香椿子多糖脫蛋白脫色工藝及其體外抗凝血活性研究

聞志瑩，蔡為榮，許 永，丁伯樂(lè)

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

人們生活水平越來(lái)越高的同時(shí)，血栓性疾病[1]日益增多，導(dǎo)致人體器官組織缺血及壞死[2]。在治療血栓性疾病的過(guò)程中，肝素類物質(zhì)[3]通常被作為抗凝血藥物，但同時(shí)也伴隨著一些副作用，如易導(dǎo)致血小板減少、出血等[3-4]。因此從天然產(chǎn)物中找尋具有抗凝血活性的物質(zhì),或者將其具有抗凝血活性成分的結(jié)構(gòu)用來(lái)研究開(kāi)發(fā)，在治療和預(yù)防血栓性疾病方面將體現(xiàn)以下優(yōu)點(diǎn)：降低不良反應(yīng)、副作用少、高效低毒、原料來(lái)源廣等[5]。

香椿子，又被稱為椿樹子，是楝科植物香椿(Toona sinensis)的果實(shí)，主要產(chǎn)于中國(guó)長(zhǎng)江南北地區(qū)，具有較高的經(jīng)濟(jì)和藥用價(jià)值[6]。《四川中藥志》中指出香椿子沒(méi)有毒性，性溫，同時(shí)具有味辛、苦等特點(diǎn)。香椿子一般是被當(dāng)做普通的藥材進(jìn)行利用，對(duì)于常見(jiàn)的流感風(fēng)寒、胃疾病具有一定的效果，同時(shí)對(duì)痢疾、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛[7]等也有一定的療效，用途比較單一，使得香椿子資源沒(méi)有被充分利用。多糖在生物體內(nèi)廣泛存在，是生物體內(nèi)3種不可或缺的大分子物質(zhì)之一[8]，并在生物體生命活動(dòng)中起到非常重要的作用[9-13]。香椿子的主要成分之一為多糖[14]，其具有抗氧化[15]、抗凝血[16]等生理功能。香椿子粗多糖是混合物，在初提的時(shí)候會(huì)產(chǎn)生一些雜質(zhì)[17]，如色素類、蛋白質(zhì)等，在很大的程度上會(huì)對(duì)多糖后期的分離純化以及生物活性造成影響[18]。因此，為了保證香椿子多糖的純度和活性，尋找對(duì)香椿子多糖脫蛋白率高、脫色效果好、且多糖保留率高的脫蛋白脫色工藝非常重要。目前，關(guān)于香椿子多糖的提取工藝[15]已有報(bào)道，對(duì)香椿子粗多糖抗凝血活性[16]的研究鮮有報(bào)道，而關(guān)于香椿子多糖制備過(guò)程中的脫蛋白、脫色工藝及其所得精多糖的抗凝血活性卻未見(jiàn)報(bào)道。

因此，實(shí)驗(yàn)以香椿子為原料，以多糖保留率、蛋白質(zhì)去除率和脫色率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，比較TCA、Sevag和聚酰胺法3種方法對(duì)香椿子多糖的脫蛋白效果，首次利用活性炭脫色法進(jìn)行正交優(yōu)化工藝，在此條件下確定較優(yōu)的脫蛋白方法及活性炭脫色工藝，并對(duì)脫蛋白、脫色后制備得到的香椿子多糖的抗凝血功能進(jìn)行相關(guān)的探究，進(jìn)一步研究香椿子多糖的抗凝機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香椿子(亳州藥材店);聚酰胺(80目,浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);牛血清白蛋白(上海博奧生物科技有限公司);考馬斯亮藍(lán)G-250(Sigma公司);APTT、PT、TT測(cè)定試劑盒(上海太陽(yáng)生物科技有限公司);肝素鈉(北京索萊寶科技有限公司);苯酚,無(wú)水乙醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司);活性炭(粉末狀)、葡萄糖、三氯乙酸、濃硫酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海青浦滬西儀器廠);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司);SHB循環(huán)水式真空泵(鄭州市上街華科儀器廠);L3S可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司);UVmini-1280紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)SIM公司);MTN-Ⅱ血凝儀(長(zhǎng)春市曼特諾醫(yī)療器械有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)香椿子多糖制備工藝流程圖如圖1所示。

圖1 香椿子多糖制備工藝流程圖

(2)香椿子粗多糖的提取。將香椿子70 ℃烘干，然后將其粉碎、過(guò)80目篩。稱取香椿子粉末，按照響應(yīng)面最優(yōu)條件(料液比1∶25、82.5 ℃、92 min、提取1次)提取粗多糖。將香椿子提取液通過(guò)離心、抽濾處理后得到粗多糖濾液，然后利用真空濃縮的方式在50 ℃進(jìn)行濃縮，直至達(dá)到原體積的三分之一，向濃縮后的液體中加入4倍體積的無(wú)水乙醇，然后進(jìn)行攬拌，接著將樣品放在冰箱中，4 ℃醇沉。24 h后，將溶液進(jìn)行低速離心(4 000 r/m,20 min)得到沉淀，并用無(wú)水乙醇洗滌多次，然后將沉淀加水復(fù)溶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去酒精后，冷凍干燥得到香椿子粗多糖(CSTSP)。

(3)香椿子粗多糖脫蛋白。

①不同脫蛋白方法。

Sevag[19]法脫蛋白：取40 mL 2 mg/mL香椿子粗多糖溶液，然后加入相同體積的Sevag，振蕩30 min后以4 000 r/m轉(zhuǎn)速處理樣品30 min，按照相同步驟處理樣品兩次，然后取上清液測(cè)多糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

TCA法脫蛋白：取40 mL 2 mg/mL香椿子粗多糖溶液，加入2.0 mL TCA(4 mol/L)溶液，混合均勻后將樣品于4 ℃冰箱中保存，24 h后離心(4 000 r/m,15 min)。取上清液，測(cè)香椿子多糖保留率和蛋白質(zhì)去除率。

聚酰胺法[20]脫蛋白(靜態(tài)聚酰胺法)：取40 mL 2 mg/mL香椿子粗多糖溶液，然后加入聚酰胺粉1.4 g，將其在室溫26 ℃的條件下振蕩2 h(110 r/min)。待振蕩結(jié)束后，將其進(jìn)行抽濾、離心，保留上清液，然后計(jì)算多糖的保留率和蛋白質(zhì)去除率。

②紫外光譜分析[21]。將未脫蛋白的香椿子粗多糖和最佳脫蛋白方法脫蛋白的香椿子多糖分別配成0.2 mg/mL的溶液，然后分別在200～400 nm內(nèi)用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，觀察多糖紫外可見(jiàn)光譜特征。

(4)活性炭脫色[22]。

①單因素實(shí)驗(yàn)。

以脫色率、多糖保留率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究4個(gè)單因素指標(biāo)對(duì)香椿子多糖(已脫蛋白)的脫色影響，單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：

活性炭添加量(A)：將香椿子多糖配成4 mg/mL，設(shè)定溫度50 ℃，時(shí)間1.5 h,pH為6，活性炭的添加用量依次遞增，分別為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%，測(cè)定香椿子多糖保留率和脫色率。

脫色溫度(B):將香椿子多糖配成4 mg/mL，設(shè)定時(shí)間1.5 h,pH為6，活性炭添加量最優(yōu)條件為已確定的A，脫色溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，測(cè)定香椿子多糖保留率和脫色率。

脫色時(shí)間(C):將香椿子多糖配成4mg/mL，設(shè)定樣液pH為6，活性炭添加量與脫色溫度的最優(yōu)條件為已確定的A、B，脫色時(shí)間為0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h,測(cè)定香椿子多糖保留率和脫色率。

樣液pH(D):將香椿子多糖配成4 mg/mL，A、B、C最優(yōu)條件已確定，樣液pH為4、5、6、7、8，測(cè)定香椿子多糖保留率和脫色率。

②正交實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇4個(gè)因素中影響較大的3個(gè)水平，按L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因素水平如表1所示。

表1 活性炭脫色正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

(5)香椿子多糖體外抗凝血活性實(shí)驗(yàn)。將血漿(健康志愿者處獲得)和檸檬酸鈉(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為3.8%)按體積比(9∶1)混勻，離心(3 600 r/m,15 min)收集上清液，將其置于真空采血管內(nèi)，4 ℃保存。取經(jīng)脫蛋白脫色工藝制備得到的香椿子多糖(STSP)，將其溶于生理鹽水，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL的樣品；然后將待測(cè)血漿和香椿子多糖溶液按4∶1的體積比混勻；生理鹽水作為陰性對(duì)照，肝素鈉作為陽(yáng)性對(duì)照，然后進(jìn)行體外抗凝血活性研究。

①APTT的測(cè)定。取50 μL待測(cè)樣液(多糖與血漿混勻)，37 ℃預(yù)熱3 min后加入等體積APTT試劑，保溫5 min后，再加入50 μL 37 ℃預(yù)熱的CaCl2溶液，同時(shí)用儀器記錄凝血時(shí)間。

②PT的測(cè)定。取50 μL待測(cè)樣液(多糖與血漿混勻)，37 ℃預(yù)熱3 min后加入50 μL PT試劑，同時(shí)用儀器記錄凝血時(shí)間。

③TT的測(cè)定。取50 μL待測(cè)樣液(多糖與血漿混勻)，37 ℃預(yù)熱3 min后加入50 μL TT試劑，同時(shí)用儀器記錄凝血時(shí)間。

④統(tǒng)計(jì)分析。所有的試驗(yàn)都進(jìn)行3次平行的重復(fù)試驗(yàn)，最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Minitab 15軟件進(jìn)行分析。

(6)多糖含量及多糖保留率的測(cè)定。采用苯酚-硫酸法在490 nm下測(cè)定香椿子中的多糖含量。線性方程為：

Y1=11.478X1-0.019 3，

式中，X1為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)；Y1為吸光度(A)；R2=0.999 2，線性范圍0～0.10 mg/mL。多糖保留率的測(cè)定按照式(1)計(jì)算。

(1)

式中,A1指脫蛋白前(脫色前)香椿子多糖溶液中多糖的含量；A2指脫蛋白后(脫色后)香椿子多糖溶液中多糖的含量。

(7)蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)去除率的測(cè)定。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法。線性方程為:

Y2=8.902 1X2-0.007 2，

式中,X2為蛋白質(zhì)含量;Y2為吸光度;R2=0.994 8，線性范圍0～0.1 mg/mL。蛋白質(zhì)去除率按照式(2)計(jì)算。

(2)

式中,B1指脫蛋白前香椿子多糖溶液中蛋白質(zhì)的含量；B2指脫蛋白后香椿子多糖溶液中蛋白質(zhì)的含量。

(8)脫色率的測(cè)定。將脫色前的香椿子多糖溶液在紫外420 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，脫色后的香椿子多糖溶液在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。脫色率按照式(3)計(jì)算。

(3)

式中,C1、C2指脫色前、脫色后香椿子多糖溶液中色素的吸光度。

(9)數(shù)據(jù)處理：綜合加權(quán)評(píng)分法[23]。綜合指標(biāo)為：以脫色率、多糖保留率作為評(píng)分指標(biāo)，然后將指標(biāo)的最大值作為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。脫色率和多糖保留率的權(quán)重系數(shù)各為0.5。綜合評(píng)分按照式(4)來(lái)計(jì)算。

(4)

式中,X指脫色率;Y指多糖保留率；Xmax指脫色率最大值；Ymax指多糖保留率最大值。

2 結(jié)果與分析

2.1 香椿子多糖脫蛋白

(1)脫蛋白方法的比較。不同方法對(duì)多糖保留率和蛋白質(zhì)去除率的影響如圖2所示。由圖2可以看出，3種脫蛋白方法對(duì)香椿子粗多糖都有一定的脫蛋白效果。從蛋白質(zhì)的去除率進(jìn)行比較，在3種脫蛋白方法中，聚酰胺法的脫蛋白效果是最好的，它的蛋白質(zhì)去除率達(dá)到68.15%，其次是TCA法，而Sevag的脫蛋白效果相比其他兩種效果差了很多，Sevag的蛋白質(zhì)去除率為28.89%，效率僅達(dá)到聚酰胺法的42.39%；從多糖保留率方面進(jìn)行比較，效果最好的是Sevag法，它的多糖保留率能夠達(dá)到92.19%，然后是聚酰胺法(88.09%)，可能是因?yàn)門CA法本身是一種反應(yīng)比較劇烈的脫蛋白方法，TCA會(huì)與蛋白質(zhì)結(jié)合形成沉淀，且當(dāng)TCA質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)會(huì)破壞多糖的活性結(jié)構(gòu)，引起多糖糖苷鍵斷裂，易造成部分多糖降解[24]，從而導(dǎo)致多糖損失相比較其他兩種方法較多。

綜合多糖保留率和蛋白質(zhì)去除率兩個(gè)方面，可以確定靜態(tài)聚酰胺法對(duì)香椿子粗多糖脫蛋白的效果比其他兩種方法好，其多糖保留率可以達(dá)到88.09%，蛋白質(zhì)去除率達(dá)到68.15%，最終確定聚酰胺法作為香椿子多糖的脫蛋白方法。

(2)脫蛋白前后紫外光譜分析。香椿子多糖脫蛋白前后紫外可見(jiàn)光譜圖如圖3所示。由圖3可以看出，未進(jìn)行脫蛋白時(shí)，香椿子粗多糖在260～280 nm處有一個(gè)吸收峰，說(shuō)明存在蛋白質(zhì)和核酸；而脫蛋白后的香椿子粗多糖在260～280 nm處沒(méi)有出現(xiàn)吸收峰，表明沒(méi)有蛋白質(zhì)和核酸的存在，進(jìn)一步說(shuō)明了通過(guò)聚酰胺法對(duì)香椿子多糖進(jìn)行脫蛋白處理，可以達(dá)到很好的效果。

圖2 不同方法對(duì)多糖保留率和蛋白質(zhì)去除率的影響 圖3 香椿子多糖脫蛋白前后紫外可見(jiàn)光譜圖

2.2 香椿子多糖活性炭脫色工藝研究

(1)活性炭脫色的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果。活性炭不同單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)香椿子多糖的脫色率和多糖保留率的影響結(jié)果如圖4所示。

①活性炭添加量對(duì)脫色效果的影響。由圖4a可知，香椿子多糖的脫色率和前期活性炭的用量呈現(xiàn)的曲線呈正相關(guān)的關(guān)系，當(dāng)活性炭用量增多，脫色率會(huì)增大，但是當(dāng)用量高于1.5%時(shí)，脫色率增加的速率會(huì)降低，而香椿子多糖保留率后期下降的速度較為緩慢，可能是因?yàn)楹笃诩尤肓诉^(guò)量的活性炭，從而對(duì)多糖產(chǎn)生吸附[25]，所以，活性炭的加入量選擇范圍為1.0%～2.0%。

②脫色溫度對(duì)脫色效果的影響。由圖4b可知，隨著脫色溫度的升高，香椿子多糖脫色的增長(zhǎng)速率先增大后減小。當(dāng)60 ℃時(shí)，香椿子多糖脫色的速率達(dá)到了最大化,隨后其脫色速率呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，這可能是因?yàn)闇囟容^高時(shí)，加快了分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致色素分子與活性炭達(dá)到飽和效果[23]。而另一方面，隨著溫度的上升，多糖保留率下降的趨勢(shì)較為明顯，可能是溫度升高，導(dǎo)致多糖活性喪失，從而影響其保留率,所以脫色溫度選擇為50 ℃～70 ℃。

③脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響。由圖4c可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，香椿子多糖的脫色率呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)。當(dāng)時(shí)間大于1 h時(shí)，其脫色率上升的速率減慢，原因可能是活性炭對(duì)多糖中的色素的吸附達(dá)到了飽和狀態(tài)[23]，從而使色素的脫除率降低。多糖保留率在1～2 h內(nèi)降低趨勢(shì)較小。

④pH對(duì)脫色效果的影響。由圖4d可知，在pH為5時(shí)，香椿子多糖保留率達(dá)到最大；隨著pH值的增大，其脫色率在不斷地降低，這說(shuō)明了樣液偏酸性時(shí)，活性炭對(duì)香椿子多糖中的色素吸附作用較好。因此，選擇樣液pH范圍為4～6。

圖4 不同單因素(活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間、pH)對(duì)脫色率和多糖保留率的影響

(2)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。活性炭脫色正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。活性炭脫色方差分析結(jié)果如表3所示。根據(jù)表2和表3可知，在活性炭法對(duì)香椿子多糖進(jìn)行脫色的試驗(yàn)中，綜合評(píng)分的影響因素大小順序?yàn)椋篊>B>D>A，即脫色時(shí)間對(duì)脫色效果影響最大，其次為脫色溫度，然后是pH，活性炭添加量影響最小。香椿子多糖活性炭法脫色的最優(yōu)工藝：A3B2C1D1，即活性炭用量達(dá)到2.0%，脫色溫度為60 ℃，脫色時(shí)間為1 h，pH為4。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次脫色驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到香椿子多糖保留率80.23%，脫色率64.58%，表明試驗(yàn)所確定的最優(yōu)脫色工藝條件可靠。

2.3 香椿子多糖的抗凝血活性研究

STSP對(duì)APTT、PT、TT的影響如表4所示。從表4可以看出，與生理鹽水比較，STSP對(duì)APTT的影響較弱。隨著其質(zhì)量濃度的增加，APTT的時(shí)間增加幅度不是很大，說(shuō)明香椿子多糖不是通過(guò)參與內(nèi)源性凝血途徑來(lái)發(fā)揮抗凝血作用；在質(zhì)量濃度2～4 mg/mL范圍內(nèi)，STSP對(duì)PT和TT的影響達(dá)到顯著性水平(P<0.01或P<0.05)。當(dāng)香椿子多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，與生理鹽水相比，STSP可以顯著地延長(zhǎng)PT和TT的時(shí)間，分別延長(zhǎng)了47.66%和36.86%。說(shuō)明香椿子多糖具有較好的抗凝血活性，其可通過(guò)參與外源性凝血途徑或共同途徑來(lái)發(fā)揮抗凝血作用。

表2 活性炭脫色正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 活性炭脫色方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00

表4 STSP對(duì)APTT、PT、TT的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，n=3。其中：**表示與生理鹽水相比P<0.01；*表示與生理鹽水相比0.01

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用3種脫蛋白方法對(duì)香椿子粗多糖進(jìn)行脫蛋白處理，對(duì)比其他兩種方法，聚酰胺法對(duì)香椿子多糖脫蛋白效果較好，多糖保留率為88.09%，蛋白質(zhì)去除率為68.15%；采用活性炭法對(duì)脫蛋白后的香椿子多糖進(jìn)行正交L9(34)優(yōu)化脫色工藝研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活性炭用量達(dá)到2.0%，脫色溫度為60 ℃，脫色時(shí)間為1 h，pH為4時(shí)，其脫色效果最好，在此條件下多糖保留率為80.23%，脫色率為64.58%。體外抗凝血實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)聚酰胺法，最優(yōu)活性炭工藝處理后制備得到的香椿子多糖具有一定的抗凝血活性作用，表明其是通過(guò)影響外源性凝血途徑或共同途徑來(lái)發(fā)揮抗凝血作用的。研究結(jié)果可為香椿子粗多糖純化及抗凝血活性的研究提供基礎(chǔ)。