石榴花揮發油的GC-MS分析及β-葡萄糖苷酶對石榴花的增香作用研究

劉錚錚,劉語,宋寧,楊廣德

(西安交通大學藥學院，西安 710061)

石榴花為石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的花，含有多酚類、黃酮類、萜類等活性成分[1]。石榴花性平、澀，可用于治療中耳炎、鼻衄、創傷出血、口臭、腋臭等；在維吾爾族醫學中素以“古麗娜”之稱而入藥，用于退翳，治神經衰弱和惡心[2]；石榴花具有降糖作用，國內外常用石榴花治療糖尿病及其并發癥[3-5]；石榴花提取物還具有抗氧化作用，能清除多種自由基和保護脂蛋白[6]。

早在1993年Angelika等[7]發現鞣花酸能明顯抑制化學物質誘導的癌變及其他多種癌變，尤其對結腸癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮膚腫瘤等抑制作用更明顯。Wang等[8]從石榴花乙醇提取物中分離到一種新多酚類物質，命名為石榴酸，該物質有抗炎和抗氧化等藥理作用，自然界中分布較廣。

王超萍[9]利用紫外分光光度法測定石榴花中總黃酮類的含量。楊彥霞等[10]從石榴花中分離出12黃酮類個化合物。郭俊明等[11]對云南石榴花色素進行研究，結果表明石榴花的色素為黃酮類成分。Zhang等[12]在石榴花中鑒定出了2種花青苷成分。

石榴花中含有少量的揮發油成分，陳志偉等[13]提取了石榴花中的揮發油，鑒定出石榴花中的揮發油成分，發現其主要成分為醛類和脂肪酸，還含有月桂烯、紅沒藥烯、法呢醇3種萜類化合物和二十一烷、二十四烷、二十五烷等5種烷烴類化合物。石榴花揮發油的體外抗氧化活性很好，可用于開發抗氧化保健品、藥品和天然保健抗氧化劑。

糖苷鍵合態香氣前體物質(glycosidically boundaroma precursors)是以糖苷的形式存在于植物中的香氣前體物質，不具有揮發性，穩定性強；在酸或酶的作用下可以釋放出游離態芳香物質[14]。β-葡萄糖苷酶又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，它屬于纖維素酶類。是一種廣泛存在于生物界的能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶，它能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。植物中以苷形式存在的非揮發性前體物質可以通過酶解作用使得香氣成分得以釋放表現出顯著的增香作用[15-16]。不僅如此，β-葡萄糖苷酶還能將果蔬及茶葉中的風味前體物質水解為具有濃郁天然風味的香氣物質[17-18]。

本實驗采用GC-MS分析石榴花揮發油化學成分，同時利用β-葡萄糖苷酶水解石榴花，以驗證β-葡萄糖苷酶對其是否具有增香作用，為石榴花資源的開發利用提供科學依據。

1 實驗材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：石榴花采于2018年7月采自西安交通大學藥學院的藥園，由西安交通大學藥學院牛曉峰教授鑒定為石榴科植物石榴(PunicagranatumL.)的花。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純)；無水硫酸鈉(西安化學試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠)；檸檬酸(成都化學試劑廠)。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質譜聯用儀(日本島津公司)；AY120電子天平(日本島津公司)；揮發油提取器(無錫久平儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應。分別稱取2份200 g新鮮石榴花于500 mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中1份加0.2 g β-葡萄糖苷酶，同時置于搖床中50 °C恒溫水浴5 h。同法制備空白溶液。

1.2.2 揮發油的提取。將200 g β-葡萄糖苷酶水解前后的石榴花分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加水800 mL，沸石數粒，搖勻，按2015年版《中國藥典》四部通則2204(揮發油測定法，甲法)提取揮發油，保持微沸4 h。讀取揮發油體積并收集所得揮發油，加入少量無水硫酸鈉，靜置。然后，稱取石榴花揮發油0.1 g置于5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，待測。

1.2.3 氣相色譜-質譜聯用的色譜條件。色譜條件：SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：He(≥99.99 %)；流速：1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；分流比：5∶1；升溫程序：色譜柱始60 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升溫至150 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升溫至200 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min；質譜：接口溫度為250 ℃，離子源溫度：230 ℃，電子轟擊源EI，電子能量：70 eV，質量掃描范圍：45～550 m/z；進樣量：1 μL；溶劑峰切除時間為2.5 min，質譜檢測起始時間為3 min。

1.2.4 數據處理。所得的色譜和質譜信息經數據處理系統與其內存譜庫(NIST)自動檢索和解析，并用峰面積歸一法測定了各化學成分在揮發油中的相對百分含量。

2 結果

采用氣相色譜-質譜聯用方法對β-葡萄糖苷酶處理前后的石榴花的揮發油提取物進行分析，鑒定出無酶石榴花和有酶石榴花揮發油各42種化合物。其總離子流圖結果如下：

圖1 無酶石榴花揮發油的GC-MS總離子流圖

圖1 有酶石榴花揮發油的GC-MS總離子流圖

通過分析比較，確定色譜條件篩選后的GC-MS方法對色譜峰可以達到較好的分離。通過計算機譜庫檢索及核對質譜圖，β-葡萄糖苷酶水解前后的石榴花揮發油提取物的化學成分分析見表1。

表1 石榴花揮發油化學成分分析表

續表1

保留時間/min化合物中文名稱分子式相對峰面積(%)無酶石榴花有酶石榴花31.539丁香酚C10H12O29.913.1234.230順式-茉莉酮C11H16O4.073.4136.074β-石竹烯C15H242.031.4837.241反式-α-香柑油烯C15H241.140.7538.684β-金合歡烯C15H240.500.2139.3402,6,10-三甲基十三烷C16H342.112.6341.743α-金合歡烯C15H247.837.9842.656β-倍半水芹烯C15H240.490.4546.962正十六烷C16H341.6514.9152.130正十七烷C17H362.527.1154.966菲C14H101.2810.0056.548正二十一烷C21H442.8715.56

β-葡萄糖苷酶處理前后石榴花揮發油成分分析：本次實驗從無酶石榴花的揮發油提取物中確證了42個化合物，從有酶石榴花的揮發油提取物中確證了42個化合物，觀察到加入β-葡萄糖苷酶前后的石榴花揮發油的成分并無變化。

由表1可知，在無酶石榴花揮發油中的含有許多醛酮類、烯烴類和醇類物質，其主要成分為苯乙醛(12.63%)、水楊酸甲酯(10.19%)、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚(10.46%)、丁香酚(9.91%)、α-金合歡烯(7.83%)、糠醛(5.93%)等。在有酶石榴花揮發油中也含有醛酮類、烯烴類和醇類物質，其主要成分為正二十一烷(15.56 %)、正十六烷(14.91%)、菲(10.00%)、α-金合歡烯(7.98 %)、水楊酸甲酯(7.22 %)、正十七烷(7.11 %)等。

通過表1的對比，可知在石榴花中β-葡萄糖苷酶存在作用。對比可知在加入β-葡萄糖苷酶后L-檸檬烯、2,6,10-三甲基十三烷、α-金合歡烯、正十六烷、正十七烷、菲、正二十一烷的相對含量分別增加0.15%、0.52%、0.15%、13.26%、4.59%、8.72%、12.69%，增長率達到55.56%、24.64%、1.92%、803.63%、182.14%、681.25%、442.16%。同時可以觀察到糠醛、苯乙醛、水楊酸甲酯、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚、丁香酚等其余物質的相對含量均出現明顯降低。

近年來，在風味科學領域內很重視研究風味物質的前二級代謝產物，如糖苷類物質。這些物質本身無香味，不揮發，但若用酶水解，即可產生濃郁的具有天然特征風味的物質[19]。天然芳香植物中糖苷化合物的研究，一直是香料化學家們感興趣的研究課題之一，并將這類物質納入“香味前驅體”(flavor precursors)[20]。一些植物由于含有很多的香精類因而表現出香味，不同的香精成分能夠表現出不同的氣味。石榴花中的許多成分可以用作香料，比如糠醛是GB 2760-96允許使用的食品用香料也是萃取溶劑，主要用于配制各種熱加工型香精，如面包、奶油硬糖、咖啡等香精；L-檸檬烯為無色液體，有似鮮花的清淡香氣，溶于乙醇和大多數非揮發性油，不溶于水，天然品存在于椒樣薄荷油、留蘭香油、松針油、桉葉油等中。苯乙醛主要用于風信子、水仙、黃水仙、甜豆花等配方中，少量用于其他花香型中，賦予青的頭香，有提調香氣的作用；癸醛用于有機合成和作香料用，常用作鳶尾、橙花、素馨、香葉、香堇、玫瑰等香精的調配原料，在制造人工香檸檬油、橙花油、玫瑰油時也少量使用。香葉醇GB2760-96規定為允許使用的食用香料，主要用以配制蘋果、桃、杏、李、草莓、檸檬、姜、肉桂、肉豆蔻和蜂蜜等香精。

加入β-葡萄糖苷酶后石榴花的香精類成分含量除L-檸檬烯皆有所下降，非香精類成分2,6,10-三甲基十三烷、正十六烷、正十七烷、菲、正二十一烷的含量有所上升，表明β-葡萄糖苷酶對石榴花的增香作用不明顯。

3 結論

實驗測定得到石榴花揮發油中42種化合物，測定了β-葡萄糖苷酶水解前后石榴花揮發油的化學成分主要以醛酮類化合物為主，為進一步開發和利用石榴花資源提供了理論依據。而β-葡萄糖苷酶則抑制了石榴花中一些香精類成分的釋放，這證明了β-葡萄糖苷酶的加入，致使一些香精類成分含量有所減少，其只能增加石榴花中的某些特定成分，如L-檸檬烯，而不能使全部香精成分的相對含量增加，故其對石榴花的增香作用并不明顯。