白藜蘆醇對體外胚胎生產的作用機制

胡慧茹 王健 瞿靜雯 孫曉梅 李擁軍

摘要?白藜蘆醇是存在于70多種植物中的一種多酚物質，常見于葡萄、桑椹等植物，具有抗炎、抗老、抗癌的效能。近年來，白藜蘆醇對卵母細胞、冷凍精液、胚胎質量的影響備受關注。綜述了白藜蘆醇在體外胚胎生產中的應用情況，為白藜蘆醇更廣泛地應用于胚胎工程試驗提供參考。

關鍵詞?白藜蘆醇，卵母細胞，冷凍精液，胚胎

中圖分類號?R285.5文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）06-0020-03

Abstract?Resveratrol is a polyphenolic substance found in more than 70 kinds of plants.It is commonly found in grapes，mulberry and other plants.Its strong antioxidant activity has antiinflammatory，antiaging and anticancer effects.In recent years，the effects of resveratrol on oocytes，frozen semen，and embryo quality have attracted much attention.This article reviewed the application of resveratrol in vitro embryo production，and provided a reference for the wider application of resveratrol in embryo engineering experiments.

Key words?Resveratrol，Oocyte，Frozen semen，Embryo

我國輔助生殖技術經過30多年的發展，已經達到了世界先進水平，為成千上萬的家庭解決了不孕不育的難題。如超數排卵、胚胎移植、體外胚胎生產、冷凍保存等，這些輔助生殖技術不僅在人體方面應用廣泛，而且對提高動物繁殖性能和誘導遺傳改良也起到了十分積極的作用。然而，與體內環境條件相比，體外胚胎生產的效率仍相對較低。據報道，細胞體外培養條件很難與體內生理環境達到精準一致，且細胞內的抗氧化能力不能保護機體免于氧化損傷，因此在體外培養過程中添加抗氧化劑，可以有效保護卵母細胞、冷凍精液、胚胎免受氧化應激。

白藜蘆醇作為天然多酚，其結構式為3，4′，5-三羥基二苯乙烯，最早是從白藜蘆的根部提取得到的，有順式-（E）和反式-（Z）2種同分異構體，通常能夠穩定存在并發揮主要生物活性的是反式結構。研究發現這種天然的物質廣泛存在于葡萄、桑椹、虎杖等70多種植物中，且它們中大多數可食用。白藜蘆醇是植物本身為應對外界傷害而合成的一種抗毒素，后來有科學家證實它還有抗氧化、抗癌[1]、抗炎癥[2]和保護心血管[3]等保健作用。近年來，將白藜蘆醇作為抗氧化劑用于體外胚胎生產的研究越來越多，如在卵母細胞成熟方面，Zabihi等[4]發現0.25和0.5 μmol/L的白藜蘆醇顯著增加了綿羊卵母細胞的卵丘擴散，添加在牛卵母細胞成熟液中時，1.0 μmol/L的白藜蘆醇同樣改善了卵丘擴散以及第一極體的排出[5]，在冷凍精液方面，Longobardi等[6]和Gadani等[7]研究發現，白藜蘆醇雖然對精子活力無顯著影響，但50 μmol/L和2 mmol/L可分別提高公牛和公豬冷凍精液的體外受精能力。在胚胎質量方面，0.5 μmol/L的白藜蘆醇可顯著提高綿羊胚胎的發育能力，主要表現在較高的囊胚率和囊胚細胞總數[4]，Kwak等[8]在豬的卵母細胞IVM期間補充2.0 μmol/L白藜蘆醇，發現它可增加細胞內谷胱甘肽（GSH）水平，降低活性氧（ROS）水平以及調節卵母細胞成熟期間的基因表達，從而改善了孤雌激活和體外受精后豬胚胎的發育潛力。雖然一定濃度的白藜蘆醇對不同物種的體外胚胎生產具有一定的積極作用，但有研究顯示過高濃度的白藜蘆醇對卵母細胞的成熟及胚胎具有負面影響，如Zabihi等[4]研究發現5.0 μmol/L的白藜蘆醇降低了MII卵母細胞率、卵裂率、桑椹胚和囊胚率。白藜蘆醇對卵母細胞、冷凍精液、以及胚胎發育等均具有影響作用，筆者探討其在胚胎生產過程中的作用機理，為此類抗氧化劑更廣泛的應用于胚胎工程研究提供參考。

1?白藜蘆醇的抗氧化作用

1.1?白藜蘆醇對細胞內活性氧（ROS）水平的影響

活性氧（ROS）是體內正常代謝產生的一類氧單電子還原產物，體外的理化因素（如化學藥物、輻射、高壓氧等）也可以誘導產生ROS，可以說生命活動與ROS的產生密切相關。但對于化學性質活潑且具有強氧化性的ROS而言，體內含量一旦過高，出現氧化與抗氧化的失衡便會引起機體出現氧化應激，從而引發疾病或衰老。因此，氧化應激亦是胚胎體外產生效率低下的重要原因，而研究顯示白藜蘆醇的抗氧化作用主要是對抗細胞內的ROS水平。如Mukherjee等[9]研究發現，在IVM期間，用0.25和0.50 μmol/L的白藜蘆醇處理卵母細胞，通過降低ROS水平，為山羊卵母細胞提供有益的微環境，進而調節基因表達和刺激胚胎發育。Kwak等[8]在豬的卵母細胞成熟及胚胎發育研究中發現了相似的結果，即2.0 μmol/L白藜蘆醇通過降低細胞內ROS水平，調節卵母細胞成熟期間的基因表達，并提高豬胚胎的發育潛力。 不同的是，Santos等[10]研究發現添加白藜蘆醇并未降低卵母細胞內ROS水平，這可能與不同物種的培養基成分差異有關。同時，這也印證了細胞內ROS水平不是受單一因素控制的，氧濃度、光、卵母細胞處理方式、細胞代謝反應和物理化學參數等均可以影響ROS水平[11]。冷凍可以使細胞內ROS水平升高，造成細胞的氧化損傷。戴建軍等[12]發現在豬卵母細胞IVM培養基中添加2 μmol/L的白藜蘆醇，可以提高卵母細胞的線粒體功能，降低氧化損傷，提高卵母細胞的抗凍能力。李世佳等[13]發現向人精液冷凍保護液中添加30 μmol/L的白藜蘆醇，可以降低精子內ROS水平，減少精子冷凍損傷，從而改善解凍后精子質量和功能。研究表明，玻璃化冷凍前用2 μmol/L白藜蘆醇預處理未成熟的卵母細胞，對隨后胚胎的發育無影響，但將該試劑添加在玻璃化冷凍、升溫后的IVM培養基中，改善了囊胚期的胚胎發育，這說明白藜蘆醇雖不能阻止玻璃化造成的細胞損傷，但可以增強細胞亞致死的損傷恢復[10]。

1.2?白藜蘆醇對機體內谷胱甘肽（GSH）水平的影響

谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽，含有巰基。它幾乎存在于身體的每一個細胞，具有清除自由基和抗氧化的作用。研究表明，在細胞體外培養過程中添加白藜蘆醇，可以促進GSH的合成。如Mukherjee等[9]發現在IVM培養基中添加白藜蘆醇，能夠促進山羊卵母細胞的細胞質成熟，且通過增加的細胞內GSH水平促進孤雌激活和手工克隆之后胚胎發育能力。同樣的，在豬卵母細胞IVM培養基中添加2.0 μmol/ L的白藜蘆醇，能夠增加細胞內GSH水平，降低ROS水平以及調節卵母細胞成熟期間的基因表達，改善孤雌激活和體外受精后胚胎的發育潛力[8]。Li等[14]在研究熱應激下豬卵母細胞及胚胎發育時發現，2.0 μmol/ L白藜蘆醇不僅可以改善核成熟，還可以通過增加谷胱甘肽（GSH）水平，提高熱應激下胚胎孤雌激后的囊胚率。

2?白藜蘆醇對機體內固醇類激素分泌的影響

除抗氧化作用，白藜蘆醇還能影響各類固醇類激素的分泌。早在2008年，研究發現白藜蘆醇能夠顯著增加雄性小鼠睪丸激素的分泌[15]。還有研究指出，白藜蘆醇增加了雌性大鼠顆粒細胞中P450arom和黃體化相關基因（如LH-R和StAR）的表達，這可能促進卵巢中的類固醇激素的生成和黃體化[16]。孕酮與Mos/MEK1/p42MAPK級聯信號通路密切相關，近年來，Wang等[5]研究顯示，白藜蘆醇顯著上調C-mos/ERK2/MAPK2基因的表達，下調CDC2/CyCB2基因的表達，證實了白藜蘆醇可以通過卵丘細胞誘導孕酮分泌、降低雌二醇分泌以及自身的抗氧化作用促進牛卵母細胞成熟和隨后體外受精的胚胎發育。據報道，白藜蘆醇還是一種植物雌激素，在不同的試驗中發揮不同程度的雌激素受體激動劑活性[17]。因此推測白藜蘆醇在卵母細胞成熟液中發揮雌激素樣活性，可以競爭性地與卵丘細胞上的雌激素受體相結合，達到飽和狀態時，便會通過負反饋調節作用降低卵丘細胞中雌激素分泌[5]。

3?白藜蘆醇對線粒體功能和能量穩態的影響

線粒體是細胞能量代謝的重要場所。它可以直接利用氧，但也不斷受到氧毒性的傷害，一旦損傷過度，細胞就會衰老死亡。而沉默信息調節因子1（Sirtuin1，SIRT1）是NAD+依賴的組蛋白去乙?；竤irtuin家族的成員[18]，對細胞穩態具有抗衰老作用，它的一個重要作用是上調線粒體的生物合成[19]。白藜蘆醇是Sirtuin1（SIRT1）的激活劑，它可以通過抑制磷酸二酯酶來增強SIRT1的活性[20]。研究表明，白藜蘆醇補充在體外成熟（IVM）培養基中改善了牛和豬卵母細胞的受精效果和發育能力，最有可能通過上調線粒體生物合成和降解，使卵母細胞中ATP含量增加[21-22]。而Itami等[23]研究發現，白藜蘆醇上調SIRT1的表達僅增強線粒體功能而對線粒體數量沒有任何影響。SIRT1的另一個重要作用是與控制細胞代謝的能量傳感器（腺苷一磷酸激活蛋白酶AMPK）相互作用，影響卵母細胞的能量穩態，包括上調氧化磷酸化和脂肪磷酸化[24]。研究表明，AMPK的激活能夠促進脂肪酸β-氧化[23]，而且減數分裂過程中脂肪酸的消耗與卵母細胞的發育能力密切相關[25]。因此，有學者認為，白藜蘆醇顯著增加卵母細胞內ATP含量是由于SIRT1因子激活P-AMPK（磷酸化）表達，促進脂肪酸β-氧化，增強線粒體產生ATP的能力，從而大大提高了卵母細胞向囊胚階段的發育能力[26]。據報道，冷凍保存會降低胚胎內ATP含量和線粒體拷貝數，這表明冷凍保存可能會使胚胎中的線粒體受損，而受損線粒體的分解是維持細胞穩態所必需的。因此，有學者將0.5 μmol/L的白藜蘆醇添加在慢速冷凍升溫后的胚胎培養基中，發現它可以降低胚胎中mt-cfDNA（游離線粒體之外的DNA，即線粒體受損后裂解，mt-DNA（線粒體DNA）游離于線粒體之外）的含量，增加培養基中mt-cfDNA的含量，說明白藜蘆醇增強了受損線粒體的降解，并將mt-DNA分泌到培養基中，從而維持細胞穩態[27]。

4?白藜蘆醇對體外胚胎生產過程中細胞凋亡的影響

細胞凋亡在發育和分化中起關鍵作用，它是一種正常的細胞代謝程序，可以有效清除受損的細胞。然而對于體外培養卵母細胞或胚胎時由于環境應激等因素所產生的ROS，亦可誘導細胞凋亡。大量研究表明，適當濃度的白藜蘆醇通過調節與細胞凋亡有關基因的表達，可減少細胞凋亡。目前，最受關注的是bcl-2蛋白家族和胱天蛋白酶（caspase） 家族，它包括功能相互對立的促凋亡（Bax）和抗凋亡（Bcl-2）基因，以及在凋亡過程中起關鍵作用的凋亡執行蛋白酶caspase3。如Kwak等[8]在研究豬卵母細胞成熟時發現，添加白藜蘆醇對于Bcl-2的表達無顯著影響，但明顯降低了Bax和Caspase-3基因的表達，抑制了卵母細胞的凋亡。該結果在山羊[9]和牛[28]卵母細胞研究中分別得到了證實。然而，在人乳腺癌細胞培養中發現白藜蘆醇還有劑量依賴效應，低濃度促進細胞分裂，抑制細胞凋亡，高濃度則發揮抗增殖促凋亡作用[29]。如當白藜蘆醇的添加量高至10 μmol/L時，Bax表達量升高，Bcl-2表達量下降，細胞呈現凋亡狀態，其中Bcl-2表達量甚至是低于未添加白藜蘆醇的空白組[12]。這與Torres等[28]和Lee等[30]的研究結果類似。此外，還有一些其他的基因在細胞凋亡中發揮作用，如Kong等[31]對大鼠的研究發現，白藜蘆醇通過減少凋亡蛋白FOXO3a、Bim和P27KIP1的激活，抑制卵母細胞凋亡，增加卵母細胞數量，維持正常的發情周期，延緩大鼠衰老。

5?小結

白藜蘆醇作為天然的抗氧化劑，在體外胚胎生產過程中的作用重大。添加適宜濃度的白藜蘆醇可清除細胞內多余ROS，提高GSH水平，降低氧化應激，維持機體氧化還原平衡，同時調節相關基因的表達，促進類固醇激素分泌，改善線粒體功能，維持細胞能量穩態，減少細胞凋亡，進而提高卵母細胞體外成熟效果、胚胎的體外發育潛力以及冷凍精液的受精能力。然而白藜蘆醇在體外胚胎生產中的作用機制較為復雜，以及各物種間生理差異，添加濃度相差較大，因此要想明確白藜蘆醇提高體外胚胎生產效率的潛在機理，還需深入研究。

參考文獻

[1] BAUR J A，SINCLAIR D A .Therapeutic potential of resveratrol：The in vivo evidence[J].Nature reviews drug discovery，2006，5（6）：493-506.

[2] GENTILLI M，MAZOIT J X，BOUAZIZ H，et al.Resveratrol decreases hyperalgesia induced by Carrageenan in the rat hind paw[J].Life sciences，2001，68（11）：1317-1321.

[3] HYUN.The effects of resveratrol on oocyte maturation and preimplantation embryo development[J].Journal of embryo transfer，2012，27：71-80.

[4] ZABIHI A，SHABANKAREH H K，HAJARIAN H，et al.Resveratrol addition to in vitro maturation and in vitro culture media enhances developmental competence of sheep embryos[J].Domestic animal endocrinology，2019，68：25-31.

[5] WANG F，TIAN X Z，ZHANG L，et al.Beneficial effect of resveratrol on bovine oocyte maturation and subsequent embryonic development after in vitro fertilization[J].Fertility and sterility，2014，101（2）：577-586.

[6] LONGOBARDI V，ZULLO G，SALZANO A，et al.Resveratrol prevents capacitation-like changes and improves in vitro fertilizing capability of buffalo frozen-thawed sperm[J].Theriogenology，2016，88：1-8.

[7] GADANI B，BUCCI D，SPINACI M，et al.Resveratrol and Epigallocatechin3gallate addition to thawed boar sperm improves in vitro fertilization[J].Theriogenology，2016，90：88-93.

[8] KWAK S S，CHEONG S A，JEON Y，et al.The effects of resveratrol on porcine oocyte in vitro maturation and subsequent embryonic development after parthenogenetic activation and in vitro fertilization[J].Theriogenology，2012，78（1）：86-101.

[9] MUKHERJEE A，MALIK H，SAHA A P，et al.Resveratrol treatment during goat oocytes maturation enhances developmental competence of parthenogenetic and handmade cloned blastocysts by modulating intracellular glutathione level and embryonic gene expression[J].Journal of assisted reproduction and genetics，2014，31（2）：229-239.

[10] SANTOS E C S，APPELTANT R，DANGNGUYEN T Q，et al.The effect of resveratrol on the developmental competence of porcine oocytes vitrified at germinal vesicle stage[J].Reproduction in domestic animals，2018，53（2）：304-312.

[11] KHAZAEI M，AGHAZ F.Reactive oxygen species generation and use of antioxidants during in vitro maturation of oocytes[J].International journal of fertility & sterility，2017，11（2）：63-70.

[12] 戴建軍，吳彩鳳，張樹山，等.成熟液中添加白藜蘆醇對豬卵母細胞體外發育和抗凍能力的影響[J].中國農學通報，2018，34（28）：137-142.

[13] 李世佳，蘇衛東，邱麗君，等.白藜蘆醇對人精子冷凍損傷的保護作用[J].中華男科學雜志，2018（6）：499-503.

[14] LI Y，WANG J，ZHANG Z Z，et al.Resveratrol compares with melatonin in improving in vitro porcine oocyte maturation under heat stress[J].Journal of animal science and biotechnology，2017，8（1）：89-98.

[15] SHIN S，JEON J H，PARK D，et al.transResveratrol relaxes the corpus cavernosum ex vivo and enhances testosterone levels and sperm quality in vivo[J].Archives of pharmacal research，2008，31（1）： 83-87.

[16] MORITA Y，WADAHIRAIKE O，YANO T，et al.Resveratrol promotes expression of SIRT1 and StAR in rat ovarian granulosa cells：An implicative role of SIRT1 in the ovary[J].Reproductive biology & endocrinology，2012，10（1）：1-10.

[17] GEHM B D，MCANDREWS J M，CHIEN P Y，et al.Resveratrol，a polyphenolic compound found in grapes and wine，is an agonist for the estrogen receptor[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（25）：14138-14143.

[18] GUARENTE L，PICARD F.Calorie restriction— the SIR2 connection[J].Cell，2005，120（4）：473-482.

[19] CIVITARESE A E，CARLING S，HEILBRONN L K，et al.Calorie restriction increases muscle mitochondrial biogenesis in healthy humans[J].PLoS Medicine，2007，4（3）：485-494.

[20] PARK S J，AHMAD F，PHILP A，et al.Resveratrol ameliorates agingrelated metabolic phenotypes by inhibiting cAMP phosphodiesterases[J].Cell，2012，148（3）：421-433.

[21] TAKEO S，SATO D，KIMURA K，et al.Resveratrol improves the mitochondrial function and fertilization outcome of bovine oocytes[J].Journal of reproduction & development，2014，60（2）：92-99.

[22] SATO D，ITAMI N，TASAKI H，et al.Relationship between mitochondrial DNA Copy Number and SIRT1 Expression in Porcine Oocytes[J].PLoS One，2014，9（4）：e94488.

[23] ITAMI N，SHIRASUNA K，KUWAYAMA T，et al.Resveratrol improves the quality of pig oocytes derived from early antral follicles through sirtuin 1 activation[J].Theriogenology，2015，83（8）：1360-1367.

[24] HARDIE D G.AMPactivated protein kinase—an energy sensor that regulates all aspects of cell function[J].Genes Dev，2011，25（18）：1895-1908.

[25] TAKEO S，KAWAHARAMIKI R，GOTO H，et al.Ageassociated changes in gene expression and developmental competence of bovine oocytes，and a possible countermeasure against ageassociated events[J].Molecular reproduction and development，2013，80（7）：508-521.

[26] HARDIE G D.AMPactivated protein kinase： A key regulator of energy balance with many roles in human disease[J].Journal of internal medicine，2014，276（6）：543-559.

[27] HAYASHI T，KANSAKU K，ABE T，et al.Effects of resveratrol treatment on mitochondria and subsequent embryonic development of bovine blastocysts cryopreserved by slow freezing[J].Animal science journal，2019，90（7）：849-856.

[28] TORRES V，HAMDI M，MILLN DE LA BLANCA M G，et al.Resveratrolcyclodextrin complex affects the expression of genes associated with lipid metabolism in bovine in vitro produced embryos[J].Reproduction in domestic animals，2018，53（4）：850-858.

[29] KIM Y A，CHOI B，LEE Y，et al.Resveratrol inhibits cell proliferation and induces apoptosis of human breast carcinoma MCF7 cells[J].Oncology reports，2004，11（2）：441-446.

[30] LEE K，WANG C，CHAILLE J M，et al.Effect of resveratrol on the development of porcine embryos produced in vitro[J].Journal of reproduction and development，2010，56（3）：330-335.

[31] KONG X X，FU Y C，XU J J，et al.an effective regulator of ovarian development and oocyte apoptosis[J].Journal of endocrinological investigation，2011，34（11）：374-381.