馬爾堡病毒GP蛋白C肽的抑制活性及作用機(jī)理研究

陳文文，鄭文鋁，余碩，花晨，戴秋云

1.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071；2.復(fù)旦大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 200433

馬爾堡病毒（Marburg virus，MARV）屬絲狀病毒屬，為單股負(fù)鏈非節(jié)段RNA 病毒，在電鏡下呈細(xì)絲狀，為烈性傳染病馬爾堡出血熱的病原體。自1967 年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在非洲多地曾多次暴發(fā)，累計(jì)出現(xiàn)460 多個(gè)感染病例，已造成380 多人死亡，病死率超過(guò)80%[1-2]，最近的一次馬爾堡出血熱疫情發(fā)生在2017 年的烏干達(dá)，導(dǎo)致3 人死亡[3]。馬爾堡病毒基因組約19 kb，由7 個(gè)獨(dú)立的開(kāi)放讀框（ORF）組成，共編碼7 個(gè)蛋白[4-5]，分別為核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、包膜糖蛋白（glyco?protein，GP）、基質(zhì)蛋白（matrix protein）VP40，以及非結(jié)構(gòu)蛋白VP24、VP30、VP35 和病毒聚合酶L（polymerase L），其中GP 是介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，也是疫苗及中和抗體的抗原或靶標(biāo)[6-10]。一般認(rèn)為，GP 亞單位GP1 負(fù)責(zé)細(xì)胞附著，GP2 催化 膜融 合[4]。 GP2 包 含 2 個(gè) 七肽重 復(fù)區(qū)，N端和C 端（分別為NHR 和CHR）在融合過(guò)程中采用六螺旋束結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)為病毒和細(xì)胞膜融合提供了熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力[11]。MARV 與埃博拉病毒（EBOV）同屬絲狀病毒，且二者的GP2 具有60%的序列同源性，總體結(jié)構(gòu)相似，病毒進(jìn)入機(jī)制可能類(lèi)似[11-13]。目前，已發(fā)現(xiàn)來(lái)自 EBOV 的 CHR 的 C 肽具有較好的進(jìn)入抑制活性，如GP610、1-chol、Tat-Ebo[14-17]，但 MARV 的 CHR 的 C 肽抑制活性未見(jiàn)報(bào)道，作用機(jī)制也不清楚。我們合成了來(lái)自MARV的CHR 區(qū)域的C 肽MP 及突變體，利用pVAX1-MGP 與pNL-4.3-Luc-R-E-質(zhì)粒包裝假病毒體系，測(cè)定各肽對(duì)假病毒融合的抑制活性；利用圓二色譜、凝膠色譜分析C 肽及其突變體對(duì)MARV 的N肽的相互作用，發(fā)現(xiàn)MARV 的C 肽與N 肽相互作用較弱，導(dǎo)致C 肽的抗病毒活性較弱，但C 肽改造后可提高活性。

1 材料和方法

1.1 材料

BHK21-WI2、293T 細(xì)胞，pVAX1-MGP 質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；pNL-4.3-Luc-R-E-質(zhì)粒由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所種輝輝老師饋贈(zèng)；Li?pofectAMINE 2000 購(gòu) 自 Invitrogen 公 司 ；96 孔細(xì) 胞培養(yǎng)板、DMEM、胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher Sci?entific 公司；細(xì)胞裂解液、螢光素酶報(bào)告試劑盒購(gòu)自Promega 公司；Rink 樹(shù)脂購(gòu)自天津南開(kāi)公司；1-羥基苯并三唑（HOBT）、苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU）、Fmoc 保護(hù)氨基酸等購(gòu)自上海吉爾生化有限公司；哌啶、二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷、無(wú)水甲醇、無(wú)水乙醚等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；三氟乙酸（TFA）、二異丙基二乙胺（DIEA）等購(gòu)自北京伊諾凱有限公司。

多肽固相合成儀（德國(guó)Zinsser analytic 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela 公司）；凍干機(jī)（德國(guó)Christ 公司）；安捷倫1200 型高效液相色譜儀（美國(guó) Agilent Technologies 公司）；Waters 1525 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó) PE 公司）；microTOF QII 質(zhì)譜儀（德國(guó) Bruker 公司）；Chirascan plus 圓二色光譜儀（英國(guó)Applied Photophysics Ltd 公司）。

1.2 多肽合成

C 肽（MP）來(lái) 源 于 MARV GP 的 CHR 區(qū) 域（611～637 殘基），MP-1 為 MP 的 N 端增加一個(gè)亮氨酸的C 肽突變體，以增加疏水相互作用；MP-2～MP-5 分別為 MP-1 的 b、f、c、g 位增加電荷相互作用氨基酸，以穩(wěn)定分子的α螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)增加C 肽與 N 肽作用的電荷相互作用；MP-6～MP-9 分別為MP 突變體N 端增加來(lái)自抗HIV 融合多肽的部分螺旋鏈（WEEILKK、WMEWDRE）[18]的突變體；MP-10 的 MT 也來(lái)自抗 HIV 融 合 多 肽[19-20]，期望增加與N 肽的相互作用。

MGP 的N 肽（MGP-N）粗品由中科亞光公司合成，其余多肽采用本實(shí)驗(yàn)室的Zinsser analytic多肽合成儀合成[21-22]。合成的0.06 mol 肽-樹(shù)脂用裂解液（TFA∶DTT∶H2O∶TIS=4.4 mL∶0.25 g∶0.25 mL∶0.1 mL）裂解，室溫?cái)嚢?3 h 脫去保護(hù)基，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分TFA，加入提前冷卻的無(wú)水乙醚，4℃靜置半小時(shí)，抽濾得粗肽。粗肽經(jīng)HPLC 純化，純化柱為 Kromasil-C18 柱（100 ?，10 μm，10 mm×250 mm），0.1%三氟乙酸的水及乙腈梯度洗脫，凍干得純肽干粉。純化后的多肽經(jīng)分析型HPLC 分析［色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。梯度：0～1 min，5% ～10% B；1～25 min，10% ～50% B。 A 為 含0.1% TFA 的水，B 為含 0.1% TFA 的乙腈，流速 1 mL/min，波長(zhǎng)214 nm］，最后用質(zhì)譜儀測(cè)定多肽的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3 假病毒的制備

參考實(shí)驗(yàn)室之前研究的馬爾堡假病毒包裝策略[23]，轉(zhuǎn)染前1 h 用Opti-DMEM 培養(yǎng)基處理細(xì)胞，pVAX1-MGP 與 pNL4-3.Luc.R-E-質(zhì)粒按 1∶2 的比例共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，72 h 后收獲上清，添加FBS 至20%，0.2 μm 濾膜過(guò)濾，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 抑制劑活性測(cè)定

假病毒與不同濃度的抑制劑等體積混合，各50 μL/孔加入96 孔板中，陰性對(duì)照組加入等體積的H2O，37℃孵育30 min 備用。胰酶消化BHK21-WI2 細(xì)胞，用含2% FBS 的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至2×105/mL，向孵育后的96 孔板中每孔加入50 μL 細(xì)胞稀釋液，48 h 后裂解細(xì)胞，檢測(cè)相對(duì)發(fā)光值RLU，計(jì)算假病毒抑制率，用GraphPad-Prism 5 軟件計(jì)算各抑制劑的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.5 圓二色譜測(cè)定

用0.01 mol/L 的磷酸緩沖液（pH7.2）配制各多肽溶液及N 肽與各C 肽、突變體的混合物溶液（終濃度均為35 μmol/L）。圓二色譜在室溫下測(cè)定，λ=190～260 nm，d=1 mm，空白對(duì)照為 0.01 mol/L 磷酸緩沖液，重復(fù)3 次取平均值并計(jì)算摩爾橢圓度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin 軟件進(jìn)行繪圖及處理，用下式計(jì)算各多肽的α螺旋含量[24-25]：

α螺旋含量=（-[θ]222-2340）/30300

1.6 凝膠色譜排阻法測(cè)定MGP-N與C肽及突變體的相互作用

MGP-N、C 肽及C 肽突變體分別用磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH7.2）稀釋至 0.2 mmo/L，各取30 μL 上樣，流速 0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，色譜柱為 TSK-G2000SWxl 柱（日本 Tosoh Biosci?ence LLC 公司）。C 肽、突變體與 MGP-N 復(fù)合物的高壓凝膠色譜條件同上，但等體積的MGP-N 與C 肽、突變體混合后，37℃水浴中孵育30 min 后上樣（60 μL）。

2 結(jié)果

2.1 多肽的純化及鑒定

各多肽（表1）純度大于95%，部分多肽的HPLC 分析圖及質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1、2，相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定結(jié)果與理論計(jì)算一致。

2.2 C肽及突變體的抑制活性

各抑制劑IC50見(jiàn)圖3、表1。結(jié)果顯示，MARV的GP 蛋白C 肽對(duì)MARV 有一定的抑制活性，但抑制活性較差（IC50=32.67 μmol/L），其突變體活性IC50=9.61～33.47 μmol/L，其中 MP-4 的活性最高。抑制劑 MP-8 濃度≥20 μmol/L 時(shí)，顯著影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，細(xì)胞毒性較高，未進(jìn)行后續(xù)活性檢測(cè)。

表1 MARV的C肽氨基酸序列及抑制活性

2.3 C肽、N肽及混合物的圓二色譜

典型多肽及混合肽圓二色譜結(jié)果見(jiàn)圖4，α螺旋含量計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表 2。除 MP-6～MP-8 外，C 肽及 N 肽本身的α 螺旋含量低（0.30%～6.85%）（表2），在N 端增加螺旋鏈后（MP-6～MP-8），α螺旋含量提高（33.66%～69.77%），顯著高于其他C 肽。N肽與C 肽混合后形成了典型的α螺旋結(jié)構(gòu)，MP、MP-1～MP-5 及 MP-9～MP-10 與 N 肽混合后α螺旋顯著增加（16.23%～29.23%）,但 MP-6～MP-8 與MGP-N 混合后α螺旋含量變化不大。

圖1 部分多肽的HPLC 分析圖

圖2 部分多肽的質(zhì)譜圖

圖3 部分多肽的IC50 結(jié)果

圖4 N 肽、C 肽及其復(fù)合物的圓二色譜

2.4 N肽、C肽及混合物的凝膠排阻色譜

部分多肽及復(fù)合物的凝膠排阻色譜結(jié)果見(jiàn)圖5。N 肽與MP-6、MP-7 的出峰時(shí)間明顯早于其他肽，且N 肽峰高很低，顯示上述多肽可能形成了聚合體。N 肽與 MP、MP-1～MP-4、MP-9～MP-10 復(fù)合物凝膠排阻色譜結(jié)果類(lèi)似（圖未列出），沒(méi)有出現(xiàn)明顯的多肽與MGP-N 復(fù)合物洗脫峰，但N肽與MP-5、MP-6 混合后出現(xiàn)了新的洗脫峰，說(shuō)明有部分復(fù)合物的形成。

3 討論

MP 的抑制活性較弱（IC50=32.67 μmol/L），通過(guò)增加 b、f、c、g 位的電荷相互作用可以提高 C 肽的活性，如 MP-4 的抑制活性（IC50=9.61 μmol/L）為MP、MP-1（IC50分別為32.67、33.47 μmol/L）的3倍多。然而，C 肽或復(fù)合物的α螺旋含量提高與活性的增加并無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系，如MP-6 的α螺旋含量較MP-4 有顯著提高，但抑制活性（IC50=15.82 μmol/L）低于MP-4。

表2 多肽及混合物α螺旋含量

圖5 多肽及其復(fù)合物凝膠排阻色譜

凝膠排阻色譜結(jié)果顯示，MP-6 及MP-7 自身也發(fā)生了聚集，可能與其N(xiāo) 端引入的螺旋序列有關(guān)。MP-5、MP-6 與N 肽混合后形成的新峰并未最先出峰，說(shuō)明其多聚體并不大。N 肽的自聚集作用且α螺旋率低，可能影響了其與C 肽形成六束α螺旋，導(dǎo)致C 肽的抗病毒活性較低。

此外，在抑制劑活性檢測(cè)過(guò)程中，抑制劑濃度大于70 μmol/L 時(shí)，顯著影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)，48 h 后檢測(cè)，RLU 值遠(yuǎn)大于陽(yáng)性對(duì)照組，可能是高濃度的抑制劑破壞了細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致病毒更易進(jìn)入細(xì)胞。

總之，馬爾堡病毒包膜糖蛋白的C 肽抗病毒活性較弱，C 肽與N 肽相互作用較弱，C 肽改造后活性提高。本工作可為馬爾堡病毒抑制劑的設(shè)計(jì)提供參考。