TSA誘導橡膠樹次生乳管分化過程qRT-PCR內參基因的篩選

吳紹華 張世鑫 楊署光 田維敏

摘? 要：橡膠樹乳管分化過程中差異表達基因的鑒定對于進一步認識乳管分化的分子機理具有重要的作用。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是進行基因表達分析的常用技術手段，合適內參基因的選擇是準確進行基因表達定量的前提。以組蛋白去乙酰化抑制劑曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）誘導橡膠樹次生乳管分化的實驗系統，采用qRT-PCR技術分析TSA處理橡膠樹萌條及對照內層樹皮中22個候選內參基因的表達情況。結果顯示：TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的過程中，穩定性最高的3個基因分別為UBC3、UBC4和eIF1Aa，而穩定性最差的3個基因分別為ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因為內參，分析組蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA處理下樹皮中表達量相對于對照的變化，結果初步證實TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的過程中，UBC3是最佳的內參基因，ROC3不適合作為內參基因。

關鍵詞：巴西橡膠樹;乳管分化;曲古抑菌素A（TSA）;內參基因

中圖分類號：S794.1? ? ? 文獻標識碼：A

Selection of Reference Genes for Normalization of Quantitative Real-time PCR Analysis in Secondary Laticifer Differentiation Induced by Trichostatin A in Rubber Tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）

WU Shaohua， ZHANG Shixin， YANG Shuguang， TIAN Weimin*

Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation and Physiology for Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： The identification of differentially expressed genes associated with laticifer differentiation is crucial for understanding the molecular mechanism of laticifer differentiation. The selection of a suitable reference gene is a precondition for accurate gene expression analysis by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. In the present study， the expression stability of 22 candidate reference genes were evaluated on the basis of TSA-induced secondary laticifer differentiation using geNorm and NormFinder algorithms. According to the analysis of geNorm and NormFinder， UBC3， UBC4， eIF1Aa were the top three stable genes and ROC3， PTP， CYP2 were the last three stable genes in the process of TSA-induced secondary laticifer differentiation. The expression patterns of HDA1 and HDA2 in TSA treated bark were analyzed based on UBC3， Actin and ROC3 as the reference gene respectively. The results showed that UBC3 could serve as a qRT-PCR reference gene to analyze the gene expression pattern in TSA-induced secondary laticifer differentiation. And ROC3 was not suitable as reference genes for qRT-PCR.

Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; laticifer differentiation; trichostatin A; reference genes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.012

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.），簡稱橡膠樹，是一種大戟科橡膠樹屬多年生熱帶喬木，是天然橡膠的主要來源。天然橡膠是在乳管細胞中合成和積累的。乳管細胞之間的細胞壁融合，形成互相連通的網狀結構—乳管。在天然橡膠生產中，通常是通過周期性切割橡膠樹樹干樹皮，收集從乳管傷口處流出的膠乳來提煉天然橡膠。橡膠樹的乳管數量與橡膠樹品種的遺傳特性有關，與天然橡膠產量顯著正相關，是橡膠樹產量育種的重要指標之一[1]。因此，進行橡膠樹乳管分化調控機理的研究對于改良橡膠樹品系的遺傳特性具有重要的意義。橡膠樹乳管是由形成層細胞分化而來的，研究表明，機械傷害、茉莉酸及冠菌素（一種茉莉酸類似物）均能誘導次生乳管的分化[2-5]。最近的研究證實，1種組蛋白去乙酰化抑制劑—曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）也能誘導次生乳管的分化，表明組蛋白乙酰化在橡膠樹次生乳管分化中起著重要的作用[6]。然而，關于組蛋白乙酰化對乳管分化的調控機理了解的較少。

差異表達基因的篩選是進行分子調控網絡構建和基因功能研究的前提。實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）技術由于具有低成本、高精確性及其高靈敏度等特點[7]，已成為基因相對定量表達分析最常用的技術。但qRT-PCR也有缺點，即合適內參基因選擇是準確定量基因表達的前提。理想的內參基因應在不同的處理下及不同類型樣品均能較穩定地表達[8]。但已有的研究證實，生物體內基因由于在不同的環境及不同的組織中行使功能的不同，并沒有真正的、完全穩定的內參基因[9-10]。因此，為獲得準確的基因表達數據，每進行一項實驗，都應評估以選擇出當前條件下合適的內參基因。截止至目前為止，關于橡膠樹內參基因評估的報道主要是針對膠乳的再生、排膠效應、不同基因型、不同組織、不同激素處理及逆境等[11-14]。關于形成層分化乳管過程內參基因的評估只見報道了1例，即冠菌素誘導橡膠樹萌條樹皮乳管分化系統內參基因的評估，結果顯示HbUBC2a在冠菌素（coronatine， COR）誘導次生乳管分化的實驗系統中表達最穩定[15]。為進一步完善乳管分化實驗系統內參基因的篩選和為構建組蛋白乙酰化調控橡膠樹次生乳管分化的基因調控網絡篩選合適的內參基因，本研究利用TSA誘導次生乳管分化的實驗系統，采用geNorm[16]和NormFinder[17]評估橡膠樹18s ribosomal RNA（18S）、actin、actin de po lymerizing factor（ADF，ADF4）、cyclophilin（CYP2）、eukaryotic translation initiation factor（eIF1Aa、eIF1Ab、eIF2、eIF3）、F-box family protein（FP）、trosine phosphatase（PTP）、DEAD box RNA helicase（RH2a、RH2b、RH8）、cytosolic cyclophilin（ROC3）、T-complex protein 1 subunit beta（TCBP）、Ubiquitin-protein ligase（UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3、UBC4）、mitosis protein YLS8（YLS8）持家基因[11]的表達穩定性，以篩選出合適的內參基因。

1? 材料與方法

1.1? 材料

本實驗所用材料為巴西橡膠樹無性系熱研73397萌條，這些材料種植于中國熱帶農業科學院試驗場，每年都被鋸斷，由莖干基部的潛伏芽長出萌條。萌條的頂芽在一年中活動5～6次，2次活動生長的葉簇中間隔一定長度的無葉莖稈，這種明顯的增長形態，稱為伸長單位（extension unit， EU）[3-4]。在自然條件下，從頂端往下數第1～2伸長單位中是沒有次生乳管[3-4]，因此，第1～2伸長單位常常用來研究次生乳管分化的誘導。

1.2? 方法

1.2.1? 材料的處理及RNA的提取? 本實驗采用萌條第2伸長單位作為處理的部位，用單面刀片輕輕刮去莖表面的角質層，然后分別涂100 nmol/L的TSA（Selleck，USA）和去離子水（CK），再用塑料薄膜包裹進行處理[5-6]，于處理后0.5、1、2、4、8、24、48、72 h采集包含形成層的內層樹皮，每個時間點收集9株萌條的樣品，3株萌條的樣品混合為1個樣品，每個時間點3次重復，然后液氮冷凍后80 ℃冰箱保存用于RNA的提取。RNA的提取及痕量DNA的消化采用RNAprep Pure Plant（天根，北京）試劑盒進行。RNA提取后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度，NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，USA）測定RNA的純度和濃度。取1 ?g RNA采用Reve rt AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （The rmo Fisher Scientific，USA）進行反轉錄合成第一鏈cDNA，獲得的cDNA產物稀釋10倍后用于實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。

1.2.2? qRT-PCR候選內參基因及穩定性驗證基因的選擇? 根據橡膠樹已報道的內參基因[11-15]，選擇22個持家基因（18S、Actin、ADF、ADF4、CYP2、eIF1Aa、eIF1Ab、eIF2、eIF3、FP、PTP、RH2a、RH2b、RH8、ROC3、TCBP、UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3、UBC4、YLS8）作為候選的內參基因。參照已報道的HDA基因[18]，選擇HDA1、HDA2基因用于內參基因穩定性的驗證，其中候選內參基因及驗證基因的引物如表1。

1.2.3? 基因的qRT-PCR分析? 以TSA處理和對照的cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq?（TaKaRa，Japan）試劑，基于CFX384 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad公司，USA）平臺進行實時熒光定量PCR。反應體系為10 μL體系，包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.3 μL、滅菌水補足10 μL。每1個PCR反應重復3次，反應程序為：95 ℃預變性2 min;95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環;擴增完后進行產物熔解曲線分析檢測擴增產物的特異性，溫度為65～ 95 ℃，每循環上升0.5 ℃，連續測定樣品的熒光值獲得熔解曲線。

1.3? 數據處理

采用geNorm和NormFinder對TSA處理的次生乳管分化的過程進行內參基因穩定性的評估。需要先按照公式Q=EminCp–Cq（E為基因的擴增效率。當擴增效率接近100%時，E通常默認為2。Cq為該基因在各個組織中的Cq值，min Cq為該基因在所有組織中最小的Cq值）將內參基因的原始Cq值轉化為相對表達量Q值，然后將Q值導入到geNorm和Normfinder軟件進行分析。對于geNorm分析，以基因配對的形式不斷剔除最不穩定的基因，得到內參基因的表達穩定值M，M值與內參基因的穩定性呈負相關，即M值越小代表基因的穩定值越高，反之則越低，最后根據M值大小將候選內參基因穩定性進行排序，篩選出最穩定的內參基因，并通過標準化因子配對差異分析Vn/n+1（閾值為0.15）來判定內參基因的最適數目。

NormFinder程序則是通過計算基因的表達穩定值（stability value， SV）來評估候選內參基因的穩定性，SV值越小，候選內參基因就越穩定，反之亦然。最后，對2個軟件的評估結果進行比較分析。

HDA1和HDA2熒光定量表達數據采用one- way ANOVA對處理及對照進行差異顯著性分析，P<0.05時即達顯著性，用符號*表示;P<0.01時即達極顯著性，用符號**表示。

2? 結果與分析

2.1? 內參基因定量引物的特異性檢測

對橡膠樹22個候選的內參基因進行RT-PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示候選的內參基因擴增條帶單一，片段大小與目的片段大小一致（圖1），表明候選的內參引物的特異性擴增較好，符合qRT-PCR實驗標準，可用于內參基因的評估。

2.2? TSA處理和對照橡膠樹萌條內層樹皮候選內參基因的轉錄豐度

為了鑒定22個候選內參基因的轉錄豐度，采用qRT-PCR分析了TSA處理和對照橡膠樹內層樹皮中內參基因的表達量，根據Cq值預測內參基因的表達豐度，Cq值越小，表達豐度越高。根據候選內參基因Cq值的分布情況，不同的內參基因在內層樹皮中的表達豐度存在明顯的差異。22個候選內參基因的Cq值介于11.52～ 28.59，其中18S rRNA Cq值最低，表達量最高;FP的Cq值最高，表達量最小。其他內參基因的Cq值介于20～30之間（圖2）。

2.3? geNorm分析內參基因表達的穩定性

geNorm分析結果顯示，TSA處理和對照橡膠樹萌條內層樹皮候選內參基因的穩定性從高到低的排序為UBC3/UBC4、eIF1Aa、RH2b、YLS8、UBC2a、Actin、ADF4、RH8、TCPB、UBC2b、eIF1Ab、RH2a、ADF、eIF3、UBC1、FP、18S、eIF2、CYP2、PTP、ROC3，表明TSA誘導次生

乳管分化的實驗中，前3組最穩定的基因分別為UBC3/UBC4、eIF1Aa、RH2b，其中UBC3/UBC4是最合適的內參基因。最不穩定的3個內參基因分別為ROC3、PTP、CYP2（圖3A）。另外，為了分析內參基因的適合個數，對內參基因的配對差異值進行了分析，結果顯示，TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的過程中，V2/3的配對的變異值（pairwise variations）為0.061，小于閾值0.15，可以判定適合作為內參的基因個數為2個（圖3B）。

2.4? NormFinder分析內參基因表達的穩定性

NormFinder分析結果顯示，TSA處理和對照橡膠樹萌條內層樹皮候選內參基因的穩定性從高到低的排序為UBC3、UBC4、eIF1Aa、RH2b、UBC2a、RH8、ADF4、YLS8、Actin、TCPB、eIF3、ADF、UBC2b、FP、eIF1Ab、UBC1、RH2a、18S、eIF2、CYP2、PTP、ROC3，前3個最穩定的基因分別為UBC3、UBC4、eIF1Aa，其中UBC3是最合適的內參基因，穩定性最差的3個內參基因分別為ROC3、PTP、CYP2（圖4）。結果表明，在穩定性前3位和后3位的內參基因的評估中，NormFinder分析結果與geNorm分析結果是一致的。因此，在TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的過程中，UBC3是最佳的內參基因。

2.5? 內參基因的穩定性驗證

結合候選內參基因的穩定性的評估結果，分別選擇穩定性最好的基因UBC3、穩定性最差的基因ROC3及文獻報道的內參基因Actin對TSA響應的關鍵基因HDA1和HDA2基因進行了相對表達量的評估。結果顯示，采用UBC3和Actin作為內參，TSA處理下樹皮中HDA1和HDA2基因的表達量變化趨勢基本一致（圖5A，圖5B，圖5C和圖5D）。不同的是以UBC3作為內參，HDA2在TSA處理8 h后表達量相比對照極顯著上調（P<0.01）（圖5B），而以Actin作為內參，HDA2在TSA處理8 h后表達量相比對照顯著上調（P< 0.05）（圖5D）。但是，以ROC3作為內參，HDA1

A、C、E分別為以UBC3、Actin、ROC3為內參評估的HDA1基因的相對表達量;B、D、F分別為以UBC3、Actin、ROC3為內參評估的HDA2基因的相對表達量。熒光定量表達數據采用One-way ANOVA對TSA處理及對照進行差異顯著性分析，

*表示P<0.05，即達顯著性水平;**表示P<0.01，即達極顯著性水平。

和HDA2表達量及表達量的趨勢都發生了較大的變化（圖5E，圖5F），且HDA2在TSA處理8 h后表達量相比對照也無顯著差異（圖5F）。結果表明，內參基因的正確選擇對于采用qRT-PCR進行基因相對表達量的定量至關重要，UBC3適合作為TSA處理樹皮樣品相關基因定量表達的內參。

2.6? TSA與COR誘導次生乳管分化過程中內參基因的比較分析

因為用于內參評估COR處理及TSA處理的樣品是同一時間采集，且2批處理的樣品共用同一批對照樣品，因此，我們整合2批樣品的數據，采用geNorm與NormFinder軟件對整合的內參基因數據進行評估，geNorm結果顯示eIF1Aa/ UB C2a、RH2b、UBC3、YLS8和UBC4為前5個最穩定表達的基因。NormFinder結果顯示UBC3、RH2b、UBC4、eIF1Aa和UBC2a為前5個最穩定表達的基因。其中UBC3、RH2b、eIF1Aa和UBC2a在2個軟件中評估結果是重疊的，因此，認為這4個基因在COR和TSA誘導次生乳管分化的過程中基因表達量較穩定，可進一步驗證其是否可用于乳管分化基因相對定量表達的內參基因（圖6）。

3? 討論

橡膠樹基因組的測序完成為進一步進行橡膠樹發育及抗逆等功能基因的挖掘提供數據基礎[19]。熒光定量PCR技術是進行基因鑒定研究的必備手段之一。為獲得準確的基因表達數據，內參基因的選擇就顯的尤為重要。只有選擇合適、穩定的基因作為內參基因，才能客觀、真實地反映基因的相對表達量。理想的內參基因應在不同的基因型植株、不同組織、不同的發育階段及不同處理下均能恒定表達，但現有的研究顯示，并不存在通用性的內參基因。比如，18S rRNA由于基因表達范圍廣、表達量恒定，常常作為許多植物qRT-PCR分析的內參基因，但在小麥、苜蓿、杜鵑和雜交蘭中，18S rRNA并不適合內參基因[20-21]。早期橡膠樹qRT-PCR分析也有采用18S rRNA作為內參基因的[22-24]。本研究發現，18S rRNA在樹皮中的Cq值較低（Cq=11.52），即表達豐度最高，且其表達穩定性相對較差，表明18S rRNA并不適合作為TSA誘導橡膠樹乳管分化的內參，且多份橡膠樹內參基因評估的文獻[11-15]也證實18S rRNA穩定性相對較差并不適合作為橡膠樹的內參基因。

本研究基于TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的實驗系統，對22個候選的內參基因在TSA處理樹皮樣品中進行實時熒光定量PCR。除18S rRNA的Cq值較低，其他內參基因的Cq值在樹皮中處于20～30之間，與Li等[11]和Chao等[14]在膠乳中檢測的Cq值相似，表明22個候選的內參基因表達量適中，適合進行基因表達穩定性的評估。通過geNorm與NomFinder軟件的分析，在TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的過程中，UBC3、UBC4、eIF1Aa、RH2b是前4位穩定表達的內參基因。UBC3和RH2b在COR誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的過程中的表達穩定性也在前4位之中[15]。另外，RH2b還可用于橡膠樹不同組織、非生物脅迫和收割逆境處理的內參基因[11-12]。UBC4在膠乳再生和排膠過程中的表達也較穩定[13-14]，eIF1Aa可用于割膠處理條件下膠乳中相關基因表達的內參基因[11-14]。這也說明UBC、eIF和RH基因家族在不同組織及不同處理條件下的表達較穩定。但不同的樣品中基因的編號及表達穩定性的排序也不一樣，表明在不同樣品中進行基因的表達量分析前需要進行內參基因的評估以選擇出最佳的內參基因。在本研究中，通過geNorm與NomFinder軟件的評估以及對表達穩定內參基因的驗證，顯示UBC3是TSA誘導橡膠樹萌條次生乳管分化的實驗系統的最佳內參基因。

參考文獻

田維敏， 史敏晶， 譚海燕， 等. 橡膠樹樹皮結構與發育[M]. 北京： 科學出版社， 2015.

郝秉中， 吳繼林. 創傷（割膠）對巴西橡膠樹乳管分化的影響[J]. 植物學報， 1982， 24（4）： 388-392.

Hao B Z， Wu J L. Laticifer differentiation in Hevea brasiliensis： induction by exogenous jasmonic acid and linolenic acid[J]. Annals of Botany， 2000， 85（1）： 37-43.

Tian W M， Yang S G， Shi M J， et al. Mechanical wounding- induced laticifer differentiation in rubber tree： An indicative role of dehydration， hydrogen peroxide， and jasmonates[J]. Journal of Plant Physiology， 2015， 182： 95-103.

Zhang S X， Wu S H， Chen Y Y， et al. Analysis of differentially expressed genes associated with coronatine-induced laticifer differentiation in the rubber tree by subtractive hybridization suppression[J]. PLoS One， 2015， 10（7）： e0132070.

Zhang S X， Wu S H， Tian W M. The secondary laticifer differentiation in rubber tree is induced by trichostatin A， an inhibitor of histone acetylation[J]. Frontiers of Agricultural Science and Engineering， 2016， 3（4）： 357-362.

Huggett J， Dheda K， Bustin S， et al. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations[J]. Genes and Immunity， 2005， 6（4）： 279-284.

袁? 偉， 萬紅建， 楊悅儉. 植物實時熒光定量PCR內參基因的特點及選擇[J]. 植物學報， 2012， 47（4）： 427-436.

張玉芳， 趙麗娟， 曾幼玲. 基因表達研究中內參基因的選擇與應用[J]. 植物生理學報， 2014， 50（8）： 1119-1125.

Gutierrez L， Mauriat M， Guénin S， et al. The lack of a systematic validation of reference genes： a serious pit fall undervalued in reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） analysis in plants[J]. Plant Biotechnology Journal， 2008， 6（6）： 609-618.

Li H P， Qin Y X， Xiao X H， et al. Screening of valid reference genes for real-time RT-PCR data normalization in Hevea brasiliensis and expression validation of a sucrose transporter gene HbSUT3[J]. Plant Science， 2011， 181（2）： 132-139.

Pirrello J， Leclercq J， Dessailly F， et al. Transcriptional and post-transcriptional regulation of the jasmonate signalling pathway in response to abiotic and harvesting stress in Hevea brasiliensis[J]. BMC Plant Biology， 2014， 14： 341.

Long X Y， He B， Gao X S， et al. Validation of reference genes for quantitative real-time PCR during latex regeneration in rubber tree[J]. Gene， 2015， 563（2）： 190-195.

Chao J Q， Yang S G， Chen Y Y， et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time pcr analysis of the gene expression in laticifers on the basis of latex flow in rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 1149.

Wu S H， Zhang S X， Chao J Q， et al. Transcriptome analysis of the signalling networks in coronatine-induced secondary laticifer differentiation from vascular cambia in rubber trees[J]. Scientific Reports， 2016， 6： 36384.

Vandesompele J， De Preter K， Pattyn F， et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes[J]. Genome Biology， 2002， 3（7）： 34.

Andersen C L， Jensen J L， Orntoft T F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data： amodel-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization， applied to bladder and colon cancer data sets[J]. Cancer Research， 2004， 64（15）： 5245-5250.

Li H L， Guo D， Zhu J H， et al. Identification and expression analysis of genes involved in histone acetylation in Hevea brasiliensis[J]. Tree Genetics & Genomes， 2017， 13（5）： 98.

Tang C R， Yang M， Fang Y J， et al. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants， 2016， 2（6）： 16073.

周曉馥， 王? 晶， 史宏偉， 等. 18S rRNA作為植物實時熒光定量PCR內參基因的探究[J]. 吉林師范大學學報（自然科學版）， 2016， 37（2）： 115-119.

林榕燕， 鐘淮欽， 黃敏玲， 等. 雜交蘭實時熒光定量PCR內參基因的篩選[J]. 中國細胞生物學學報， 2018， 40（3）： 381-389.

Li D J， Deng Z， Liu X H， et al. Molecular cloning， expression pro?les and characterization of a novel translationally controlled tumor protein in rubber tree （Hevea brasiliensis） [J]. Journal of Plant Physiology， 2013， 170（5）： 497- 504.

Qin B. The function of Rad6 gene in Hevea brasiliensis extends beyond DNA repair[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 66： 134-140.

Tian W M， Zhang H， Yang S G， et al. Molecular and biochemical characterization of a cyanogenic β-glucosidase in the inner bark tissues of rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）[J]. Journal of Plant Physiology， 2013， 170（8）： 723-730.