雞胚酶解多肽制備及其在HDF-α 細胞培養中的初步應用

耿 威，李 楊，戰鐵楠，耿曉宇，王莉紅，遲春萍

1.長春園生肽生物科技有限公司，吉林長春 130062；2.吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室，生命科學學院，吉林長春 130012；3.吉林省正合生物技術有限責任公司，吉林長春 130052；4.長春生物制品研究所有限公司，吉林長春 130062

蛋白水解物質可以為細胞生長提供氮源、多種營養成分、生長增殖及貼壁黏附因子類似物等。有研究認為蛋白水解物可以為動物細胞生長提供氨基酸，并且其中某些特殊活性肽段對于細胞增殖、產物表達等功能具有促進作用，短肽可直接進入細胞膜后水解為游離氨基酸，從而為細胞代謝提供氮源，分子量較大的肽類可以作為生長因子或保護劑。

目前，國外已有針對多種細胞系的專用水解物，主要為大豆肽、水解乳蛋白等，但未見到雞胚多肽在細胞培養上的應用。

雞胚即雞的胚胎，是受精雞蛋孵化至一定天數后，還未破殼完整的生命體。研究表明，雞胚中包含的營養成分包括蛋白質、多肽、氨基酸、碳水化合物 (葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、呋喃糖等 )、脂類、脂肪酸等。另外，雞胚中還包括多種生物活性物質，小分子活性肽、細胞因子，生長因子，細胞黏附成分等小分子蛋白質。阮光萍等已證實雞卵清提取液的不同組分對細胞增殖具有促進作用，但并未研究其水解物的特性。對于雞胚的酶解多肽在細胞培養中的應用還未見報道。

本研究對雞胚進行酶消化裂解后經超濾純化獲得相應分子量的蛋白肽，并將該多肽添加至細胞培養液中培養細胞，以HDF-α 細胞為模型，對該活性多肽在細胞培養中的作用展開了研究，為雞胚酶解蛋白在HDF-α 細胞培養等中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

胰酶（trypsin，TR，美國，Sigma 公司）；MTT（美國，Sigma 公司）；DSMO（美國，Sigma 公司）；DPPH（美國，Sigma 公司）；細胞內ROS 檢測試劑盒（美國，Sigma 公司）；其余試劑均為國產試劑。

1.2 主要儀器

JJ-2 型組織搗碎勻漿機；VCX130 型超聲破碎儀；AHP-0013 型截留分子量為50KD 的中空纖維柱；K1160 全自動凱氏定氮儀；RPLC-MS/MS 系統由Finnigan Surveyor 液相色譜泵、線性離子阱（LTQ）質譜組成；Magic C18 AQ 反相色譜填料（5 μm，12 nm）；石英毛細管（75 μm×120 mm）；PHS-25 型酸度計；多功能酶標儀（TECANGENios）。

1.3 雞胚酶解多肽原液制備

1.3.1 雞胚準備及活性成分的初步提取

SPF 級受精雞蛋置37.0±0.5 ℃孵化箱孵化，每2 h 自動翻蛋一次，半月后置-20 ℃停止孵化。對孵化的雞蛋進行表面消毒，除蛋殼后取出雞胚在4 ℃下以2 500 r/min 組織勻漿機勻漿，倒入滅菌后的密封盒中，放到-30 ℃的冷庫中冷凍72 h，融化后于4 ℃的環境中對其進行細胞超聲破碎，加入等量的注射用水，獲得粗純液，放置于4 ℃的冷藏庫中備用。

1.3.2 精制提取

取1.3.1 制備的粗純液，調pH 至7.5，加入胰酶至濃度為2.5%（質量分數）50 ℃熱水浴， 水解1 h，在4 ℃下4 500 r/min 離心20 min，上清液超濾過50 kDa的濾膜，收集50 kDa以內的超濾液，調pH 值至6.8，除菌過濾為多肽原液。

1.3.3 原液理化性質分析

對1.3.2 獲得的活性多肽原液經凱氏定氮法測定原液蛋白肽含量，計算分析制備工藝的收獲率及回收率，經shotgun 分析蛋白及肽段組成及各肽段理化性質，并對多肽原液進行pH、滲透壓及微生物限度檢查、細菌內毒素檢測鑒定。

1.4 雞胚酶解多肽在細胞培養中的作用研究

將制檢后的原液應用于人真皮成纖維細胞HDF-α（第六代）培養，觀察其增殖情況，并用理化方法處理共同孵育的細胞，觀察其耐受情況。每項試驗均進行三次重復性實驗。用SAS9.4 進行統計學分析比較，Bonferroni 校正（t1、P1 為與對照比較；t2、P2 為與上一個劑量組比較）。

1.4.1 促進細胞增殖功能研究

以MTT 法測定活性多肽對細胞增殖的促進作用，將人真皮成纖維細胞HDF-α（第六代）以1×104個/ 孔接種于96 孔板中，培養24 h 后，向96 孔板中分別加入含有不同濃度的多肽培養液（0，20，50，100，250， 500 μg/mL）繼續培養48 h。在培養結束前4 h 每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），培養結束后，產生的紫色結晶用DMSO 溶解，在550 nm 波長條件下測定光吸收值。

1.4.2 在紫外損傷模型中雞胚酶解多肽對細胞保護及修復的作用的研究

將HDF-α 細胞（第六代）以1×104個/孔接種于96 孔板中，24 h 后，用含有不同濃度的多肽培養液（0，20，50，100，250， 500 μg/mL）處理細胞，30 min 后，2 000 焦耳的紫外照射細胞，繼續培養48 h。在培養結束前4 h 每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL）。產生的紫色結晶用DMSO 溶解，在550 nm 波長條件下測定光吸收值。

1.4.3 抗氧化功能研究

通過ROS 檢測試劑盒檢測細胞內的ROS 含量來研究雞胚酶解多肽在細胞中的抗氧化的功能：將HDF-α 細胞接種于6 孔板內，培養24 h 后，裝載探針DCFH-DA（10 μm），37 ℃細胞培養箱內孵育30 min。分別加入含有不同濃度多肽的培養液 （100 μg/mL，200 μg/mL，400 μg/mL），37 ℃孵育 30 min 后，加入200 μm 的H2O2再孵育1 h。收集細胞，用PBS 重懸細胞，利用多功能酶標儀（TECAN，GENios）測定這些細胞的熒光值：激發光和發射光波長分別為：488 nm、525 nm。

2 結果與分析

2.1 雞胚酶解多肽原液理化性質分析

經凱氏定氮法測定，原液蛋白肽的含量為16 mg/mL；經計算收率為91.1%；回收率為93.2%；經shotgun 分析，多肽達300 種之多，分別來自70 種不同的蛋白；經測定，最終的多肽原液pH 為6.82±0.05，滲透壓為286 mmol/L，微生物限度檢查及細菌內毒素檢查合格。以上結果表明，本文所介紹的制備工藝制備的雞胚酶解多肽原液各項理化性質符合細胞培養的條件，可將原液添加至細胞培養液中進行多肽對細胞培養影響的研究。

2.2 雞胚酶解多肽對HDF-α 細胞增殖的影響

當多肽含量在250 μg/mL 和 500 μg/mL 時可以顯著促進HDF-α 細胞生長，其增殖的程度分別為20%和40%，經統計學分析顯示：加入50 μg/mL、100 μg/mL 濃度時與對照相比增殖結果有差異，組間差異不顯著，加入250 μg/mL、500 μg/mL 其對照、組間相比差異顯著，表明高濃度的原液能更有效的促進細胞的增殖。

2.3 雞胚酶解多肽在細胞紫外損傷保護及修復模型中的作用

雞胚酶解多肽可較好地保護HDF-α 細胞避免紫外損傷，并可促進細胞的紫外損傷修復，多肽含量在0 ～250 μg/mL 范圍內其保護效果與多肽含量具有量效關系，當含量為250 μg/mL 時其保護效果接近100%，經統計學分析顯示：當加入50 μg/mL以上濃度與對照比差異就不顯著了，說明該濃度原液的加入細胞即可抵抗紫外的損傷；最高濃度與前一個劑量組相比具有差異性，說明該劑量保護效果比前一個劑量組具有更好的細胞保護作用。

2.4 雞胚酶解多肽抗細胞內氧自由基功能

細胞內抗自由基試驗顯示：100 μg/mL 活性多肽溶液能夠高效消除H2O2產生的自由基，其消除效率高達77%。經統計學分析顯示：與對照組差異非常顯著，表明加入100 μg/mL 多肽原液即可有效的抵抗H2O2對細胞產生的影響；隨原液加入濃度的增加各組也有顯著性差異，可能的原因是加入的多肽原液因細胞增殖較多引起的熒光值的升高。

3 討 論

細胞的生長主要與培養基中的氨基酸含量、生長因子等有關，蛋白酶解多肽的添加主要為細胞生長提供了氮源、碳源及生長和黏附因子等，這種天然多肽產物的添加照普通培養基提供的培養條件更有利細胞的貼壁生長、細胞間的黏附及細胞增殖，并且蛋白的酶解產物含有的多肽及蛋白分子量較小，也去除了免疫蛋白及補體蛋白，照普通培養添加的血清更為安全，現普遍研究的為大豆蛋白酶解產物，乳清蛋白酶解產物，也被制成商品化的制品添加至特定的培養基中供特定的細胞培養使用，通過文獻檢索發現卵清蛋白酶解產物在細胞培養中的應用也有學者進行過研究，但對于雞胚酶解多肽在細胞培養中的應用卻未曾見到。

雞胚即雞的胚胎，是受精雞蛋孵化至一定天數后，還未破殼完整的生命體。雞胚照普通的雞蛋相比，含有更多的促進細胞增殖分化表達的蛋白質及蛋白肽，也含有更多的細胞生長因子及細胞黏附因子，其酶解產物也更加適合添加入細胞培養液中，起到促進細胞增殖分化及保護細胞的作用。

HDF-α 細胞即人皮膚成纖維細胞，是皮膚真皮網織層中最重要的細胞，是皮膚衰老和細胞受損后的主要修復細胞，它不但能夠促進表皮細胞的遷移、增殖和分化，還能分泌大量的膠原蛋白、彈性纖維蛋白及多種細胞修復因子，具有強大的自我更新能力，對培養環境的影響較為敏感，廣泛應用于對細胞增殖、修復的影響的研究中，HDF-α 細胞更適合作為模型來研究雞胚酶解多肽對細胞增殖及細胞損傷修復的影響。

本文制備出了分子量小于50kDa 的雞胚酶解多肽原液，經鑒定各項指標符合細胞培養要求，將該原液添加至HDF-α 細胞培養液中，證明該酶解多肽可有效的促進HDF-α 細胞增殖，并且在細胞紫外線損傷保護修復模型中，該活性肽溶液表現出較好的保護效果。紫外線損傷主要表現在使細胞染色體DNA 及RNA 等遺傳物質受到損傷，引起細胞死亡，也可因紫外線作用產生O3，形成更多氧自由基，引起細胞蛋白及遺傳物質的變性，從而殺死細胞，而雞胚酶解多肽中含有一些蛋白肽及還原性的氨基酸可幫助細胞進行遺傳物質的修復，并可抵抗氧自由基的損傷，為驗證，本文設立了抗氧自由基的試驗，結果證明酶解多肽能夠高效消除H2O2產生的氧自由基，其消除效率可高達77%，有效的保護了HDF-α 細胞免受氧自由基的損傷。

本文以HDF-α 細胞作為模型，研究了雞胚酶解多肽對細胞增殖的促進作用，及保護細胞抵抗紫外及氧自由基的損傷的作用，為雞胚酶解多肽應用于細胞培養提供了理論依據。

參考文獻：略