基于瓠瓜轉錄組測序的EST-SSR標記的開發及其應用

許端祥 杜文麗 陳中釤 趙瑞麗 徐同偉 高山

摘? 要：為豐富瓠瓜分子標記庫、開發瓠瓜SSR標記、尋找有效的瓠瓜種質資源鑒定方法，利用MISA軟件對瓠瓜轉錄組測序獲得的87 518條unigene序列進行篩選，共檢測出11 029個SSR位點，發生頻率為9.85%，分布距離為平均每8.3 kb有1個SSR 位點。其中只包含1個SSR位點的unigene 序列有6759條，其發生頻率為7.72%;有1858條unigene序列含有2個及2個以上的SSR位點，發生頻率為2.123%;有920條unigene序列屬于混合形式的SSR標記，頻率為1.051%。瓠瓜轉錄組中優勢重復基序為單核苷酸、三核苷酸和二核苷酸，分別占總SSR位點的55.51%、25.41%和17.07%。A/T、AG/CT和AAG/CTT分別是單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的優勢重復基元，分別占總SSR重復類型的98.22%、55.39%和39.86%。用Primer 3.0共設計出8617對SSR引物，利用6對條帶清晰、多態性穩定的SSR引物構建了36個品種的指紋圖譜，部分位點具有高度的一致性，說明基因來源范圍較小。聚類分析顯示，在相似系數為0.68時將36個瓠瓜品種分為6類。其表明我國瓠瓜品種資源遺傳多樣性非常狹窄，利用現有瓠瓜資源開展品種選育潛力有限，應加強對野生特異種質的引進與發掘利用。利用瓠瓜轉錄組數據進行SSR標記開發，獲得的SSR位點能為其遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建提供更豐富可靠的標記選擇。

關鍵詞：瓠瓜;轉錄組;EST-SSR;指紋圖譜;遺傳多樣性

中圖分類號：S188+.1? ? ? 文獻標識碼：A

EST-SSR Marker Development and Utilization Based on Transcriptome of Lagenariasiceraria （Mol.） Stand.

XU Duanxiang， DU Wenli， CHEN Zhongshan， ZHAO Ruili， XU Tongwei， GAO Shan*

Fuzhou Institute of Vegetable Science， Fuzhou， Fujian 350111， China

Abstract： In order to enrich the molecular marker library， the SSR markers of Lagenariasiceraria （Mol.） Stand. 87 518 unigene sequences from bottle gourd transcriptome database were developed by the MISA software. A total of 11 029 SSR loci with an occurrence frequency of 9.85% were obtained from the transcriptome of Lagenariasiceraria （Mol.）， the distribution distance of the SSRs was about 1 SSR per 8.3 kb ESTs. Around 6759 unigene sequences contained a single SSR loci， and the occurrence frequency was 7.72%. Average of 1858 unigene contained 2 or more than 2 SSR loci， and the occurrence frequency was 2.123%. 920 unigene contained the mixed SSR loci， and the occurrence frequency was 1.051%. Among the SSR locis， mononucleotide， trinucleotide and dinucleotide were the major types， accounting for 55.51%， 25.41% and 17.07% of the total， respectively. A/T， AG/CT and AAG/CTT were the dominant elements among mononucleotide， dinucleotide and trinucleotide， accounting for 98.22%， 55.39% and 39.86% of the total SSRs. 8617 pairs of SSR primers were found by Primer 3.0， six primer pairs were selected and applied in PCR amplification of 36 varieties， based on the clear and repeatable polymorphism， the fingerprint of the cultivars was constructed， however， there were no differences in some loci probably due to narrow genes. The cluster analysis showed that 36 bottle gourd varieties were divided into six categories when the genetic similarity coefficient was 0.68. The results aslo showed that the genetic diversity basis of bottle gourd germplasm resources in China was very low， limiting the potential of variety development using the existing bottle gourd germplasm resources. The introduction and exploration of specific wild bottle gourd germplasm should be highly emphasized. The results indicated that SSR markers could be acquired in bottle gourd by transcriptome sequencing analysis and abundant SSR markers would provide more reliable markers for genetic diversity analysis and genetic mapping construction in bottle gourd.

Keywords： bottle gourd; transcriptome; EST-SSR; fingerprint; genetic diversity

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.015

瓠瓜[Lagenaria siceraria （Mol.） Stand.]隸屬于葫蘆科葫蘆屬1年生草本植物，是世界上重要的葫蘆科作物之一。瓠瓜原產于非洲南部低地，現廣泛分布于非洲、印度、東南亞等地區。我國是世界上栽培瓠瓜歷史最悠久的國家之一，目前廣泛栽培于長江流域及以南地區，現已成為我國南方地區春、夏季重要的瓜類蔬菜作物之一，在北方地區栽培面積也日趨增大[1-2]。瓠瓜種質資源眾多，但各品種間親緣關系的鑒定和分類工作尚未形成體系，僅在形態上的劃分不足以揭示瓠瓜種質資源的遺傳多樣性，盡管瓠瓜在生產上占有重要地位，但其遺傳學基礎研究卻遠遠落后于黃瓜、西瓜、甜瓜等其他瓜類作物，目前在分子水平上檢測瓠瓜不同種質間遺傳多樣性的研究還比較欠缺，嚴重阻礙了育種工作的進行。

近幾年隨著分子生物學技術飛速發展，作為重復性好、特異性強和多態性高的共顯性遺傳標記的微衛星序列即簡單重復序列（simple sequence repeat， SSR）分子標記早已成為植物品種鑒定、親緣關系鑒定和遺傳圖譜構建等育種工作的有力手段。通過構建基因組文庫、核酸數據庫篩選等傳統方法獲得SSR引物存在的工作量大、成功率低、多態性差等諸多問題，隨著第2代高通量測序技術的迅速發展，利用轉錄組測序的表達序列獲得EST-SSR標記比基于基因組序列開發進而獲得的SSR標記的方法具有更高的種間通用性，使SSR位點克隆篩選的工作效率大大提高[3]。迄今，在番茄[4]、黃瓜[5]、黃秋葵[6]等一些蔬菜作物中均已有轉錄組數據庫成功開發出EST-SSR標記并應用于遺傳多樣性分析及指紋圖譜構建的報道。瓠瓜的分類并沒有其他主要糧食作物那樣有著較明顯的劃分，由于人為選擇和長期的引種等原因，育種工作者只是根據不同的瓠瓜種質資源的表型特性進行粗略歸類，凸顯了在分子水平上檢測瓠瓜遺傳多樣性的重要性。瓠瓜的基因組序列信息和位點特異性分子標記（SSR、SNP等）長期以來少有報道，僅見王莎[1]利用SSR分子標記對瓠瓜種質資源的遺傳多樣性和親緣關系進行研究，因此，有必要在深度和廣度上進行拓展。

本研究應用Illumina高通量測序技術獲得豐富的瓠瓜轉錄組數據，通過搜索unigene中的SSR位點信息，分析其分布及組成特征并進行可用性評價，針對SSR位點的2側序列開發設計了大量SSR引物，并以福州市蔬菜科學研究所種質資源庫保存的具有不同優良性狀的共36個瓠瓜品種進行引物的有效性驗證，進而對36個瓠瓜品種進行了DNA指紋圖譜的構建和親緣關系分析，以期為瓠瓜種質鑒定、親緣關系分析、基因的定位及分子標記輔助選擇育種提供理論支撐，也為我國瓠瓜遺傳改良、育種親本選配、種質保護、核心種質庫構建等提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 轉錄組數據來源

從福州市蔬菜科學研究所瓠瓜種質資源庫中選取地方特有品種福州芋瓠作為轉錄測序材料。于2018年4月中旬播種，5月上旬定植于福州市蔬菜科學研究所基地，于花后6 d剪去嫩葉轉移至液氮速凍，?80 ℃保存備用。測序時每個單株構建1個文庫，委托上海凌恩生物科技有限公司采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法構建文庫進行無參轉錄組分析，經過濾后得到高質量的測序數據525 959 048個reads片段，共計77 337 803 108 bp（77.34 Gb）個核苷酸，采用Trinity進行序列組裝產生了87 518條unigene，平均長度為1027.79 bp。76.03%的unigene長度主要集中在1～1000 bp，堿基Q20大于98%，Q30大于94%，GC含量為56.54%。該測序結果可用于后續分析。

1.2? 材料來源及其DNA提取

用于SSR引物篩選和可用性評價的36個瓠瓜品種均來源于福州蔬菜科學研究所中心資源庫（表1），包括了31個國內品種及引自泰國5個品種，其均代表目前市場上栽培的主栽品種。采用CTAB法對瓠瓜基因組DNA進行提取。

1.3? 轉錄組SSR位點鑒別及SSR引物設計

使用MISA 程序（http：//pgrc.ikp-gaters le ben.de/misa）搜索瓠瓜SSR 位點搜索，包括2、3、4、5、6核苷酸最少重復次數分別為6、5、5、4和4次為判斷標準進行搜索，同時篩選復合型SSR，篩選標準為打斷SSR的堿基間隔小于或等于100 bp。使用Primer 3.0軟件對SSR重復單元前后的序列進行評價并分別設計3條引物。引物序列長度18～27 bp，GC含量為40%～60%，退火溫度57～63 ℃，上、下游引物的Tm值相差≤2 ℃，預期擴增產物長度100～500 bp，且無2級結構和2聚體。

1.4? EST-SSR 引物篩選和指紋圖譜代碼構建

隨機挑選并合成50對引物（華大生物科技有限公司）。PCR反應體系為20 μL，其中10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，5 U Taq酶0.3 μL，100 ng DNA 1.5 μL，10 μmol /L的上、下游引物各1 μL，10× Buffer（Mg2+）2.5 μL，加dd H2O補至20 μL（購自大連寶生生物有限公司）。PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min;37個循環，每個循環包括94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s（退火溫度因不同引物而異），72 ℃延伸1 min;最后72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳初篩，再用6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，160 V電壓，3 h，銀染顯色后觀察拍照。指紋圖譜代碼構建方法借鑒馬紅勃等[7]及段艷鳳等[8]的方法，對清晰、可重復的條帶進行記錄。按同一位點條帶有無分別賦值，有帶記為“1”，無帶記為“0”，模板缺失記為“9”，指紋圖譜的構建按照多態性條帶分子量從大到小依次進行記錄。

1.5? 數據處理

SSR 發生頻率為SSR的unigene數量與總unigene數量之比，SSR的出現頻率為SSR的個數與總unigene的數量比，SSR平均分布距離為1 kb以上的unigene的堿基數與SSR數量之比。指紋圖譜代碼統計結果錄入Excel軟件，利用Power Marker軟件計算PIC值，通過 NTSYSpc 2.10e 進行種質聚類分析。

2? 結果與分析

2.1? 瓠瓜轉錄組中SSR的分布及結構特點

瓠瓜轉錄組經測序組裝共產生了87 518條unigene，平均長度為1027.79 bp。用MISA軟件對1 kb以上的unigene進行檢索發現8617條unigene序列中存在11 029個SSR位點，SSR位點在瓠瓜轉錄組中總的發生頻率為9.846%，平均每8.3 Kb出現1個SSR;其中只包含1個SSR位點的unigene序列有6759條，其發生頻率為7.72%，有1858條unigene序列含有2個及2個以上的SSR位點，發生頻率為2.123%，有920條unigene序列屬于混合形式的SSR標記，頻率為1.051%。

SSR重復類型包含2核苷酸至6核苷酸重復5大類。其中3核苷酸比例最占優勢，占總SSR的65.02%，其次是2核苷酸占總SSR的31.29%;4核苷酸、5核苷酸和6核苷酸重復類型數量較少，分別只占總數的2.24%、0.75%和0.70%（表2）。

瓠瓜轉錄組SSR重復單元的重復次數分布在5～28次之間，其中5～10次的SSR共有5582個，占總數的92.77%;其次為11～28次的SSR共有435個，占總數的7.23%。瓠瓜轉錄組SSR的長度集中在11～311 bp之間，其中長度在11～20 bp的SSR達6621個;占總數的65.55%，長度在20 bp以上的SSR有3488個，占34.50%。

2.2? 瓠瓜轉錄組中SSR基序重復類型和頻率特征

瓠瓜轉錄組SSR種類豐富，6種SSR均有出現，但出現頻率不同，其中3核苷酸最多，2核苷酸次之，4核苷酸、5核苷酸、6核苷酸重復的數量較少。瓠瓜轉錄組中4907個SSR位點共含170種重復基序，2、3、4、5、6核苷酸重復分別有4、10、25、43和99種。從分布頻率來看（表3），以3核苷酸重復類型AAG/CTT出現最多，占總SSR的22.76%，占3核苷酸重復基序的總數的39.86%。其次是2核苷酸重復類型AG/CT，占總SSR的21.26%，占2核苷酸總數的55.39%。4核苷酸、5核苷酸尤其是6核苷酸重復基序分布較為分散，出現的次數在40以下，所占比例極低。

2.3? 瓠瓜轉錄組SSR引物設計、篩選及多態性分析

利用Primer 3.0軟件對含SSR位點的8617條unigene序列進行引物設計，共設計出8088對引物。隨機挑選50對不同重復單元（2、3、4、5、6核苷酸）的引物合成后對本所收集的36份瓠瓜DNA混樣進行SSR-PCR擴增，以驗證其有效性。根據引物設計要求，無帶和條帶高于750 bp的引物都不能進行后續實驗，50對引物中有4對引物無帶或者帶不清晰，其余46對PCR擴增產物與預期大小符合，有效擴增率達到92%，說明引物設計效果基本合格。在46對有效擴增引物中經過多次試驗確定最適退火溫度，篩選出6對多態性引物能將36份瓠瓜品種區分開，占有效擴增率的13%;共獲得86條條帶，其中多態性位點為59個，多態性比率為68.6%（圖1）;其中引物LsSSR25、LsSSR424和LsSSR3擴增位點數最多，分別為13、11和10個（表4）;每對引物有效多態性位點數在8～13個，每對引物平均擴增出9.8多態性位點;多態信息含量PIC值為0.299～0.839，其中YHSSR42的PIC值達到0.87，平均多態信息含量為0.513，說明選擇的引物適用于試驗瓠瓜樣品的指紋圖譜構建。

2.4? DNA數字指紋圖譜構建

根據篩選的6對SSR引物在36個瓠瓜品種的擴增結果，構建出36個品種資源的DNA數字

指紋圖譜（表5），可見部分位點在多數品種中呈現較高的一致性，說明36份瓠瓜的基因來源范圍較窄。但36個品種的DNA指紋圖譜均獨一無二，因此可用于瓠瓜品種資源的分類與鑒定。

2.5? 利用SSR標記對瓠瓜品種資源聚類分析

根據6對引物擴增的59個多態性位點，對36份瓠瓜供試品種資源進行了聚類分析，其遺傳相似系數變幅為0.60～0.97。在遺傳距離0.60處，36份瓠瓜劃分成2大類，在遺傳距離0.68處劃分為6類（圖2）：第1類包含有19份瓠瓜品種資源，按瓜皮色種質區分，除2份白綠色外其余均為綠色;其中長棒形的有6份，棒形的有8份，短棒形的有5份;6份來自中國福建，6份來自中國湖北，3份來自中國廣東，2份來自中國浙江，還有2份來自泰國。第2類有來源于中國湖北、中國廣東和泰國的3份瓠瓜品種資源;其中長棒形1份，短棒形2份;2份綠瓜皮色，1份綠白皮色。第3類有4份瓠瓜種質，瓜型、瓜皮色一致，且品種資源均來自中國福建。第4類包含來自福建和泰國2份瓠瓜品種資源，瓜型均為長棒形，瓜皮色分別為亮綠和綠色。第5類包含7份瓠瓜品種資源，其中長棒形1份，棒形4份，短棒形2份;4份瓜皮綠色，2份瓜皮綠白色，1份瓜皮亮綠色;來自福建和廣東的各有3份，1份來自泰國。來自廣東的瓜形短棒形、瓜皮色為綠白的瓠瓜被單獨列為一類。

3? 討論

本研究基于瓠瓜轉錄組獲得87 518條uni gene序列進行SSR位點搜尋，共檢測出11 029個SSR位點，總發生頻率為9.85%，分布距離為平均每8.3 kb有1個SSR位點，此結果略高于大王杜鵑（9.32%）[9]、花楸（6.86%）[10]、芒果（7.57%）[11]、枇杷（8.55%）[12]等的頻率范圍，但顯著低于蘿卜（20.37%）[13]、桃（20.76%）[14]和黃秋葵（20.59%）[6]的位點頻率，表明不同物種中轉錄組的SSR發生頻率并沒有特定的規律，在進化過程中不同的經歷都有可能影響SSR的位點發生頻率，同時受轉錄組SSR挖掘工具及篩選的條件影響[15]。但從總體上看瓠瓜轉錄組中SSR數量較豐富。

SSR重復類型也是轉錄組的重要特征之一。瓠瓜SSR重復類型，包含2核苷酸至6核苷酸重復5大類，其中3核苷酸比例最占優勢，占總SSR的65.02%;其次是2核苷酸占總SSR的31.29%;4核苷酸、5核苷酸和6核苷酸重復類型數量較少，分別占總數的2.24%、0.75%和0.70%。其與杜鵑[16]、菜薹[17]、黃秋葵[6]等作物的研究結果不盡相同，猜測原因是由于2、4和5核苷酸重復主要與非翻譯區（UTR）相關。而3、6核苷酸重復主要發生在編碼序列（CDS）內[18]，瓠瓜中3核苷酸重復比例最高，說明其轉錄組unigene中可能包含更多的CDS信息。進一步對重復基序進行分析，發現以3核苷酸重復類型AAG/CTT出現最多，占總SSR的22.76%;其次是2核苷酸重復類型AG/CT，占總SSR的21.26%。這與黃瓜[19]、蓖麻[20]、芝麻[21]、黃秋葵[6]等雙子葉植物現象相類似，高比例AAG/CTT和AG/CT基序的出現可能是雙子葉植物SSR的特征之一。

轉錄組測序的出現，使得EST數量迅速增加，許多植物中EST-SSR標記已被開發應用[22]，但瓠瓜EST-SSR標記鮮少報道。本研究利用基于瓠瓜轉錄組數據開發的SSR引物，篩選出6對多態性引物將36份瓠瓜品種資源區分開來，多態性比率為68.6%。多態性信息含量（PIC）是衡量引物多態性信息含量水平的重要指標（高：PIC>0.5、適中：0.25

根據6對引物擴增的59個多態性位點，為36份供試瓠瓜品種資源進行了聚類分析，其遺傳相似系數變幅為0.60～0.97。在遺傳相似系數為0.60處36份瓠瓜品種資源可分為2個類群。在遺傳相似系數為0.68處可分為6類：第1類包含有19份品種資源，來源地主要集中在福建和湖北，還有2份來自泰國;瓜皮色綠色的占89%，說明此類可以通過地域和果皮顏色不同來區分。第2類包含來源于湖北、廣東和泰國3份品種資源。第3類包含4份瓠瓜品種資源，瓜型均為長棒形，瓜皮色綠色，且種質資源均來自福建。第4類包含2份瓠瓜品種資源，來自福建和泰國，瓜型均為長棒形，瓜皮色分別為亮綠和綠色。第5類包含7份瓠瓜品種資源，其中來自福建和廣東的各有3份。第6類為來自廣東的短棒形、綠白瓜皮色的瓠瓜品種資源。通過聚類分析的結果表明，利用篩選得到的6對SSR引物可將36份瓠瓜品種資源中的大部分區分開，36份瓠瓜品種資源的聚類結果與種源地、瓜型和瓜皮色有很大的相關性。而王莎[1]利用14個SSR標記對44份瓠瓜品種的多樣性進行分析，表明相同瓜型的品種有聚集在一起的趨勢，不同品種資源的來源地分類卻不明顯。雖然本研究中仍有部分瓠瓜品種資源未能區分，其可能原因與市場上主栽瓠瓜品種間親緣關系近、不同地域之間的瓠瓜相互引種及同種異名等有關，且在瓠瓜的瓜皮色判斷上因栽培方式、人為因素等原因也容易出現混淆。

本研究結果表明，利用瓠瓜轉錄組數據開發出的SSR標記具有可行性，為瓠瓜品種資源遺傳圖譜構建、基因定位、克隆等育種工作奠定了基礎。現有瓠瓜核心品種資源間親緣關系近，在今后的育種工作中應加大國外品種資源或野生種質的引進，發掘更多的瓠瓜優異資源提高遺傳多樣性。

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