過量錳處理對柱花草次級代謝物、酶活性和SgPALs基因表達的影響

賈怡丹 韓佳芮 李季膚 王桂花 劉攀道 劉國道 羅麗娟 陳志堅

摘? 要：以熱研二號（RY2）柱花草為材料，分析過量錳處理（100～600 ?mol/L）對柱花草生長、次級代謝物、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及SgPALs基因表達的影響，探討金屬錳毒害對柱花草次級代謝途徑的影響。結果表明：相對對照錳（5 ?mol/L）處理，400、600 ?mol/L錳處理顯著抑制柱花草葉片葉綠素濃度、最大光化合速率（Fv/Fm）、地上部和根部生物量。隨著外源錳處理濃度（100～600 ?mol/L）的增加，葉片原花青素、總酚和單寧含量呈現出逐漸增加的趨勢，而葉片類黃酮含量逐漸降低。此外，400、600 ?mol/L錳處理顯著增加葉片PAL酶活性，但對PPO活性影響不明顯。定量PCR結果表明，過量錳處理對SgPAL1和SgPAL2基因表達影響不明顯，但過量錳處理增強了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草葉片中的表達。以上結果說明，柱花草可能通過苯丙氨酸途徑調控次級代謝響應金屬錳毒脅迫，且SgPAL3和SgPAL4基因可能參與該響應過程。研究結果為探索柱花草響應金屬錳毒脅迫機理提供重要依據。

關鍵詞：柱花草;錳毒害;次級代謝;苯丙氨酸解氨酶

中圖分類號：Q945.78? ? ? 文獻標識碼：A

Effects of Excess Manganese on Secondary Metabolites， Enzyme Activity and SgPALs Gene Expression in Stylosanthes

JIA Yidan1， HAN Jiarui1， LI Jifu1， WANG Guihua3， LIU Pandao2， LIU Guodao2， LUO Lijuan1*， CHEN Zhijian1，2*

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： In this study， the effects of different manganese （Mn） levels on the growth， chlorophyll content， secondary metabolites and activities of polyphenol oxidase （PPO） and phenylalnine ammonialyase （PAL） as well as SgPALs expressions were investigated using Stylosanthes （stylo） genotype RY2. Results showed that the chlorophyll concentration， maximum photochemical rate （Fv/Fm）， shoot and root dry weight of stylo significantly decreased by 400 ?mol/L and 600 ?mol/L Mn treatments. The contents of proanthocyanidin， total phenol and tannin increased but the flavonoid content decreased in the leaves ranged from 100 ?mol/L to 600 ?mol/L. Furthermore， the activities of PAL， except PPO， increased under 400 ?mol/L and 600 ?mol/L Mn treatments compared to that in the 5 ?mol/L Mn treatment. qRT-PCR analysis showed that the expressions of SgPAL3 and SgPAL4 in the leaves were significantly enhanced by excess Mn treatments， in despite of the expressions of SgPAL1 and SgPAL2 were not regulated by Mn. The results suggested that the regulation of the secondary metabolites through SgPALs mediated phenylalanine pathway might be involved in the response to Mn toxicity in stylo. The study would provide an important basis for exploring the mechanisms of stylo in response to Mn toxicity.

Keywords： Stylosanthes; Mn toxicity; secondary metabolism; phenylalnine ammonialyase

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.013

錳是植物生長發育所必需的微量元素之一，在植物生命活動過程中起重要作用。錳與光合作用密切相關，能夠維持葉綠體膜的正常結構，參與光合電子傳遞系統的氧化還原和光系統Ⅱ中水的光解過程[1-2]。錳也是超氧化物歧化酶（SOD）的組成成分，可催化超氧化自由基轉變為過氧化氫和氧氣，從而防止膜脂過氧化[3]。一般認為，20～40 mg/kg植株錳濃度足以滿足植物生長發育所需，當低于這個錳濃度范圍時，葉綠素合成、酶活性以及光合作用會受到抑制，葉片出現變黃失綠的缺錳性狀，最終降低植株的生物量[1，4]。另一方面，錳是地殼中第2豐富的過渡金屬元素，也被認為是重金屬元素之一，其廣泛分布于土壤、沉積物和生物材料中。在地殼中，錳的平均含量為1000 mg/kg。在我國可耕作土壤中，錳的平均含量可達574 mg/kg[5-6]。當植株體內的錳濃度超過150 mg/kg時，葉片會出現褐色錳氧化斑點、厚度減小、卷縮乃至植株萎蔫壞死等錳毒害現象，導致作物減產[1， 7-8]。

過量錳毒害會對植物造成產生一系列的應激反應，如產生過氧化脅迫、改變酶活性、抑制光合作用、影響植株對其他營養元素（如磷、鈣、鎂和鐵等）的吸收、轉運和分配[9]。例如，在過量錳處理下，波蘭小麥（Triticum polonioum）葉片會出現黃化和壞死斑點，葉綠素含量降低[10]。隨著外源錳濃度的增加，油菜幼苗葉片過氧化氫酶（CAT）活性顯著降低，而過氧化物酶（POD）活性則表現出增加的趨勢[11]。研究表明，過量錳會導致豇豆（Vigna unguiculata）葉片形成肉眼可見的褐色斑點，進一步研究發現，其褐色斑點主要由氧化態錳和酚類物質組成[12]。另外，在過量錳脅迫下，豇豆葉片愈創木酚POD和NADH-POD酶活性以及酚類物質含量的變化，被認為是豇豆對錳毒脅迫的應激響應[12]。植物在長期進化過程中，形成一系列適應錳毒害的機制。例如，在過量錳脅迫下，植物可通過根系分泌有機酸或其他化合物螯合錳離子，減少錳的吸收緩解錳毒脅迫。另外，進入植物細胞中的過量錳，可被轉運至液泡和細胞壁等非活性部位。并且，通過增強抗氧化系統，可降低金屬錳對植物的毒害[13]。此外，在錳毒脅迫中，植物可以通過調控次級代謝途徑（如苯丙烷類代謝）及其相關蛋白（如苯丙氨酸解氨酶）表達應對錳毒脅迫[14]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是豆科蝶形花亞科的1個屬。柱花草不僅可作為飼料牧草喂養牲畜，且可作為豆科綠肥覆蓋果園、改良以及修復土壤，具有重要的經濟價值和生態效益[15]。相對苜蓿（Medicago sativa）、豇豆和菜豆（Phaseolus vulgaris）等豆科植物，柱花草具有忍耐錳毒害的優良特性，是探索植物響應金屬錳毒脅迫機理的良好研究材料[13， 16-17]。葉片失綠、最大光化合效率（Fv/Fm）和植株生物量降低被認為是柱花草主要的錳毒害癥狀[13-14， 17-18]。雖然錳毒害對柱花草生長和柱花草適應錳毒脅迫機理已有文獻報道，但錳毒害對柱花草次級代謝物及其相關酶活性和基因表達的影響仍不清楚。因此，本研究以熱研二號（RY2）柱花草為材料，分析不同錳濃度處理對柱花草生長、4種次級代謝產物、多酚氧化酶（PPO）、如苯丙氨酸解氨酶（PAL）及SgPAL1-4基因表達的影響，以期為探究錳毒害對柱花草次級代謝途徑的影響提供理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

所用供試材料為熱研二號（RY2）柱花草（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2? 方法

1.2.1? 處理方法? 參考劉攀道等[19]方法，將柱花草種子去種皮并于80 ℃加熱2 min后，將種子置于在黑暗條件下萌發2～3 d。將萌發后的柱花草幼苗移至1/2 Hoagland營養液中，在溫室內進行培養。幼苗正常培養1個月后，進行4個錳濃度處理，分別為5、200、400、600 ?mol/L MnSO4。用KOH或H2SO4調pH至5.0。每個處理設置4個重復，處理10 d后，分別收獲地上部和根部樣品。一部分樣品用于干重測定，另一部分樣品用液氮速凍后，于?80 ℃保存備用。

1.2.2? 葉綠素含量測定? 稱取0.1 g葉片，放入10 mL 80% 丙酮中避光提取過夜。于分光光度計中分別測定663、645 nm處吸光度，計算葉綠素含量，采用鮮重。

1.2.3? 錳含量的測定? 柱花草樣品于105 ℃下殺青30 min，75 ℃烘干至恒重后，稱取0.07 g樣品于灰化瓶中，加入適量濃硫酸乙醇（5∶95）混合液浸濕樣品，于馬弗爐中600 ℃灰化10 h。待樣品冷卻后，加入8 mL 100 mmol/L HCl充分溶解樣品。采用電感耦合等離子體原子發射光譜（ICP- AES）測定樣品中的錳含量。

1.2.4? 柱花草次級代謝含量的測定? 總酚提取與測定：稱取約0.1 g烘干后的葉片，加入2.5 mL試劑盒（南京建成生物工程研究所，下同）中的提取液，并充分研磨樣品，于60 ℃提取30 min。12 000 r/min，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說明書加入反應液，于分光光度計中測定760 nm處吸光度，并計算總酚含量，采用干重。

類黃酮提取與測定：稱取約0.02 g烘干后的葉片，加入2 mL提取液并充分研磨樣品，于60 ℃提取2 h。12 000 r/min，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說明書加入反應液，于分光光度計中測定502 nm處吸光度，并計算類黃酮含量，采用干重。

原花青素提取與測定：稱取約0.1 g烘干后的葉片，加入2 mL提取液并充分研磨樣品。30 min，10 000 r/min，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說明書加入反應液，于分光光度計中測定500 nm處吸光度，并計算原花青素含量，采用干重。

單寧提取與測定：稱取約0.1 g新鮮葉片，加入1 mL蒸餾水，充分研磨勻漿后轉移到1.5 mL離心管中，于80 ℃水浴提取30 min，8000 g，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說明書加入反應液，于分光光度計中測定760 nm處吸光度，并計算單寧含量，采用鮮重。

1.2.5? 苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性測定? PAL提取與測定：稱取約0.1 g葉片樣品，加入0.9 mL 提取液，在冰上并充分研磨樣品。10 000 g，4 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說明書（南京建成生物工程研究所）加入反應液，于分光光度計中測定290 nm處吸光度，并計算PAL酶活性。

PPO提取與測定：稱取約0.1 g葉片樣品，加入1 ml提取液，在冰上并充分研磨樣品。8000 g，4 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說明書加入反應液，于分光光度計中測定410 nm處吸光度，并計算PPO酶活性。

1.2.6? 柱花草葉片總RNA提取、cDNA合成和實時熒光定量PCR? 參照 TRIzol（Invitrogen inc，美國）方法提取柱花草葉片總RNA。參照M-MLV反轉錄試劑盒（Invitrogen inc，美國）方法合成cDNA第一鏈。實時熒光定量PCR參照ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix定量試劑盒說明書方法進行，用Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex運行QuantStudioTM Real-Time PCR Software及計算分析每個樣品的表達量。基因表達分析包括3個生物學重復。相對表達量為目的基因的表達量與看家基因（SgEF-1α）表達量的比值。實時熒光定量PCR引物如表 1 所示。

1.3? 數據處理

采用Excel 2003軟件進行數據分析，用SPS S20.0（SPSS Institute，美國）軟件進行單因素方差分析。

2? 結果與分析

2.1? 不同錳濃度處理對柱花草生長的影響

葉片失綠、最大光化學效率（Fv/Fm）和植株生物量降低是柱花草主要的錳毒害癥狀。如圖1所示，過量錳處理顯著抑制柱花草的生長。隨著外源錳濃度的增加，葉片葉綠素含量和Fv/Fm逐漸降低，在600 ?mol/L錳處理下葉綠素含量和Fv/Fm達到最低值。與對照（5 ?mol/L）錳處理相比，柱花草在400、600 ?mol/L錳處理下的葉綠素濃度分別降低37.9%和38.0%，Fv/Fm分別降低22.2%和27.8%，差異顯著（圖1A、圖1B）。

類似的，過量錳處理（400、600 ?mol/L）顯著降低柱花草地上部和根部生物量。與對照（5 ?mol/L）錳處理相比，在400、600 ?mol/L錳處理下，柱花草地上部干重分別降低26.5%和32.4%，而根部干重分別顯著降低17.4%和21.7%（圖1C、圖1D）。

2.2? 不同錳濃度處理對柱花草組織錳含量的影響

從圖2可以看出，過量錳處理顯著增加了柱花草地上部和根部的錳含量。與對照（5 ?mol/L）處理相比，400～600 ?mol/L錳含量處理的柱花草地上部錳含量增加2.8～4.1倍，根部錳含量增加1.5～ 1.8倍（圖2）。此外，根部積累的錳含量顯著高于地上部錳含量。在400、600 ?mol/L錳處理下，根部錳含量分別是地上部錳含量1.9和1.6倍（圖2）。

2.3? 不同錳濃度處理對柱花草葉片次級代謝物的影響

進一步分析不同錳濃度處理對柱花草葉片4種次級代謝物（原花青素、總酚、類黃酮和單寧）濃度的影響。從圖3可看出，隨著外源錳處理濃度的增加，葉片原花青素、總酚和單寧濃度呈現出逐漸增加的趨勢，而類黃酮濃度則逐漸降低。與對照（5 ?mol/L）處理相比，600 ?mol/L錳處理的柱花草葉片原花青素、總酚和單寧濃度分別增加85.9%、47.2%和27.4%（圖3A、圖3C、圖3D），而類黃酮濃度則降低27.1%（圖3B），差異顯著。

2.4? 不同錳濃度處理對柱花草苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性的影響

從圖4可看出，不同錳濃度處理對柱花草葉片PAL和PPO活性的影響不一樣，過量錳處理（400、600 ?mol/L）顯著增加葉片PAL酶活性，但對PPO活性影響不明顯。與對照（5 ?mol/L）處理相比，400、600 ?mol/L錳處理的柱花草葉片PAL酶活性分別增加13.3%和60.2%（圖4）。

2.5? 不同錳濃度處理對SgPALs基因表達的影響

本研究進一步分析了不同錳濃度處理對Sg PAL1-4基因表達的影響。從圖5可以看出，不同錳濃度處理對SgPALs基因表達的影響不一樣，與

基因表達分析包含3個生物學重復。不同小寫字母表示錳處理間差異顯著（P<0.05）。

對照（5 ?mol/L）相比，過量錳處理對SgPAL1基因表達影響不明顯，而200 ?mol/L過量錳處理顯著抑制了Sg P AL2基因的表達（圖5A，圖5B）。另外，200、400 ?mol/L錳處理分別增強了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草葉片中的表達。在200 ?mol/L錳處理下，Sg P AL3基因的表達量是對照（5 ?mol/L）處理下的6.89倍，而在400 ?mol/L錳處理下，SgPAL4基因的表達量是對照（5 ?mol/L）處理下的1.88倍（圖5C、圖5D），差異顯著。

3? 討論

錳是植物生長所必需的營養元素之一，但錳也是重金屬元素，植物細胞內過量積累的錳離子會對植物造成毒害，導致作物減產[20]。研究表明，在較低的錳濃度（50 ?mol/L）處理下，其可導致豇豆、大麥（Hordeum vulgare）和大豆（Glycine max）葉片形成錳氧化斑的毒害癥狀[12， 21-22]。在本研究中，雖然200 ?mol/L錳處理降低柱花草葉綠素含量和Fv/Fm，但對柱花草地上部干重并沒有顯著影響，而只有400和600 ?mol/L錳濃度處理才顯著降低柱花草葉綠素濃度、Fv/Fm、地上部和根部生物量（圖1）。這與已有研究結果類似，柱花草在低于200 ?mol/L錳處理下并沒有明顯的錳毒害癥狀，只有在400 ?mol/L錳濃度處理下才顯著降低了柱花草葉綠素含量和植株干重[18]。本研究結果進一步表明柱花草具有較強的耐錳毒能力。在過量錳處理下，雖然柱花草根部的錳含量和地上部錳含量均逐漸增加，但根部的錳含量顯著高于地上部（圖2）。根部積累錳，減少錳向地上部運輸被報認為是柱花草適應錳毒害的機制之一[18]。

次級代謝物，如原花青素、總酚、單寧和類黃酮等酚類物質，是植物應對逆境脅迫的關鍵化合物。這些酚類化合物與植物戊糖磷酸酯、莽草酸和苯丙酸代謝途徑密切相關[23-24]。酚類化合物能夠清除自由基、螯合金屬陽離子，從而參與植物應對逆境脅迫[25]。研究發現，重金屬脅迫會影響植物次級代謝途徑，改變次級代謝物含量。例如，在過量錳脅迫下，豇豆葉片酚類物質和胼胝質含量、水稻葉片木質素和黃酮類化合物以及楊樹（Populus cathayana）葉片中苯丙氨酸的含量均有所增加，進而響應金屬錳脅迫[26-27]。此外，金屬鎘脅處理也增加秋茄（Kandelia candel）幼苗葉片中的單寧和總酚含量[28]。桐花樹（Aegiceras corniculatum）根和葉中的單寧能與一些金屬離子（如鐵、鎘等）絡合形成難溶性化合物，從而緩解重金屬毒性[29]。因此，調控次級代謝物含量可能是植物響應重金屬脅迫的適應性變化之一[30]。本研究發現，隨著外源錳濃度的增加，柱花草葉片原花青素、總酚和單寧含量呈現出逐漸增加的趨勢，而葉片類黃酮含量逐漸降低（圖3）。以上結果暗示，在過量錳脅迫下，柱花草可能通過調控次級代謝物含量從而響應錳毒害。

進一步對PPO和PAL酶活性進行分析，結果表明，400、600 ?mol/L過量錳處理顯著增加柱花草葉片PAL酶活性，但對PPO活性影響不明顯（圖4）。且定量PCR結果表明，在4個SgPALs基因中，200、400 ?mol/L錳處理分別增強了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草葉片中的表達（圖5）。PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、調控苯丙烷類合成代謝途徑的關鍵酶和限速酶[29]。研究發現，重金屬處理調控了PAL基因和蛋白表達以及酶活性。例如，在大豆和羽扇豆（Lupinus luteus）中，金屬鉛處理顯著增加了根系PAL酶活性以及PAL基因表達[31]。在山苔草（Carex putuoshan）中，金屬鉛和鋅處理提高了PAL蛋白表達量[32]。最近，通過蛋白質組學研究方法，發現錳毒害處理增強了PAL蛋白在柱花草根系中的表達[14]。因此，在本研究中，SgPAL3和SgPAL4基因可能參與了柱花草響應錳毒害的過程。另一方面，PAL參與的苯丙烷類代謝途徑可生成反式肉桂酸等中間產物，這些中間產物可進一步轉化為香豆素、綠原酸等，再通過多條途徑進一步轉化成類黃酮、木質素、生物堿、原花青素等級次代謝產物，這些次級代謝物在植物響應逆境脅迫中起重要作用[33-35]。因此，在本研究中，柱花草可能通過提高PAL酶活性以及增強SgPAL3和SgPAL4基因表達，從而通過苯丙氨酸途徑調控了次級代謝物含量，進而響應金屬錳毒脅迫。然而，SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草響應錳毒害過程中的生物學功能有待進一步研究。

綜上所述，過量錳脅迫增加柱花草葉片原花青素、總酚和單寧含量，而降低類黃酮。柱花草可能通過提高PAL酶活性以及增強SgPAL3和SgPAL4基因表達，從而調控次級代謝物的含量，進而通過苯丙氨酸途徑調控次級代謝響應金屬錳毒脅迫。本研究結果為探索柱花草響應金屬錳毒害機理及提供重要的理論依據。

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