利用SRAP標記研究繁殖群體量對芝麻種質資源遺傳完整性的影響

孫建 顏廷獻 葉艷英 梁俊超 樂美旺 饒月亮 顏小文 周紅英

摘? 要：研究繁殖群體量對芝麻種質資源遺傳完整性的影響，以確定適宜的繁殖群體量，為種質資源更新繁殖提供理論參考。利用SRAP分子標記技術對育成品種和地方種質2種不同類型的芝麻種質資源的不同群體量的遺傳參數進行分析。結果顯示：（1）育成品種：隨機抽取了10、15、20、25、30、35和40株的7個群體量梯度，24對引物共擴增到DNA位點525個，平均每對引物擴增21.88個，多態性位點24個，占總位點數的4.57%。隨著群體量的不斷增加，擴增總位點數和遺傳相似系數均表現為不斷增加，多態性位點比率和遺傳距離均呈現先升后降趨勢。當群體量達到35～40株時，遺傳相似系數達到一定高值（0.998 73和1.000 00），遺傳距離降低到一定程度（0.000 64和0.000 00）。聚類結果顯示群體量為35和40株的群體被緊密聚在一起，因此可認為育成品種的繁殖群體量達到35～40株時可以保持其遺傳完整性;（2）地方種質：隨機抽取10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60株的11個群體量梯度，24對引物共擴增到DNA位點552個，平均每對引物擴增23.00個，多態性位點44個，占總位點數的7.97%。隨著群體量的不斷增加，擴增總位點數波動上升，多態性位點比率和遺傳距離呈先升后降然后再輕度變化的趨勢。遺傳相似系數則隨群體量的增大表現為先下降后上升然后輕度下降后再次回升的趨勢，并于群體量為40和60株時達到最大值0.99758。聚類結果顯示群體量為50、55和60株的群體被緊密聚在一起，因此可認為地方種質的繁殖群體量達到50～55株時可保持其遺傳完整性;（3）在芝麻種質資源繁育中，不同類型的種質資源由于其遺傳背景的純度存在差異，應選擇不同的繁殖群體量以保持其遺傳完整性。

關鍵詞：芝麻;種質資源;繁殖群體量;遺傳完整性;SRAP

中圖分類號：S565.3? ? ? 文獻標識碼：A

Effects of Regeneration Population on the Genetic Integrity of Sesame Germplasm Using SRAP Markers

SUN Jian， YAN Tingxian， YE Yanying， LIANG Junchao， LE Meiwang*， RAO Yueliang， YAN Xiaowen， ZHOU Hongying

Crops Research Institute， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences / Jiangxi Research Station of Crop Gene Resource & Germplasm Enhancement， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Nanchang Branch of National Center of Oilcrops Improvement / Jiangxi Province Key Laboratory of Oilcrops Biology， Nanchang， Jiangxi 330200， China

Abstract： The effect of regeneration population on the genetic integrity of sesame germplasm was studied to determine the appropriate population size and provide theoretical references for germplasm renewal and reproduction.The genetic parameters of two different types of sesame germplasm including released cultivar and local germplasm were analyzed using SRAP markers. （1） Released cultivar： Seven gradients of population size including 10， 15， 20， 25， 30， 35 and 40 were selected randomly. 24 pairs of primers were co-amplified to 525 loci， with an average of 21.88 loci per primer pairs， including 24 polymorphic loci， accounting for 4.57% of the total locus. With the increase of population size， the total amplification loci and genetic similarity coefficient increased， and the ratio of polymorphic loci and genetic distance increased and then decreased. When the population size reached 3540 plants， the genetic similarity coefficient reached a certain high value （0.998 73 and 1.000 00）， and the genetic distance decreased to a certain degree （0.000 64 and 0.000 00）. The clustering results showed that the populations with 35 and 40 were closely clustered. So the genetic integrity could be maintained when the population size of released cultivar reached 3540. （2） Local germplasm： Eleven gradients of population size including 10， 15， 20， 25， 30， 35， 40， 45， 50， 55 and 60 were selected randomly. 24 pairs of primers were co-amplified to 552 DNA locus， with an average of 23.00 locus per primer pairs， and including 44 polymorphic loci， accounting for 7.97% of the total loci. With the increase of population size， the total amplification loci fluctuation increased， and the ratio of polymorphic loci and genetic distance first increased， then decreased and then slightly changed. With the increase of population size， the genetic similarity coefficient first decreased， then increased， then slightly decreased and then rose again， and reached the maximum value of 0.99758 when the population size was 40 and 60 plants. The clustering results showed that the populations of 50， 55 and 60 plants were closely clustered. So it could be considered that the genetic integrity of local germplasm could be maintained when the reproductive population reached 5055 plants. （3） In the regenerating of sesame germplasm， different germplasm types should have different population size to maintain the genetic integrity because of the different genetic purity.

Keywords： sesame （Sesamum indicum L.）; germplasm; regeneration population; genetic integrity; SRAP

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.007

作物種質資源是農業科技創新、種業持續發展的物質基礎，是保障國家食物供給安全、生態安全和能源安全的戰略性資源[1]。我國十分重視作物種質資源收集保存和研究工作，自20世紀50年代以來先后收集保存340種作物50萬份資源，資源總量居世界第2位[1]。隨著種質資源種類和數量的增長，面臨的種質更新繁殖和入庫繁育等問題也越來越突出。不管是種質庫中已有資源的繁殖更新，還是新收集種質的入庫繁育，必須盡可能維持原有種質的遺傳完整性。遺傳完整性是指群體的基因型頻率分布、等位基因頻率分布等遺傳結構得到完全的保持[2]。維持種質資源的遺傳完整性就是在繁殖過程中保持親代和子代之間最大的遺傳相似性和最低的遺傳變異，是種質資源安全保存和更新繁殖的核心問題[3]。遺傳完整性一直是種質資源研究的重要內容，大量的研究從形態學[4-6]、生理生化[7-8]和分子的角度檢測分析種質資源的遺傳完整性。尤其是隨著分子標記技術的發展，隨機擴增多態性DNA（Random Amplified Polymorphism DNA， RAPD）[9-12]、限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Poly morp hism，RFLP）[9-10]、擴增片段長度多態性（Amplified Fragment Length Polymorphism， AFLP）[13-15]、簡單重復序列間擴增（Inter Simple Sequence Repeat， ISSR）[10， 12， 16]、相關序列擴增多態性（Sequence— Related Amplified Polymorphism， SRAP）[17-18]、簡單重復序列（Simple Sequ ence Repeat， SSR） [19-20]、基于表達序列標簽的簡單重復序列（Expressed Se qu ence Tag-Simple Seq uence Repeat， EST-SSR）[21]和單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism， SNP）[22]等越來越多的標記應用到種質遺傳完整性的分子檢測研究中。

種質資源的遺傳完整性在繁殖過程中受種子老化、繁殖世代數、繁殖群體量、繁殖環境、選擇壓力、植株密度與授粉和收獲方式等因素的影響[11， 23-24]。其中，繁殖群體量是指自然隨機交配條件下的理想群體大小，當繁殖群體量足夠大時才有可能保持其原有的遺傳結構[25]。當然，在實際生產過程中，不可能將繁殖群體量無限擴大，適宜的群體量是繁殖時需要考慮的重要因素。適宜的繁殖群體量既要有利于群體遺傳結構的保持，維持其遺傳完整性，又要有利于降低繁殖工作量和成本，節省人力、物力[21， 25]，因此，確定適宜的繁殖群體量就顯得尤為重要。關于繁殖群體量對種質遺傳完整性的研究已經在玉米[4]、棉花[5]、蠶豆[15]、燕麥[20， 25]、高粱[26]、煙草[27]等許多作物中開展。

芝麻（Sesamum indicum L.）是我國重要的優質油料作物，其天然異交率在5%～23%之間[28]，在我國種植歷史悠久，分布區域廣泛，種質資源十分豐富。關于芝麻種質資源繁殖群體量的研究多以種子產量作為判定標準[29-30]，而從遺傳完整性角度進行研究的報道很少[21]。馮祥運等[29]對芝麻的3個育成品種和1個地方種質進行了繁殖更新群體大小的研究，根據農藝性狀和種子量等確定有效繁殖群體的株數不少于25株，實際繁殖群體以40～50株為宜。馬緣生等[30]利用8份芝麻種質進行了繁殖群體大小的研究，結合同工酶多樣性驗證分析，從產量的角度提出了芝麻繁殖群體不能少于25株，以40～50株為宜。張艷欣等[21]利用15對EST-SSR標記對中期庫中的1份地方種質的群體量大小進行研究，認為群體量大小至少為30～35株可代表該種質遺傳特性，田間種植應采用不小于60～70株進行繁殖。本研究以2種不同的種質類型，即育成品種（遺傳純度較高）和從農家收集的地方種質（遺傳純度一般）為材料，采用多態性較為豐富的SRAP標記，比較分析了不同類型種質資源繁殖群體量對其遺傳完整性的影響，完善和豐富了芝麻種質資源繁育遺傳完整性研究的相關內容，為芝麻種質資源更新繁殖提供了理論參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本研究所用材料為2種種質資源類型，即育成品種和地方種質。育成品種為江西省農科院作物所育成的黑芝麻品種贛芝9號，種子由育種單位提供，為較大面積繁育的良種，品種純度較好。地方種質采集于江西省進賢縣梅莊鎮一農戶家，為農戶家多年自留自種的地方品種，品種純度一般。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗設計? 將收集的種子于發芽皿中進行萌發，7 d后隨機選擇一定數量的幼苗子葉及上胚軸混合進行DNA提取以構成不同大小的群體。在預實驗的基礎上，育成品種隨機選擇10、15、20、25、30、35、40個單株幼苗，地方種質隨機選擇10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60個單株幼苗，均重復3次。

1.2.2? DNA提取與質量檢測? DNA提取方法和質量檢測參照孫建等[31]的方法，以種子發芽后的子葉和下胚軸為材料，采用CTAB法提取基因組總DNA，提取過程中以RNase A消化去除RNA，通過紫外分光核酸測定儀測定DNA質量和濃度，并在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測其質量。質量合格后用ddH2O稀釋到50 ng/μL放置20 ℃冰箱保存備用。

1.2.3? SRAP引物與PCR擴增? 本研究使用SRAP正反引物共13條，引物序列信息詳見表1。引物是根據Li等[32]設計引物的原則設計而成，由上海生工生物工程技術服務有限公司（Sangon）合成。參照孫建等[31]建立的SRAP的PCR體系（15 ?L）：DNA 100 ng、正反引物各50 ng、1反應緩沖液、dNTPs 200 ?mol/L、MgCl2 2.0 mmol/L和Taq DNA聚合酶（購自MBI生物工程公司）1U。PCR程序參照Li等[32]得程序：94 ℃變性3 min;94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共5個循環;94 ℃1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用6%的聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠進行分離和銀染顯影。

1.3? 數據處理

統計清晰的SRAP擴增位點數，在同一位點上有帶記為“1”，沒有帶的記為“0”。按Nei等[33]的方法在NTSYS pc2.10e分析軟件上計算遺傳相似系數（GS）和遺傳距離（GD），按照類平均法（UPGMA）進行聚類分析。群體間聚類先在POPGENE 32軟件上計算群體間的遺傳距離，然后利用NTSYS進行UPGMA聚類。不同群體量的平均遺傳相似系數和平均遺傳距離的差異顯著性方差分析和部分圖表制作在SPSS 18.0和Excel 2007軟件上完成。

2? 結果與分析

2.1? SRAP擴增多態性分析

在育成品種中，24對引物共擴增到DNA位點525個（表2），每對引物有效擴增16～36個位點，平均21.88個。24對引物中14對引物擴增到了多態性位點，單對引物擴增的多態性位點最多為3個，平均每對引物擴增的多態性位點為1.00個，共計24個多態性位點。每對引物擴增的多態性位點比率為0～12.50%，平均為4.57%。圖1為引物Em11/Me19擴增結果的截圖。

由表2可知，在地方種質中，24對引物共擴增DNA位點數552個，每對引物擴增17～37個，平均23.00個。24對引物中16對引物擴增出了多態性，單對引物擴增出的多態性位點最多為8個，平均每對引物擴增出1.83個多態性位點，一共44個。每對引物擴增的多態性比率為0～36.36%，平均為7.97%。圖2為引物Em10/Me19擴增結果的截圖。

上面的數字表示群體植株數。

2.2? 不同群體量對育成品種遺傳完整性的影響

在育成品種中，擴增結果顯示，平均擴增的DNA條帶數和總位點數在群體量較小時有較小的波動變化，但總體上均呈現出隨群體量的增加而不斷增加的趨勢，平均擴增的DNA條帶數由506.00條（群體量為10株）增加到520.00條（群體量為40株），擴增的總位點數由511個增加到519個（表3）。多態性位點和多態性位點比率除在群體量為15株時表現為稍有增加之外，整體上表現為隨著群體量的不斷增加而減小的趨勢，均在群體量為40株時降低到0，即在群體量為40株時，隨機抽取的3次重復之間沒有檢測到多態性的存在。3次重復之間的平均相似系數也表現出隨群體量的不斷增大而不斷升高的趨勢，于群體量為40株時相似系數達到最高值1.00000，且群體量為35株和40株時平均相似系數沒有顯著差異。平均遺傳距離總體上表現為隨著群體量的不斷增加而不斷減小，于群體量為40株時平均遺傳距離為0，且群體量35株和40株時的平均遺傳距離沒有顯著差別。

圖3中的擴增位點數（圖3A）、多態性位點比率（圖3B）、相似系數（圖3C）和遺傳距離（圖3D）的變化折線圖更形象地顯示，隨著群體量的不斷增加擴增位點數和相似系數均不斷增加，于群體量為35株和40株時達到一定高值;隨著群體量的不斷增加，多態性位點比率和遺傳距離呈先升后降趨勢，均在群體量15株時表現為輕度上升，于群體量為40株時降低至0。

可見，在供試的育成品種贛芝9號中，當群體量達到35～40株時，平均相似系數達到一定高值，平均遺傳距離降低到一定程度，且相互之間無顯著性差異，因此可認為繁殖群體量達到35～40株時可保持該品種的遺傳完整性。

2.3? 不同群體量對地方種質遺傳完整性的影響

由表3可知，在地方種質中，平均擴增的DNA條帶數和總位點數均表現為波動上升趨勢，平均擴增的DNA條帶數由群體量為10株時的516.67條上升至群體量為60株時的546.33條，總位點數由522個（群體量為10株）增加到548個（群體量為50和55株），群體量為60株時稍有減少，為547個。多態性位點數先由10個（群體量為10株和15株）增加到17個（群體量為25株），后降低到群體量為40株時的2個，然后回升至6個（群體量為50株和55株），最后在群體量為60時再次降低至2個。多態性位點比率也由1.91%（群體量為15株）和1.92%（群體量為10株）上升到群體量為25株時的3.21%，然后不斷下降至群體量為40株時的0.37%，后又回升至群體量為50株和55株時的1.09%，最后再次下降至0.37%（群體量為60株）。平均相似系數先下降后上升，然后輕度下降后再次回升的趨勢，于群體量為40株和60株時達到最大值0.99758，群體量為40～60株之間的相似系數差異不顯著。平均遺傳距離表現為先上升至群體量為25株時的0.01100，后下降至群體量為40株時的0.00123，隨后輕微上升后又于群體量為60株時下降至最低點0.00122，群體量為40～60株時，不同群體量的平均遺傳距離之間的差異不顯著。

圖3更為直觀地顯示出擴增位點數（圖3A）、多態性位點比率（圖3B）、相似系數（圖3C）和遺傳距離（圖3D）隨群體量大小而表現出的變化。總體上，擴增位點數波動增長至群體量為50～60株時達到一定高值。多態性位點比率則在群體量為40～60株時降低到一定程度，并在較低值水平

變化。相似系數表現為先降低后上升到一定高度后，然后輕度下降后再次上升，群體量在40～60株時的相似系數均表現為較高。遺傳距離先升后降，同樣在群體量為40～60株時下降至一定低值，并稍有變化。

可見，供試的地方種質每個單株間的遺傳背景差異較大，隨機抽取的不同樣本量間的遺傳多樣性變化較大，但規律性總體上表現為隨著群體量的增加，遺傳完整性不斷加強，結合各個指標間的變化趨勢和相似系數、遺傳距離的差異性顯著性分析，群體量為40～60株之間的差異不顯著，鑒于其變化的波動性，繁殖群體量在40～60株之間，具體株數還有待進一步分析。

2.4? 聚類分析

對育成品種不同群體量的SRAP擴增結果進行聚類分析。不同群體量不同重復間的聚類結果顯示（圖4A），21個樣品被聚成3大群，其中群體量為10株和15株的6個樣品被聚在一起;群體量為20株、25株和30株（2個重復）的8個樣品被聚在另一個群;而余下的群體量為35株和40株的3次重復以及群體量為30株的1次重復被較緊密地聚在一起，其中群體量為40株的3次重復、群體量為35株的2次重復分別被緊密聚在一起，可見群體量為35株和40株之間的關系最接近。群體間的聚類結果顯示（圖4B），7個取樣群體被聚成2個大類，群體量為10、15、20和25株的群體被聚在一起，群體量為30、35和40株的3個群體被聚在另一起，其中35株的群體和40株的群體被更緊密地聚在一起，它們的相似度較為接近。

地方種質不同群體量不同重復間的聚類結果顯示（圖5A），33個樣品首先被聚成兩大群，群體量為10～30株的12個較小群體量的樣品被聚在一起，其余的21個樣品被聚在另一大群;在大群中，群體量為50株（2個重復）、55株（2個重復）和60株（3個重復）的7個樣品聚類最為緊密，可見群體量為50～60株之間的相似關系最為接近。群體間的聚類結果顯示（圖5B），11個取樣群體首先被聚成2個大類，群體量為10、15、20和25株的小群體量群體被聚在一起，余下的較大群體量群體被聚在一起。群體量為30～60株的7個取樣群體又被聚為3類，分別是群體量為30株和35株聚為1類、40株和45株聚為1類、以及50、55和60株聚為1類，且群體量為50株和55株的群體最為緊密地聚在一起，它們的相似度較為接近。

3? 討論

SRAP標記操作簡單、多態性好、可重復性高，是一種綜合了多種DNA分子標記優點的標記技術，廣泛應用于作物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建及QTLs（基因）定位研究[34-36]。在芝麻研究中，SRAP標記同樣得到了大量應用，車卓等[37-38]在100份黑芝麻種質資源和18份核心收集品的育成品種（系）的SRAP分析中，每對引物分別擴增出DNA條帶14.0條和13.9條。孫建等[39]在67個中國白芝麻品種的遺傳多樣性研究中，21對SRAP引物共擴增出DNA條帶561條，平均每對引物擴增帶數為26.7條。張艷欣等[40]在對209份白芝麻種質資源進行遺傳多樣性分析中，13對SRAP引物共擴增出180條帶，平均每對引物擴增出13.8條。孫建等[31]利用SRAP標記技術對20個中國主要黑芝麻品種DNA進行遺傳基礎分析，23對引物共擴增DNA帶672條，平均每對引物擴增的帶數為29.21條。本研究在育成品種中24對SRAP標記引物共擴增DNA位點

數525條，平均每對引物擴增位點21.88個，在地方種質中24對引物共擴增552個位點，平均每對引物擴增位點23.00個。該擴增結果顯示，每對SRAP引物擴增的位點數介于前人在芝麻的研究結果之間[31， 37-40]，與其他作物中的研究結果相近[41-42]，可見本研究中的SRAP擴增結果有效。

分子標記是研究種質資源遺傳完整性的一種科學高效的實用技術，具有檢測位點多、結果真實可靠、不受環境影響等優點。利用分子標記技術分析繁殖群體量對種質遺傳完整性的影響研究已經在很多作物得到廣泛應用。計懷春等[5]應用68對SSR標記對3個棉花品種的不同群體量進行DNA擴增分析，獲得236個位點，群體量為25、50、100和150株之間的遺傳多樣性指數和相似系數等指標均差異不顯著，于是認為25株可作為棉花種質繁殖更新時的最低群體量。劉敏等[15]用AFLP標記比較分析9個蠶豆地方種質在繁殖群體量為20和50株時的遺傳完整性指標，結果顯示，50株的繁殖群體量更能保持其遺傳完整性。楊苗苗等[20]利用SSR標記分析2個燕麥品種10～ 90株繁殖群體量對遺傳完整性的影響，20對引物分別檢測到43和32個等位基因，2個品種群體量分別在大于70株和50株時，遺傳變化趨于平穩，認為不同品種的繁殖群體量存在差異。李俊等[25]利用20對SSR引物對燕麥育成品種燕科1號的繁殖群體量進行研究，認為繁殖群體量理論為50株，在實際生產中可加大到100株更能保持其遺傳完整性。許玉鳳等[26]在對高粱的繁殖群體量研究結果表明，25對SSR引物共檢測到58個等位基因，群體量在40株以上時等位基因頻率及多樣性指數趨于一致，故建議高粱的繁殖群體量應在40株以上才能較好地保持其遺傳完整性。潘應花等[27]以4份煙草種質和1份野生種為材料，利用SSR標記進行不同繁殖群體量的遺傳完整性分析，結果表明普通煙草種質的繁育群體量應等于或大于10株、野生種應大于20株才能保持其遺傳完整性。在芝麻繁殖群體量研究中，馮祥運等[29]和馬緣生等[30]通過農藝性狀和種子產量認為芝麻繁殖群體量應該大于25株，張艷欣等[21]利用15對EST-SSR引物對1份芝麻地方種質的研究認為至少30～35株可代表該種質的遺傳特性。本研究中利用24對SRAP引物對2個不同類型的芝麻種質資源的不同繁殖群體量進行遺傳多樣性分析，結果顯示，在育成品種中檢測到DNA位點525個，群體量35株和40株時，其總位點數趨于穩定，多態性位點比率很低，遺傳相似系數趨于1，遺傳距離趨于0，且35株和40株的群體量之間的差異不顯著，聚類分析也顯示35株的群體和40株的群體被緊密聚在一起，故認為育成品種的繁殖群體量達到35～40株時，可保持其遺傳完整性。在地方品種中共檢測到DNA位點552個，群體量在50～60株時，總位點數變化較小，群體間的遺傳相似系數和遺傳距離差異不顯著，遺傳相似系數最高可達0.997 58，遺傳距離低至0.001 22，且聚類結果將50～55株的群體緊密聚在一起，結合經濟節約的原則，故認為地方種質的適宜繁殖群體量為50～55株。相較上述研究結果[5， 15， 20-21， 25-27]，本研究檢測的位點數多、設置的群體量梯度較密，且比較了不同類型種質的繁殖群體量，因此結果更為可靠有效。至于本研究中獲得的適宜群體量要大于前人在芝麻上的研究[21， 29-30]，這與選用的材料、標記類型和DNA位點數有關。

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