缺血再灌注模型大鼠腦白質(zhì)擴(kuò)散張量成像研究

張嘉泳，李樂(lè)，金婷婷，張宇豪，何肖君，林華偉，李鉆芳，梁勝祥，柳維林，陶靜

腦卒中是一種發(fā)病率、致殘率高的急性腦血管病[1]，腦卒中患者常伴隨不同程度的功能障礙，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康和生活質(zhì)量[2]。研究發(fā)現(xiàn)腦卒中后神經(jīng)功能障礙與其腦白質(zhì)病變密切有關(guān)，大腦缺血缺氧引起白質(zhì)纖維束受損，腦網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)完整性破壞[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠損傷后大腦白質(zhì)纖維損傷，髓鞘脫失，軸突損傷，神經(jīng)功能障礙。然而，缺血性腦卒中在不同時(shí)期的缺血特點(diǎn)和病理生理復(fù)雜多樣，腦白質(zhì)病變的機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。彌散張量成像（diffusiontensorimaging，DTI）是一種無(wú)創(chuàng)性白質(zhì)纖維束成像的磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）技術(shù)，通過(guò)分析組織中水分子的彌散運(yùn)動(dòng)，可以反映大腦白質(zhì)的微結(jié)構(gòu)改變[6]。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞完整性破壞、神經(jīng)纖維變形等白質(zhì)結(jié)構(gòu)病理改變，其水分子擴(kuò)散狀態(tài)顯示異常[7]。因此DTI 對(duì)于觀察腦梗死后白質(zhì)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響有重要意義。本研究利用DTI 成像技術(shù)觀察缺血再灌注模型大鼠腦白質(zhì)擴(kuò)散張量的變化規(guī)律，為臨床診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)提供影像學(xué)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 清潔級(jí)Sprague-Dawley 大鼠（雄性，體質(zhì)量230±20g）24 只，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(SCXK(滬)2012-0002)。動(dòng)物飼養(yǎng)在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，光照時(shí)間為12h 晝夜周期，給予自由飲水和飼料。當(dāng)體質(zhì)量達(dá)(260±20)g 時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照隨機(jī)數(shù)字表法，24 只雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組各12 只。所有的實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)章，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 術(shù)前2 組大鼠均禁食24h，模型組參照改良版Koizumi 方法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型[8],使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，大鼠俯臥位置于手術(shù)臺(tái)，從頸正中線切開(kāi)，分離淺筋膜和皮下肌肉，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端用縫合線結(jié)扎，頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈使用微型血管夾夾閉。在頸外動(dòng)脈近端剪一小切口，并用線栓經(jīng)切口從頸外動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈。2h 后，將線栓拔出至頸總動(dòng)脈分叉處，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組大鼠僅進(jìn)行術(shù)前麻醉和分離血管，不結(jié)扎和導(dǎo)入線栓，隨即縫合，清潔創(chuàng)口。術(shù)中大鼠直腸溫度維持在36.5℃～37.5℃，術(shù)后置于保溫箱中，直到從麻醉中蘇醒。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 在缺血再灌注后24h、7d 和14d 分別對(duì)2 組大鼠進(jìn)行測(cè)定，①采用改良神經(jīng)功能缺損程度評(píng) 分 （modified Neurological Severity Scores,mNSS）[9]：由運(yùn)動(dòng)，感覺(jué)，平衡和反射測(cè)試這4 部分組成，總分18 分，分?jǐn)?shù)越高神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。②磁共振掃描：采用德國(guó)布魯克公司7.0T 小動(dòng)物磁共振儀進(jìn)行磁共振成像，將動(dòng)物麻醉后置于掃描架上，選用大鼠頭顱線圈成像。分別進(jìn)行T2 加權(quán)成像(T2-weighted image,T2WI)及DTI 檢查。掃描參數(shù)如下：T2WI 具體掃描參數(shù)如下：重復(fù)時(shí)間4200ms，回波時(shí)間35ms，層厚1mm，層數(shù)21，F(xiàn)OV=32mm×32mm，矩陣為256×256。DTI 成像采用平面回波序列，具體掃描參數(shù)如下：b 值=1000s/mm2，重復(fù)時(shí)間12000 ms，回波時(shí)間32.248ms，層厚0.56mm，層數(shù)48，F(xiàn)OV=32mm×32mm，矩陣大小為128×128。DTI 圖像應(yīng)用FSL 和spmratIHEP 軟件進(jìn)行分析[10-11]，具體步驟如下：a.對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行渦流矯正，消除渦流效應(yīng)的影響；b.手動(dòng)顱骨剝離得到全腦掩膜圖像，并計(jì)算各動(dòng)物的b0 圖像和全腦平均彌散率（meandiffusion，MD）和各向異性分?jǐn)?shù)（fractionanisotropy，F(xiàn)A）圖像；c.將b0 像配準(zhǔn)到大鼠標(biāo)準(zhǔn)腦模板，并保留變換函數(shù)，用于對(duì)應(yīng)動(dòng)物的相關(guān)腦區(qū)MD、FA 圖像，實(shí)現(xiàn)MD、FA 圖像向大鼠標(biāo)準(zhǔn)腦模板的空間標(biāo)準(zhǔn)化；d.對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化后的MD、FA 圖像做高斯平滑處理，平滑核為體素的3 倍大小；e.基于一般線性模型，采用方差分析，分別對(duì)平滑后的MD、FA 圖像進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，認(rèn)為P＜0.05（FDR 校正）,團(tuán)簇＞10，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將DTI 數(shù)據(jù)傳入DiffusionToolkit 工作站，各選取左右側(cè)大腦的胼胝體、海馬、杏仁核、紋狀體、運(yùn)動(dòng)皮層和感覺(jué)皮層作為感興趣區(qū)域(regionsofinterest,ROI）,分別測(cè)量ROI 的MD 值和FA 值。MD 值增加表示水分子彌散增高，F(xiàn)A 值取值在0～1，F(xiàn)A 值增加表示白質(zhì)纖維連接增強(qiáng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以±s表示，神經(jīng)功能評(píng)分采用重復(fù)設(shè)計(jì)方差檢驗(yàn)，相關(guān)腦區(qū)MD 值和FA 值不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差齊，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS 評(píng)分比較 假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀；模型組較假手術(shù)組大鼠缺血再灌注后24h、7d 和14d 的mNSS 評(píng)分均升高(均P＜0.01)，且缺血再灌注后7d 的mNSS 評(píng)分低于上一時(shí)間點(diǎn)(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積 模型組缺血再灌注后，T2 加權(quán)成像相關(guān)腦組織呈高信號(hào)并顯示為灰白色，其相應(yīng)部位為梗死病灶區(qū)域，隨時(shí)間推移高信號(hào)區(qū)域面積減少，見(jiàn)圖1a～c。

表1 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS 評(píng)分 分，±s

表1 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)mNSS 評(píng)分 分，±s

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.01；與缺血再灌注后24h 比較，bP＜0.05，Mauchly 球形度檢驗(yàn)P 值=0.511，時(shí)間效應(yīng)Greenhouse-Geisser P＜0.05，說(shuō)明評(píng)分有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)；時(shí)間×組別效應(yīng)Greenhouse-Geisser P＜0.05，說(shuō)明時(shí)間因素隨分組的不同而不同。

缺血再灌注后14d 0 7.92±2.19a組別n假手術(shù)組模型組12 12缺血再灌注后24h 0 10.75±1.86a缺血再灌注后7d 0 8.92±1.68ab

圖1 a～c 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的T2WI 成像

2.3 2 組大鼠健患側(cè)腦區(qū)MD 值和FA 值 缺血后24h，模型組較假手術(shù)組患側(cè)所有腦區(qū)MD 值均顯著下降(P＜0.01，0.05)，7d 后呈假正常化，與假手術(shù)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，14d 均高于假手術(shù)組(P＜0.01，0.05)；缺血后24h，患側(cè)胼胝體、海馬及紋狀體的FA值均顯著下降(均P＜0.05)，7d 時(shí)均持續(xù)下降(P＜0.01，0.05)，除了胼胝體，其他腦區(qū)在14d 達(dá)到最低水平(P＜0.01，0.05)。缺血后24h，除了感覺(jué)皮層，健側(cè)腦區(qū)MD 值均高于假手術(shù)組(P＜0.01，0.05)，缺血后7d，除了胼胝體和海馬，其他腦區(qū)MD 值均低于假手術(shù)組(P＜0.01，0.05)，缺血后14d 與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺血后24h，除了感覺(jué)皮層，其他腦區(qū)FA 值均高于假手術(shù)組(P＜0.01，0.05)，缺血后7d及14d 與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2a～c，3a～c 和表2，3，4，5。

圖2 a～c 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的MD 圖

圖3 a～c 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的FA 圖

表2 2 組大鼠患側(cè)腦區(qū)MD 值比較 ‰，±s

表2 2 組大鼠患側(cè)腦區(qū)MD 值比較 ‰，±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.01，bP＜0.05

模型組腦區(qū)假手術(shù)組胼胝體海馬杏仁核紋狀體運(yùn)動(dòng)皮層感覺(jué)皮層缺血再灌注后14d 1.07±0.24a 1.01±0.07a 0.91±0.23a 1.11±0.26b 1.14±0.09b 1.13±0.30a 0.80±0.06 0.84±0.08 0.53±0.03 0.77±0.04 1.03±0.08 0.86±0.14缺血再灌注后24h 0.63±0.13b 0.73±0.11b 0.45±0.10b 0.59±0.10a 0.71±0.12a 0.57±0.14a缺血再灌注后7d 0.93±0.18 0.91±0.14 0.68±0.17 0.83±0.12 0.97±0.10 0.85±0.02

表3 2 組大鼠健側(cè)腦區(qū)MD 值比較 ‰，±s

表3 2 組大鼠健側(cè)腦區(qū)MD 值比較 ‰，±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.01，bP＜0.05

模型組腦區(qū)假手術(shù)組胼胝體海馬杏仁核紋狀體運(yùn)動(dòng)皮層感覺(jué)皮層缺血再灌注后14d 0.83±0.05 0.98±0.06 0.56±0.04 0.77±0.04 0.99±0.10 0.77±0.04 0.80±0.06 0.91±0.06 0.53±0.05 0.78±0.05 1.06±0.09 0.83±0.11缺血再灌注后24h 0.93±0.12b 1.04±0.13b 0.62±0.08b 0.84±0.07b 0.80±0.10a 0.76±0.04缺血再灌注后7d 0.85±0.15 0.94±0.14 0.47±0.07a 0.73±0.05b 0.90±0.16b 0.71±0.05b

表4 2 組大鼠患側(cè)腦區(qū)FA 值比較±s

表4 2 組大鼠患側(cè)腦區(qū)FA 值比較±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.01，bP＜0.05

模型組腦區(qū)假手術(shù)組胼胝體海馬杏仁核紋狀體運(yùn)動(dòng)皮層感覺(jué)皮層缺血再灌注后14d 0.28±0.06 0.23±0.02a 0.36±0.05a 0.19±0.06b 0.23±0.03b 0.20±0.02a 0.32±0.06 0.29±0.03 0.47±0.05 0.28±0.02 0.27±0.03 0.28±0.02缺血再灌注后24h 0.26±0.05b 0.25±0.03b 0.45±0.05 0.23±0.03b 0.27±0.04 0.27±0.03缺血再灌注后7d 0.27±0.05b 0.24±0.03a 0.40±0.07b 0.22±0.07b 0.24±0.02b 0.22±0.04b

表5 2 組大鼠健腦區(qū)FA 值比較±s

表5 2 組大鼠健腦區(qū)FA 值比較±s

與假手術(shù)組比較，aP＜0.01，bP＜0.05

模型組腦區(qū)假手術(shù)組胼胝體海馬杏仁核紋狀體運(yùn)動(dòng)皮層感覺(jué)皮層缺血再灌注后14d 0.35±0.03 0.28±0.02 0.47±0.05 0.30±0.02 0.25±0.04 0.24±0.02 0.35±0.05 0.29±0.04 0.48±0.07 0.30±0.01 0.26±0.05 0.25±0.02缺血再灌注后24h 0.39±0.03b 0.31±0.03b 0.53±0.03b 0.34±0.02a 0.33±0.05a 0.27±0.04缺血再灌注后7d 0.34±0.03 0.27±0.03 0.48±0.04 0.30±0.02 0.26±0.04 0.24±0.03

3 討論

大腦缺血缺氧使腦組織內(nèi)細(xì)胞水腫壞死[12]。有研究表明，在腦卒中的急性期和亞急性期，由于細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫[13]，神經(jīng)元死亡，白質(zhì)結(jié)構(gòu)小梁破壞，彌漫性脫髓鞘[14]。白質(zhì)死亡可導(dǎo)致髓鞘損失，軸突損傷，纖維完整性破壞，并最終表現(xiàn)為腦卒中患者的神經(jīng)缺損癥狀[15]。

DTI 成像可以直觀反映缺血性腦卒中患者白質(zhì)纖維束的損傷程度，這對(duì)于大腦神經(jīng)功能的損傷情況及預(yù)后評(píng)估具有重要的指導(dǎo)意義[16]。MD 和FA 是DTI 的常用參數(shù)，MD 是測(cè)量水分子的彌散運(yùn)動(dòng)的限制性，能夠反映細(xì)胞膜的完整性。FA 值能夠反映白質(zhì)纖維是否完整，F(xiàn)A 值的降低提示白質(zhì)同質(zhì)性的紊亂[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血后損傷側(cè)MD 值最初是明顯下降，然后升高呈假正常化，最后比正常高；而FA值在缺血后24h、7d 和14d 均下降的。這與之前研究的結(jié)果相似[18]。在急性期，由于細(xì)胞毒性水腫導(dǎo)致水分子擴(kuò)散受限，MD 值減少[19]；隨著血腦屏障的破壞，血源性水腫導(dǎo)致水分子沿垂直于髓鞘方向的擴(kuò)散限制增加[20]，F(xiàn)A 值下降。當(dāng)水腫高峰期過(guò)去，水腫被吸收并漸漸消退，MD 值出現(xiàn)假正常化。在慢性期，液化壞死的腦組織被吞噬清除，毛細(xì)血管增多，神經(jīng)纖維修復(fù)再生，水分子彌散增高，MD 值也隨之升高；但因?yàn)榇竽X結(jié)構(gòu)破壞不可逆損傷，膠質(zhì)瘢痕形成，腦組織的完整性破壞[21]，因此FA 值不可恢復(fù)性降低。關(guān)于急性期時(shí)FA 值的變化不同研究有不同結(jié)果[22]，產(chǎn)生這樣的差異可能與缺血的嚴(yán)重程度和損傷范圍有關(guān)。由此可推測(cè)腦缺血后DTI 的變化規(guī)律為：①在急性期，F(xiàn)A 值升高，MD 值下降；②在亞急性期，F(xiàn)A 值下降，MD 升高；③在慢性期，F(xiàn)A 值持續(xù)性降低，MD 值比正常高。這提示DTI 能夠表征腦缺血階段以及分辨不同階段腦白質(zhì)損傷程度。

另外，DTI 結(jié)果還顯示損傷對(duì)側(cè)出現(xiàn)異常信號(hào)。健側(cè)缺血后24h MD 值升高，缺血后7d MD 值減少，14d 后恢復(fù)正常；健側(cè)缺血后24h FA 值升高，隨后恢復(fù)正常，這提示除了缺血側(cè)白質(zhì)功能發(fā)生改變，健側(cè)白質(zhì)功能也受到了影響。關(guān)于急性腦缺血后損傷大腦對(duì)側(cè)DTI 結(jié)果與白質(zhì)功能的機(jī)制研究較少。有文獻(xiàn)報(bào)道，腦缺血后對(duì)側(cè)丘腦及缺血鏡像區(qū)各向異性增強(qiáng),并隨著功能恢復(fù)下降，可能與半球間抑制作用減弱和健側(cè)大腦功能結(jié)構(gòu)重塑相關(guān)[23-24]。研究認(rèn)為，兩側(cè)大腦半球存在交互性半球間抑制，正常情況下兩者處在興奮和抑制的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。當(dāng)患側(cè)發(fā)生缺血損傷，抑制健側(cè)的能力就會(huì)下降，從而健側(cè)半球的興奮性升高。隨著患側(cè)恢復(fù)，其對(duì)健側(cè)的抑制作用增強(qiáng)，健側(cè)的興奮作用減弱[25]。

腦缺血后，白質(zhì)完整性受損，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞，不僅梗死灶區(qū)域的神經(jīng)功能發(fā)生障礙，與梗死灶有神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的相鄰部位和遠(yuǎn)隔區(qū)域也會(huì)受到影響[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，大腦損傷后大部分白質(zhì)存在持續(xù)性的損害，包括缺血側(cè)胼胝體、海馬額葉、杏仁核、紋狀體、運(yùn)動(dòng)皮層、感覺(jué)皮層。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)缺血對(duì)側(cè)海馬、胼胝體、紋狀體、杏仁核、運(yùn)動(dòng)皮層相關(guān)腦區(qū)也發(fā)生代償性改變。海馬、胼胝體和杏仁核是參與邊緣系統(tǒng)神經(jīng)環(huán)路的重要組成部分，它們?cè)谇楦泻陀洃浀男纬伞⑿揎椇途S持中發(fā)揮重要的作用[27]。有研究表明[28-30]，腦卒中患者除了缺血灶局部白質(zhì)發(fā)生損傷，其他遠(yuǎn)隔區(qū)域如海馬、丘腦、杏仁核等白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性降低，這可能是因?yàn)槿毖钌窠?jīng)纖維發(fā)生沃勒變性，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)隔區(qū)域發(fā)生白質(zhì)功能損傷，使相關(guān)學(xué)習(xí)記憶和認(rèn)知功能下降。感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)皮層與紋狀體神經(jīng)環(huán)路參與感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能的調(diào)控[31]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)[32]，MCAO 大鼠損傷側(cè)運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)和紋狀體區(qū)FA 值減少，運(yùn)動(dòng)皮層-紋狀體神經(jīng)纖維傳導(dǎo)束減少，大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分降低。胼胝體作為連接大腦兩側(cè)半球最大白質(zhì)聯(lián)合，對(duì)于半球間信息傳遞和功能協(xié)調(diào)整合有重要意義。最近的研究表明[33]，腦卒中后胼胝體纖維的恢復(fù)能使半球間興奮抑制平衡重建，促進(jìn)受損大腦白質(zhì)功能重組。

本研究通過(guò)DTI 成像技術(shù)縱向追蹤觀察缺血再灌注模型大鼠腦白質(zhì)損傷的變化特點(diǎn)，結(jié)果提示DTI能夠反映不同時(shí)期腦白質(zhì)損傷的特點(diǎn)，患側(cè)白質(zhì)隨著時(shí)間的推移演變?yōu)椴豢赊D(zhuǎn)逆的結(jié)構(gòu)破壞，健側(cè)白質(zhì)代償變化可能與交互性半球間抑制作用有關(guān)。關(guān)于利用DTI 分析腦缺血后相關(guān)神經(jīng)環(huán)路纖維的損傷特點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。