P38 MAPK激活，因此在進行該疾病預防的過程中需要注意對該方面的預防，為細菌的控制提供更加理想的條件[7]；對P38 MAPK進行研究發現，其可以被吞噬細胞中的脂多糖成分逐漸活化，最終釋放大量的沙門菌或里斯特菌，附著在大腸上，引起病變，最終通過P38MAPK產生誘導作用，整個過程中完全遏制了TNF-a的活性，最終使得人中性粒細胞IL-8發生超氧化離子，發生MIP誘導化學趨化性，介導P38 MAPK活化，進而啟動信號傳導系統，促進細胞表達、合成以及釋放IL-1、ILK-6等多種炎性因子，參與至炎性反應的過程中，而U937細胞在感染金黃色葡萄球菌后P38 MAPK的活性，發現其在15min后開始升高，證明其具有激活的效果，因此可以降低抑制劑依賴性細胞的凋亡，為疾病的控制提供條件[8-9]。

綜上分析，P38 MAPK信號通路是金黃色葡萄球菌誘導U937細胞凋亡的重要傳導。