蝦虹彩病毒TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法的建立

韋信賢 陳孝宇 賈鵬 王瑞 譚紅連 楊慧贊 童桂香 黃光華

摘要：【目的】建立檢測蝦虹彩病毒（SIV）的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR，為實現蝦虹彩病毒病（SIVD）快速診斷及疫情監測提供一種新的技術手段。【方法】根據SIV的MCP基因保守序列設計特異性引物和TaqMan-MGB探針，將目的片段克隆至pMD18-T載體制備重組質粒pMD18-T-MCPSIV;優化反應體系及擴增條件后建立檢測SIV的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR，以pMD18-T-MCPSIV為標準品繪制標準曲線，并通過特異性、敏感性、重復性試驗及臨床應用驗證其實用性。【結果】制備的重組質粒（pMD18-T-MCPSIV）DNA穩定性好，滿足作為標準品的要求;標準品起始模板范圍為2.0×101～2.0×109拷貝/反應時，建立的標準曲線具有良好線性關系。優化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR靈敏度高，對重組質粒的檢測靈敏度可達20拷貝/反應，對蝦組織SIV的檢測靈敏度約10拷貝/mg，其臨床檢測的敏感性與套式PCR相當;與蝦類其他常見病原無交叉反應，組內和組間變異系數分別為0.27%～0.54%和0.61%～0.95%，且擴增與產物分析同步完成，整個檢測過程僅需1 h左右。采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與目前農業農村部推薦的套式PCR同時對276份臨床蝦樣品進行SIV檢測，結果顯示，兩種方法的大部分檢測結果一致，符合率為98.6%，但檢測低拷貝數樣品時前者具有更高的靈敏度。2018和2019年廣西蝦樣品的SIV陽性檢出率分別為19.7%和7.5%，且養殖凡納濱對蝦、羅氏沼蝦和紅螯螯蝦均檢測到SIV陽性。【結論】基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好、定量范圍寬及簡單快速等優點，適用于蝦類樣品SIV檢測，可為SIVD快速診斷及疫情監測提供一種新的技術手段。

關鍵詞： 蝦虹彩病毒（SIV）;MCP基因;TaqMan-MGB探針;熒光定量PCR;套式PCR

中圖分類號： S945.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0404-08

Development of TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR for detection of shrimp iridescent virus

WEI Xin-xian1， CHEN Xiao-yu2， JIA Peng3， WANG Rui1， TAN Hong-lian1，

YANG Hui-zan1， TONG Gui-xiang1*， HUANG Guang-hua1*

（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning? 530021， China; 2Technology Center of Wuhan Customs， Wuhan 430050， China; 3Shenzhen Customs/State Key Quarantine Laboratory of Aquatic Animal Diseases， Shenzhen， Guangdong? 518045， China）

Abstract：【Objective】The TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR detection method for shrimp iridescent virus（SIV） was developed in order to provide a new detection technology for clinical diagnosis and epidemic monitoring of shrimp iridescent virus disease（SIVD）. 【Method】A pair of specific primers and a fluorogenic-labeled TaqMan-Minor Groove Binder（TaqMan-MGB） probe were designed based on the conserved sequence of MCP gene in SIV， and the target fragments were cloned into the pMD18-T vector to construct pMD18-T-MCPSIV recombinant plasmids. Then the TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR detection method was developed after optimizing reaction system and amplification， the standard curve was established for quantitative analysis with pMD18-T-MCPSIV as standards and the specificity， sensitivity， reproducibility tests and detection of clinical samples were carried out to evaluate the applicability of this method. 【Result】The prepared recombinant plasmid DNA of pMD18-T-MCPSIV had good stability and could meet the requirements of the standards， and the standard curve showed a good linear relationship with quantitative range from 2.0×101 to 2.0×109 copies/reaction. The optimized TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR method had a high sensitivity with the detection limit as low as to 20 copies/reaction for the pMD18-T-MCPSIV and approximately 10 copies/mg for the shrimp tissue samples， and its clinical detection sensitivity was comparable to nested PCR. It had no cross reaction with common shrimp pathogens， the variation coefficients of intra-group and inter-group were 0.27%-0.54% and 0.61%-0.95%， amplification could be completed together with products analysis and the entire detection could be completed within 1 h for a single sample. The TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR and nested PCR method recommended by Ministry of Agriculture and Rural Affairs were adopted to detect 276 clinical samples， the results showed that most of the results were the same with coincidence rate of 98.6%. But TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR had better sensitivity in detecting samples with low copies SIV. The SIV positive rates of Guangxi were 19.7% in 2018 and 7.5% in 2019， respectively. SIV positive samples were detected in aquaculture Litopenaeus vannamei， Macrobrachium rosenbergii and Cherax quadricarinatus. 【Conclusion】The TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR assay based on MCP gene conservative sequence in SIV developed in the study is fast， sensitive， specific， reproducible and of wide quantitative range， making it an ideal method for detecting SIV in shrimp clinical samples and a new technique for the diagnosis and monitoring of SIVD.

Key words： shrimp iridescent virus（SIV）; MCP gene; TaqMan-MGB probe; fluorescence quantitative PCR; nes-ted PCR

Foundation item：Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204081-4）; Guangxi Key Research and Development Project（Guike AB16380035）; Independent Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture（19-A-03-03）; Scientific Research Project of Wuhan Customs（2019WK003）

0 引言

【研究意義】蝦血細胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV）是近年發現的一種新型虹彩病毒，與紅螯螯蝦虹彩病毒（Cheraxquadricarinatus iridovirus，CQIV）的基因組序列相似性達99%，但現有的檢測方法尚無法將二者區分，故統稱為蝦虹彩病毒（Shrimp iridescent virus，SIV）（Xu et al.，2016;Li et al.，2017;Qiu et al.，2017，2018b）。SIV可感染凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦和中國對蝦等多種經濟養殖蝦類并引起大規模死亡，還能感染浮游生物、河蝦、鯽、螺螄及河蟹等常見水生生物成為傳染源傳播病毒（Xu et al.，2016;王甘翔等，2018;Qiu et al.，2019）。近年來，從我國沿海多個省（市）的蝦類監測樣品中檢測出SIV，檢出品種包括凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、中國對蝦、紅螯螯蝦和克氏原螯蝦等主要養殖蝦類品種，表明SIV已成為我國蝦類養殖業面臨的新威脅（李清和陳家永，2017）。目前針對病毒病尚無有效的治療方法，主要采取避免接觸感染的預防措施，而這又依賴于病毒傳染源的快速檢測。因此，建立一種快速、準確的SIV檢測方法，可為親蝦篩選、蝦苗檢疫及疫情監測等提供重要技術手段，對有效防控SIV感染引起的蝦類病害具有重要意義。【前人研究進展】隨著SIV基因組序列測定的完成與發布及SIV檢測的需求（Li et al.，2017），SIV快速檢測技術如套式PCR、TaqMan探針定量PCR和LAMP等相繼問世（Qiu et al.，2017，2018a;鄭曉葉等，2018）。在實際檢測工作中，套式PCR雖敏感性高，但需兩輪PCR及電泳，操作繁瑣，檢測耗時長且多次開蓋極易交叉污染;TaqMan探針定量PCR由于探針長度太長，敏感性不夠理想;LAMP具有靈敏、快速的特點，但在實驗室條件下易出現假陽性。TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針3'端連上不發光的淬滅基團MGB（Minor groove binder）結合物，與TaqMan探針相比具有探針長度短、穩定性好及分辨率高等特點（Letertre et al.，2003;施開創等，2018;童桂香等，2019），憑借其技術優勢在各種病原體檢測中已得到廣泛應用。劉俊等（2009）建立的一步TaqMan-MGB熒光定量PCR能有效鑒別豬瘟野毒株和HCLV疫苗株，且特異性好、靈敏度高;劉毅等（2014）基于犬細小病毒（CPV）VP2基因的保守區域建立了快速檢測CPV的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法;聶福平等（2017）建立了可鑒別牛結節性皮膚病病毒（LSDV）的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法;施開創等（2018）建立針對黏菌素耐藥基因mcr-1的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法，為臨床監控mcr-1基因攜帶細菌提供了技術支持;孫菲等（2018）建立了快速檢測耐藥結核分枝桿菌的多重TaqMan-MGB探針檢測體系，可同時檢測6個結核突變位點。在水生生物病毒檢測方面，馬冬梅等（2011）建立了檢測大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（LBUSV）的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR;韋信賢等（2011a）建立了檢測對蝦桃拉綜合征病毒（TSV）的TaqMan-MGB探針熒光定量RT-PCR;童桂香等（2019）建立了檢測致對蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR。【本研究切入點】鑒于現有SIV檢測方法的不足及TaqMan-MGB探針應用于熒光定量PCR的優勢，將TaqMan-MGB探針應用于SIV檢測有助于實現蝦虹彩病毒病（SIVD）的快速診斷及有效防控，但至今未見采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測SIV的相關報道。【擬解決的關鍵問題】建立并優化針對SIV的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法，提高SIV的檢測效率和敏感性，為實現SIVD快速診斷及疫情監測提供一種新的技術手段。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

SIV、白斑綜合征病毒（WSSV）、傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）、蝦肝腸胞蟲（EHP）及VpAHPND等陽性材料均由廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室鑒定并保存（童桂香等，2013，2014，2019）;健康無SIV感染凡納濱對蝦采自國家級廣西SPF凡納濱對蝦良種場;276份蝦樣品主要采自廣西欽州、北海、防城港、南寧和來賓等地的養殖場，品種有凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦和克氏原螯蝦，其中2018年收集142份樣品、2019年收集134份樣品。

動物組織基因組DNA快速提取試劑盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素、大腸桿菌DH5α感受態細胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質粒小量提取試劑盒購自北京艾德萊生物技術有限公司;pMD18-T載體克隆試劑盒和Probe qPCR Mix購自寶生物工程（大連）有限公司;瓊脂糖購自英韋創津生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。熒光定量PCR儀（Mx3005P）購自安捷倫科技有限公司。

1. 2 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法的建立

1. 2. 1 引物與TaqMan-MGB探針設計及合成 SIV主衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）基因中含有許多高度保守的結構域（Tidona et al.，1998），故本研究以SIV的MCP基因為檢測靶基因。采用Primer Express v3.0按熒光定量PCR引物和TaqMan-MGB探針的設計原則，在MCP基因（KY681039）保守區域設計多組特異性的擴增引物和TaqMan-MGB探針，其中，TaqMan-MGB探針5'端標記熒光染料FAM、3'端標記MGB基團，并通過NCBI數據庫進行BLAST同源性比對分析后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。經試驗初篩，選擇一套效果較好的引物及TaqMan-MGB探針（表1）用于SIV熒光定量PCR檢測方法的建立。

1. 2. 2 病原DNA提取及重組質粒標準品制備 取50 mg陽性病料組織，按照動物組織基因組DNA快速提取試劑盒說明提取蝦類常見病原SIV、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的DNA，然后加入50 μL洗脫緩沖液（EB）溶解DNA，-20 ℃保存備用。參照韋信賢等（2011b）的研究方法制備重組質粒（pMD18-T-MCPSIV）標準品，提取重組質粒DNA，采用核酸蛋白分析儀測定其濃度并轉換為拷貝數;將重組質粒DNA以10倍梯度稀釋至1.0×100 ～1.0×109拷貝/μL作為標準品，-20 ℃保存備用。

1. 2. 3 熒光定量PCR反應條件優化 選用3個梯度（1.0×109、1.0×105、1.0×101拷貝/μL）的標準品DNA為模板，按試劑說明在56～64 ℃范圍內，采用1 ℃的溫度梯度進行熒光定量PCR擴增，以獲得較低閾值循環數（Ct）和較高相對熒光強度增加值（ΔRn）時的溫度為最佳退火溫度。同時，以3個梯度（1.0×109、1.0×105、1.0×101拷貝/μL）的標準品DNA為模板，采用不同的引物終濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 μmol/L）與TaqMan-MGB探針終濃度（0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L）組合進行熒光定量PCR擴增，以獲得較低Ct和較高ΔRn時的濃度組合為最佳引物和探針濃度組合。

1. 2. 4 標準曲線建立及敏感性試驗 以10個梯度（1.0×109 ～1.0×100拷貝/μL）的標準品DNA為模板，采用優化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR進行擴增;利用儀器自帶的數據分析軟件進行分析，建立起始模板拷貝數（x）對數與Ct（y）間的標準曲線和線性回歸方程，并根據各標準品DNA擴增結果判斷該方法的定量范圍和敏感性。

1. 2. 5 特異性試驗 分別以SIV、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的DNA為模板，采用優化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR進行檢測，評價其特異性。

1. 2. 6 重復性試驗 選取3個梯度（1.0×107、1.0×106、1.0×105拷貝/μL）的標準品DNA為模板，在間隔第7和第14 d分別進行重復試驗，每個梯度設3個平行，記錄各次試驗的Ct，并統計分析組內和組間的變異系數，以檢測標準品的穩定性及該方法的重復性。變異系數（CV）=標準偏差（SD）/平均數（MN）。

1. 3 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

按1.2.2提取SIV陽性病料組織的DNA，以10倍梯度進行稀釋（100～10-5），取2 μL各梯度DNA為模板，進行TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR擴增（農業農村部SIV監測計劃推薦方法），比較二者的敏感性。

1. 4 臨床樣品檢測試驗

按1.2.2提取臨床樣品總DNA，分別采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR對276份臨床樣品（凡納濱對蝦、紅螯螯蝦、羅氏沼蝦和克氏原螯蝦）進行SIV檢測，比較檢測結果以檢驗TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的臨床實用性。

2 結果與分析

2. 1 重組質粒標準品制備

采用PCR擴增SIV的MCP基因，獲得的目的條帶大小與預期結果一致（圖1）。回收純化目的片段后克隆至pMD18-T載體，即獲得重組質粒pMD18-T-MCPSIV。以重組質粒pMD18-T-MCPSIV轉化DH5α感受態細胞，經擴大培養后進行PCR鑒定及測序分析，確定所得的目的基因序列與GenBank已公布MCP基因部分序列的同源性達100%，說明MCP基因片段已正確連接至pMD18-T載體上。取陽性克隆菌液提取質粒，測定其濃度并轉換為拷貝數，重組質粒pMD18-T-MCPSIV濃度為4.62×109拷貝/μL，滿足標準品的要求。

2. 2 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應條件的優化結果

經比較不同退火溫度及不同引物和TaqMan-MGB探針濃度組合的擴增效果，最終確定TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應體系20.0 μL：Probe qPCR Mix（2×）10.0 μL，ROX Reference DyeⅡ0.2 μL，上、下游引物SIV-qF1/SIV-qR1（10 μmol/L）各0.8 μL，TaqMan-MGB探針（5 μmol/L）1.6 μL，DNA模板2.0 μL，以滅菌ddH2O補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性30 s;95℃ 5 s，58 ℃ 45 s，進行40個循環;在58 ℃結束時收集熒光信號。

2. 3 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴增標準曲線及其敏感性

以10倍梯度稀釋的標準品DNA為模板進行TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴增，結果（圖2）顯示，高濃度標準品（1.0×109～1.0×104拷貝/μL）的擴增曲線呈明顯S形，低濃度標準品（1.0×103～1.0×100拷貝/μL）的擴增曲線因未達擴增平臺期呈半S形，各梯度標準品DNA的擴增曲線重復性好、熒光強度增量明顯、間距均勻;標準品DNA濃度為1.0×109～1.0×101拷貝/μL時，建立的標準曲線線性關系良好（圖3），對應的線性回歸方程為y=-3.249*log（x）+38.98，Eff.（擴增效率）和RSq（相關系數方值）分別為103.1%和1.000。可見，建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對標準品的擴增效率高，起始模板范圍為2.0×101～2.0×109拷貝/反應時，其標準曲線能準確反映目的產物的擴增結果，可用于定量分析。

經分析發現，標準品DNA為20拷貝/反應時，3個重復的Ct分別為34.91、35.04和35.04，仍有明顯的擴增曲線（圖2），且重復性好;標準品DNA為2拷貝/反應時，3個重復的Ct分別為37.47、38.85和38.98，重復性較差。因此，確定TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的靈敏度約20拷貝/反應。為確保檢測結果的準確性，使用該方法檢測SIV時建議以35.00為Ct的臨界值，若檢測樣品的Ct小于或等于35.00，且有擴增曲線，則判為SIV陽性;Ct大于35.00，且有擴增曲線，需重復1次，如結果一致則判為SIV陽性;Ct大于35.00，重復結果未出現擴增曲線，則判為SIV陰性。

2. 4 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的特異性

采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對蝦類常見病原（SIV、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND）的DNA進行檢測，結果顯示只有SIV出現擴增曲線（圖4），Ct分別為15.78、15.82和15.84，判為陽性;而其他病原均未出現擴增曲線，判為陰性。說明建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對SIV檢測具有很強的特異性。

2. 5 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的重復性

1.0×107、1.0×106、1.0×105拷貝/μL 3組標準品的重復性試驗結果見表2，其組內變異系數為0.27%～0.54%，組間變異系數為0.61%～0.95%，表明建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR重復性和重現性均很好，檢測結果穩定可靠;同時說明本研究制備的重組質粒DNA穩定性好，可作為標準品和陽性對照使用。

2. 6 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR分別對10倍梯度稀釋的SIV陽性DNA（100～10-5）進行檢測，結果（圖5和圖6）顯示，兩種方法均可檢測到10-4稀釋度的陽性DNA，即TaqMan-MGB探針熒光定量PCR可達到套式PCR的敏感度。

2. 7 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR檢測臨床樣品的結果比較

分別采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR對276份臨床蝦樣品進行檢測，檢測結果見表3。其中，有34份蝦樣品的兩種檢測結果均呈陽性，Ct為18.95～34.29，根據線性回歸方程y=-3.249*log（x）+38.98計算可知，其SIV拷貝數在2.76×101～1.46×106 拷貝/反應，蝦樣品組織中的SIV含量為1.38×101～7.30×105 拷貝/mg;有3份蝦樣品的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測呈陽性而套式PCR檢測呈陰性，Ct為35.87～36.42，其SIV拷貝數在9.06×100～6.14×100拷貝/反應，蝦樣品組織中的SIV含量為4.53×100～3.10×100 拷貝/mg;有238份蝦樣品的兩種檢測結果均為陰性。說明在實際檢測工作中進行40個循環時，采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測蝦組織SIV的靈敏度約10拷貝/mg。2018和2019年廣西蝦樣品的SIV陽性檢出率分別為19.7%（28/142）和7.5%（10/134），且養殖凡納濱對蝦、羅氏沼蝦和紅螯螯蝦均檢測到SIV陽性。

3 討論

SIV感染養殖凡納濱對蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦等蝦類可造成較高的死亡率，給蝦類養殖業造成巨大經濟損失。SIV具有多種易感宿主，且存在明顯的跨物種傳播趨勢，給其防控帶來極大挑戰（陳形，2019）。雖然SIVD至今尚未被世界動物衛生組織（OIE）收錄，但我國從2017年起已將其納入《國家水生動物疫病監測計劃》。因此，快速、準確檢測SIV感染對有效防控SIVD流行具有重要意義。目前，OIE和國內均未發布SIV檢測的相關標準，僅農業農村部在SIVD監測計劃中推薦采用套式PCR進行檢測。在實際檢測工作中，套式PCR存在操作繁瑣、檢測耗時長、不可定量等缺點，尤其在PCR分區條件有限的實驗室極易形成氣溶膠污染環境而出現假陽性。TaqMan-MGB探針熒光定量PCR不僅能發揮熒光定量PCR的優勢而克服套式PCR的缺點，其探針的MGB基團相對于TaqMan探針還有利于提高方法的靈敏度，非常適用于對靈敏度要求高的病原體定量檢測（Afonina et al.，1997）。

本研究根據SIV MCP基因的保守性及TaqMan-MGB探針的優勢，在MCP基因保守序列設計特異性引物及TaqMan-MGB探針，制備重組質粒pMD18-T-MCPSIV標準品，并對引物和探針使用濃度及退火溫度進行優化，建立了檢測SIV的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR。結果表明，制備的重組質粒DNA穩定性好，滿足作為標準品和陽性對照的要求;起始模板范圍為2.0×101～2.0×109拷貝/反應時，建立的標準曲線具有良好的線性關系，能準確反映目的產物的擴增結果;優化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR靈敏度高，對重組質粒的檢測靈敏度可達20拷貝/反應，對蝦組織SIV的檢測靈敏度約10個拷貝/mg，其臨床檢測的敏感性與套式PCR相當;特異性強，與蝦類其他常見病原無交叉反應;重復性好，組內和組間變異系數均小于1.00%;且擴增與產物分析同步完成，整個檢測過程僅需1 h左右。可見，本研究建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR不僅能滿足臨床上對SIV檢測技術高靈敏度的需求，還具有操作簡單、檢測快速及可定量分析等優點。

采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與目前農業農村部推薦的套式PCR同時對276份臨床蝦樣品進行檢測，結果顯示，兩種方法的大部分檢測結果一致，符合率為98.6%，同為陽性檢測結果的蝦樣品含SIV拷貝數較高，而檢測結果不一致的蝦樣品含SIV拷貝數均較低（低于10拷貝/mg）;TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的陽性檢出率較套式PCR稍高，即發揮出TaqMan-MGB探針提高擴增效率及靈敏度的優勢。說明采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測SIV高拷貝數樣品時準確性高，而檢測低拷貝數樣品時較套式PCR具有更高的靈敏度，可為SIVD臨床診斷及疫情監測提供一種新的技術手段。此外，從養殖蝦樣品的檢測結果來看，2018和2019年廣西蝦樣品的SIV陽性檢出率分別為19.7%和7.5%，且養殖凡納濱對蝦、羅氏沼蝦和紅螯螯蝦均檢測到SIV陽性，與實際調研發現2018—2019年廣西出現多例養殖凡納濱對蝦和紅螯螯蝦因暴發SIVD引起大量死亡的情況相符，說明SIV已成為危害廣西養殖蝦類的主要病原之一，尤其是SIV在蝦體中攜帶和潛伏感染情況應引起有關部門及相關從業者的高度重視。

4 結論

基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好、定量范圍寬及簡單快速等優點，適用于蝦類樣品SIV檢測，可為SIVD快速診斷及疫情監測提供一種新的技術手段。

參考文獻：

陳形. 2019. 十足目虹彩病毒1（DIV1）的易感宿主調查[D]. 上海：上海海洋大學. [Chen X. 2019. Susceptible host survey of decapod iridescent virus 1（DIV1）[D]. Shanghai：Shanghai Ocean University.]

李清，陳家永. 2017. 2017年我國水生動物重要疫病病情分析[M]. 北京：中國農業出版社：187-204. [Li Q，Chen J Y. 2017. Analysis of important aquatic animal diseases in China in 2017[M]. Beijing：China Agriculture Press：187-204.]

劉俊，王琴，范學政，徐璐，趙啟祖，黃偉，湯波，沙莎，周遠成，陳蕾，鄒興啟. 2009. 豬瘟病毒野毒株TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應用[J]. 中國農業科學，42（12）：4366-4371. [Liu J，Wang Q，Fan X Z，Xu L，Zhao Q Z，Huang W，Tang B，Sha S，Zhou Y C，Chen L，Zou X Q. 2009. Differentiation of wild-type viruses and HCLV vaccine of classical swine fever virus by one-step fluorescent quantitative PCR using TaqMan-MGB probe techno-logy[J]. Scientia Agricultura Sinica，42（12）：4366-4371.]

劉毅，吳志明，閆若潛，趙明軍，王東方，趙雪麗，劉梅芬，程俊貞，薛曉，李寧. 2014. 犬細小病毒TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立及應用[J]. 中國畜牧獸醫，41（6）：68-73. [Liu Y，Wu Z M，Yan R Q，Zhao M J，Wang D F，Zhao X L，Liu M F，Cheng J Z，Xue X，Li N. 2014. Establishment and application of TaqMan-MGE fluorescent-quantitative PCR assay for detection of canine parvovirus[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，41（6）：68-73.]

馬冬梅，白俊杰，鄧國成，李勝杰，張莉莉. 2011. 大口黑鱸潰瘍綜合征病毒TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 華南農業大學學報，32（2）：99-102. [Ma D M，Bai J J，Dend G C，Li S J，Zhang L L. 2011. Development of a TaqMan-MGB real time PCR assay for largemouth bass ulcerative syndrome virus detection[J]. Journal of South China Agricultural University，32（2）：99-102.]

聶福平，王昱，黃秋華，楊俊，韓雪清，唐昌杰，袁曾壯，王國民，候長軍，李應國. 2017. 牛結節性皮膚病病毒TaqMan-MGB熒光PCR檢測方法的建立[J]. 中國獸醫科學，47（9）：1129- 1134. [Nie F P，Wang Y，Huang Q H，Yang J，Han X Q，Tang C J，Yuan Z Z，Wang G M，Hou C J，Li Y G. 2017. Establishment of TaqMan-MGB real-time fluo-rescent PCR for rapid detection of lumpy skin disease virus[J]. Chinese Veterinary Science，47（9）：1129-1134.]

施開創，尹彥文，溫麗霞，屈素潔，王海清，胡杰. 2018. 黏菌素耐藥基因mcr-1 TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 南方農業學報，49（7）：1447-1452. [Shi K C，Yin Y W，Wen L X，Qu S J，Wang H Q，Hu J. 2018. Establishment of TaqMan-MGB fluorescent quantitative PCR for detection of colistin resistance gene mcr-1[J]. Journal of Southern Agriculture，49（7）：1447-1452.]

孫菲，易松林，李丹，戴佩希，彭飛武，唐連飛. 2018. 耐藥結核分枝桿菌多重TaqMan-MGB探針檢測方法的建立[J]. 廣東醫學，39（4）：511-515. [Sun F，Yi S L，Li D，Dai P X，Peng F W，Tang L F. 2018. Establishment of multiple TaqMan-MGB probe detection method for drug resistant Mycobacterium tuberculosis[J]. Guangdong Medical Journal，39（4）：511-515.]

童桂香，黎小正，韋信賢，葉欣宇，吳明媛，秦振發，蘭柳春，周靚婧. 2014. 凡納濱對蝦白斑綜合征病毒廣西株變異區基因的比較分析[J]. 病毒學報，30（1）：51-56. [Tong G X，Li X Z，Wei X X，Ye X Y，Wu M Y，Qin Z F，Lan L C，Zhou J J. 2014. Comparative analysis of variable region of white spot syndrome virus genome in penaeus vannamei in Guangxi，China[J]. Chinese Journal of Viro-logy，30（1）：51-56.]

童桂香，黎小正，吳祥慶，黃鸞玉，黃光華，韋信賢. 2019. TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測致對蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌[J]. 湖南農業大學學報（自然科學版），45（4）：405-411. [Tong G X，Li X Z，Wu X Q，Huang L Y，Huang G H，Wei X X. 2019. TaqMan-MGB probe real-time PCR for detection of Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreas necrosis disease in shrimps[J]. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Scien-ces），39（4）：405-411.]

童桂香，韋信賢，吳偉軍，吳祥慶，黃國秋，黃玉柳，葉欣宇，黎小正. 2013. 廣西凡納濱對蝦IHHNV感染情況的調查與分析[J]. 南方農業學報，44（12）：2089-2093. [Tong G X，Wei X X，Wu W J，Wu X Q，Huang G Q，Huang Y L，Ye X Y，Li X Z. 2013. Investigation and analysis of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus infection in Penaeus vannamei in Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，44（12）：2089-2093.]

王甘翔，彭頔，宋之琦，楊慶，都月娥，沈佳健. 2018. 浙江省平湖市南美白對蝦虹彩病毒病初步調查及防控措施[J]. 水產科技情報，45（3）：141-143. [Wang G X，Peng D，Song Z Q，Yang Q，Du Y E，Shen J J. 2018. Preliminary investigation and prevention and control measures for shrimp iridescent virus disease of Litopenaeus vannamei in Pinghu City，Zhejiang[J]. Fisheries Science & Technology Information，45（3）：141-143.]

韋信賢，童桂香，謝宗升，黎小正，吳祥慶，廖永志，黃國秋. 2011a. TaqMan-MGB 探針法快速檢測對蝦Taura綜合征病毒的研究[J]. 海洋科學，35（9）：37-42. [Wei X X，Tong G X，Xie Z S，Li X Z，Wu X Q，Liao Y Z，Huang G Q. 2011a. TaqMan-MGB probe real-time fluorescence quantitative RT-PCR for rapid detection of taura syndrome virus in shrimps[J]. Marine Sciences，35（9）：37-42.]

韋信賢，童桂香，謝宗升，吳祥慶，黃國秋，黃玉柳，廖永志，黎小正. 2011b. TaqMan-LNA探針熒光定量PCR快速檢測對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒[J]. 南方農業學報，42（12）：1545-1549. [Wei X X，Tong G X，Xie Z S，Wu X Q，Huang G Q，Huang Y L，Liao Y Z，Li X Z. 2011b. Rapid detection o f infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in shrimps using TaqMan-LNA probe real-time PCR[J]. Journal of Southern Agriculture，42（12）：1545-1549.]

鄭曉葉，鄭天倫，黃俊. 2018. 對蝦血細胞虹彩病毒（SHIV）熒光LAMP檢測方法的建立[C]//浙江省科學技術協會. 2018年（第十三屆）浙江漁業科技論壇論文摘要集. [Zheng X Y，Zheng T L，Huang J. 2018. Establishment of fluorescence Loop-Mediated isothermal amplification for decting shrimp hemocyte iridescent virus （SHIV）[C]// Zhejiang Fishery Science and Technology. Proceedings of 2018（the 13th） Zhejiang Fishery Science and Technology Forum.]

Afonina I，Zivarts M，Kutyavin I，Lukhtanov E，Gamper H，Meyer R B. 1997. Efficient priming of PCR with short oligonucleotides conjugated to a minor groove binder[J]. Nucleic Acids Research，25（13）：2657-2660.

Letertre C，Perelles，Dilasser F，Arar K，Fach P. 2003. Evaluation of the performance of LNA and MGB probes in 5'-nuclease PCR assays[J]. Molecular and Cellular Probes，17（6）：307-311.

Li F，Xu L M，Yang F. 2017. Genomic characterization of a novel iridovirus from redclaw crayfish Cherax quadrica-rinatus：Evidence for a new genuswithin the family Iridoviridae[J]. Journal of General Virology，98（10）：2589-2595.

Qiu L，Chen M M，Wan X Y，Li C，Zhang Q L，Wang R Y，Cheng D Y，Dong X，Yang B，Wang X H，Xiang J H，Huang J. 2017. Characterization of a new member of Iridoviridae，shrimp hemocyte iridescent virus（SHIV），found in white leg shrimp（Litopenaeus vannamei）[J]. Scientific Reports，7（1）：11834. doi：10.1038/s41598-017-10738-8.

Qiu L，Chen M M，Wan X Y，Zhang Q L，Li C，Dong X，Yang B，Huang J. 2018a. Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe based real-time PCR[J]. Journal of Invertebrate Pathology，154：95-101.

Qiu L，Chen M M，Wang R Y，Wan X Y，Li C，Dong X，Yang Bing，Xiang J H，Huang J. 2018b. Complete genome sequence of shrimp hemocyte iridescent virus（SHIV） isolated from white leg shrimp，Litopenaeus vannamei[J]. Archives of Virology，163（3）：781-785.

Qiu L，Chen X，Zhao R H，Li C，Gao W，Zhang Q L，Huang J. 2019. Description of a natural infection with decapod iridescent virus 1 in farmed giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii[J]. Viruses，11（4）. doi：10.3390/v11040354.

Tidona C A，Schnitzler P，Kehm R，Darai G. 1998. Is the major capsid protein of iridoviruses a suitable target for the study of viral evolution？[J]. Virus Genes，16（1）：59-66.

Xu L M，Wang T T，Li F，Yang F. 2016. Isolation and preliminary characterization of a new pathogenic iridovirus from redclaw crayfish Cherax quadricarinatus[J]. Diseases of Aquatic Organisms，120（1）：17-26.