小美牛肝菌輔助治療運(yùn)動(dòng)障礙效果

楊華莉，王曉燕，李克雷

（河北民族師范學(xué)院體育系，河北 承德 067000）

小美牛肝菌（Boletus speciosus） 是牛肝菌屬（Boletus） 真菌，廣泛分布于世界各地，是一種具有微毒性的菌類，過量攝入容易出現(xiàn)“幻視”中毒，使人產(chǎn)生幻覺[1]。其主要原因是含有一些異惡唑衍生物和生物堿物質(zhì)，容易造成人中樞神經(jīng)紊亂，使人產(chǎn)生幻覺[2]。但小美牛肝菌中也含有一些抗氧化物和生物堿類化合物，如γ-三甲胺基丁酸、硫組氨酸甲基銨鹽等，這些有效成分能降低膽固醇和改善冠狀動(dòng)脈血流量，對心肌缺氧和增加運(yùn)動(dòng)耐力有一定功效。而且生物堿是一種中樞神經(jīng)興奮劑，可以減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。小劑量使用可以對一些抑郁、焦慮等神經(jīng)系統(tǒng)運(yùn)動(dòng)障礙病癥起到輔助治療的效果[3]。

1 材料與試劑

BS-224電子天平，德國SARTORIUS公司；DZ-1BC真空干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；FW400A萬能粉碎機(jī)，北京科偉永鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠；TC31-10B小鼠轉(zhuǎn)輪式疲勞儀，北京精測電子科技有限公司；XR-XZ301開場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司。

茚三酮試劑、雙縮脲試劑、Fehling試劑，沈陽先創(chuàng)化工有限公司；a-萘酚、濃硫酸、乙醇、鹽酸、氫氧化銨，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；硅鎢酸、碘化鉍鉀、碘化汞鉀，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine hydrobromide），上海莼試生物技術(shù)有限公司；以上試劑均為分析純。

2 小美牛肝菌定性檢測

采用系統(tǒng)預(yù)試法對小美牛肝菌進(jìn)行若干定性試驗(yàn)，根據(jù)其成分理化性質(zhì)不同，利用特征顯色、沉淀反應(yīng)對小美牛肝菌的水提取液樣品進(jìn)行定性檢測。

2.1 樣品及供試液制備

試驗(yàn)用小美牛肝菌購自云南木水花野生菌市場，取一定量的新鮮小美牛肝菌清凈、晾干、切片，在60℃下烘箱中干燥60 min后，上粉碎機(jī)制成粉末狀，過80目篩備用。水提取液的制備：稱取小美牛肝菌粉末50 g于錐形瓶中，加去離子水500 mL混合均勻，浸漬24 h后用濾紙過濾，取濾液即得小美牛肝菌樣品試液。

2.2 氨基酸和多肽及蛋白質(zhì)定性試驗(yàn)

利用加熱條件下氨基酸或多肽與茚三酮發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成紫藍(lán)色物質(zhì)的原理進(jìn)行定性試驗(yàn)[4]。取小美牛肝菌樣品試液滴在濾紙上，再滴茚三酮試劑，烘箱烘干后觀察濾紙，發(fā)現(xiàn)濾紙上出現(xiàn)深藍(lán)紫色斑塊；再取小美牛肝菌樣品試液1 mL放入試管，加入雙縮脲試劑搖勻，觀察試管發(fā)現(xiàn)呈紫紅色；茚三酮和雙縮脲試驗(yàn)均表明小美牛肝菌樣品中含有氨基酸、多肽類物質(zhì)。取小美牛肝菌樣品試液1 mL放入試管，加5%硫酸搖勻發(fā)現(xiàn)試管溶液變混濁，有少量沉淀物產(chǎn)生，表明小美牛肝菌樣品中可能含有蛋白質(zhì)物質(zhì)。

2.3 還原糖和多糖及糖苷類定性試驗(yàn)

按參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行試驗(yàn)，通過Fehling反應(yīng)來進(jìn)行還原糖鑒定。取小美牛肝菌樣品試液1 mL放入試管，加數(shù)滴Fehling試劑，并在100℃下水浴5 min，觀察發(fā)現(xiàn)有棕紅色沉淀物產(chǎn)生，證明小美牛肝菌樣品含有還原糖；取小美牛肝菌樣品試液1 mL放入試管，加數(shù)滴a-萘酚溶液搖勻，再沿試管壁緩慢滴入2滴濃硫酸，觀察試管中濃硫酸的接觸面，發(fā)現(xiàn)有紫紅色環(huán)，Molish反應(yīng)證明了小美牛肝菌樣品中含有多糖或糖苷類物質(zhì)。

3 小鼠運(yùn)動(dòng)障礙試驗(yàn)

帕金森病是一種神經(jīng)疾病，常見于老年群體，主要表現(xiàn)是病人的行動(dòng)身體不穩(wěn)、肢體抖動(dòng)等運(yùn)動(dòng)性障礙現(xiàn)象[6]。病因目前還不十分清楚，主要病理變化是大腦黑質(zhì)部分多巴胺神經(jīng)元失常或細(xì)胞受損甚至死亡。6-羥基多巴胺作為一種神經(jīng)毒素，可以感染神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生變性，產(chǎn)生過氧化現(xiàn)象使神經(jīng)受損，多巴胺代謝物質(zhì)的增多現(xiàn)象與帕金森癥病理表現(xiàn)相似，因此被廣泛用于運(yùn)動(dòng)障礙模型的研究中。本文中以6-羥基多巴胺建立小鼠運(yùn)動(dòng)障礙模型，對小美牛肝菌的輔助治療效果進(jìn)行試驗(yàn)研究。

3.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

試驗(yàn)選用昆明SPF級(jí)小鼠50只，體重20 g～25 g，由蘇州愛爾麥特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(蘇） 2014-0007。對試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠10只，飼養(yǎng)溫度22℃～25℃，相對濕度50%～70%，自由進(jìn)食進(jìn)水，光照周期12 h/12 h。小鼠適用性喂養(yǎng)1周，在此期間每天對小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)輪適應(yīng)性訓(xùn)練，轉(zhuǎn)速設(shè)置為20 r·min-1～300 r·min-1，轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)間和間歇時(shí)間均為5 min，第1天訓(xùn)練5次，以后每天增加1次，期間觀察小鼠轉(zhuǎn)輪行為，剔除行為異常和不適應(yīng)訓(xùn)練的小鼠。

適用性喂養(yǎng)訓(xùn)練完成后，將合格小鼠隨機(jī)分5組，每組5只。運(yùn)動(dòng)障礙組：每日定時(shí)給小鼠腹腔注射6-羥基多巴胺（20 mg·kg-1）；高劑量組：每日1次定時(shí)經(jīng)口灌胃小鼠小美牛肝菌樣品溶液，劑量為60 mL；中劑量組：每日1次定時(shí)經(jīng)口灌胃小鼠小美牛肝菌樣品溶液和純凈水各30 mL；低劑量組：每日1次定時(shí)經(jīng)口灌胃小鼠小美牛肝菌樣品溶液10 mL和純凈水50 mL。對照組：每日1次定時(shí)經(jīng)口灌胃小鼠純凈水60 mL；以上各組均連續(xù)注射、灌胃1周。

3.2 轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)

每天灌胃1 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)，將轉(zhuǎn)輪式疲勞儀轉(zhuǎn)速設(shè)置為25 r·min-1，記錄每只小鼠掉下轉(zhuǎn)輪的時(shí)間，每只小鼠間歇時(shí)間為5 min，記錄3次，將3次時(shí)間累加記為小鼠的轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)時(shí)間。連續(xù)灌胃并記錄10 d，期間小鼠正常飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。

3.3 平衡木試驗(yàn)

自制長×寬為300 mm×15 mm的木棒，兩端架起，離地高度以小鼠身體不能接觸地面為準(zhǔn)。每天小鼠灌胃1 h后進(jìn)行平衡木試驗(yàn)，將小鼠放置于木棒中央，待小鼠抓固木棒后開始記時(shí)，小鼠墜落停止記時(shí)，測試3次，中間間歇5 min，取平均時(shí)間為測試時(shí)間。

3.4 曠場試驗(yàn)

曠場試驗(yàn)又稱開場試驗(yàn)，應(yīng)用開場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)的試驗(yàn)箱，每天小鼠灌胃1 h后，按分組將1組5只小鼠放入50 mm×500 mm的試驗(yàn)箱中，自由活動(dòng)，開場試驗(yàn)系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)記錄小鼠活動(dòng)軌跡和活動(dòng)距離，用于了解小鼠的活動(dòng)興奮度，研究小美牛肝菌樣品對小鼠自主活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的影響。

4 試驗(yàn)結(jié)果與分析

4.1 小美牛肝菌對小鼠轉(zhuǎn)輪時(shí)間的影響

轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 小美牛肝菌對運(yùn)動(dòng)障礙小鼠轉(zhuǎn)輪時(shí)間的影響Tab.1 Effect of Boletus speciosus on rotation time of dyskinesia mice

由表1可以看出，注射6-羥基多巴胺的運(yùn)動(dòng)障礙組與對照組（CK）相比，轉(zhuǎn)輪時(shí)間大幅縮短（P＜0.01），從實(shí)際觀察現(xiàn)象來看，部分障礙組小鼠很快就掉下轉(zhuǎn)輪；灌胃小美牛肝菌樣品溶液的3個(gè)組小鼠的轉(zhuǎn)輪時(shí)間均有增加（P＜0.05），增加樣品劑量可以延長轉(zhuǎn)輪時(shí)間，一定程度上改善了小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙，起到了延長小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間的作用。

4.2 小美牛肝菌對小鼠平衡時(shí)間的影響

平衡木試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 小美牛肝菌對運(yùn)動(dòng)障礙小鼠平衡時(shí)間的影響Tab.2 Effect of Boletus speciosus on balance time of dyskinesia mice

由表2可以看出，注射6-羥基多巴胺的運(yùn)動(dòng)障礙組與對照組（CK）相比，小鼠在平衡木上的時(shí)間大幅縮短（P＜0.01）；灌胃小美牛肝菌樣品溶液的3個(gè)組小鼠的停留時(shí)間均高于運(yùn)動(dòng)障礙組（P＜0.05），而且停留時(shí)間與樣品劑量成一定的正比關(guān)系。該試驗(yàn)結(jié)果說明小美牛肝菌能夠改善小鼠的前庭運(yùn)動(dòng)功能，對帕金森病引起的運(yùn)動(dòng)性障礙有一定的功效。

4.3 小美牛肝菌對小鼠曠場試驗(yàn)的影響

曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，對照組、運(yùn)動(dòng)障礙組與低劑量組、中劑量組、高劑量組的小鼠平均移動(dòng)速度分別為：（42.7±8.2） mm·s-1、（16.5±5.3） mm·s-1、（22.3±6.4） mm·s-1、（26.4±9.1） mm·s-1、（25.7±4.3）mm·s-1。注射6-羥基多巴胺后的小鼠與對照組（CK） 相比平均移動(dòng)速度明顯降低（P＜0.01）；而灌胃小美牛肝菌樣品溶液的3個(gè)組均比運(yùn)動(dòng)障礙組有所提高（P＜0.05）。但隨著灌胃劑量的加大速度增加不明顯。另外通過各組小鼠的自由活動(dòng)軌跡也可以看出，與對照組比較，運(yùn)動(dòng)障礙組的活動(dòng)軌跡明顯稀疏，而高、中、低3個(gè)劑量組的活動(dòng)軌跡與運(yùn)動(dòng)障礙組相比要稠密的多。曠場試驗(yàn)結(jié)果說明小美牛肝菌能夠改善小鼠的自主神經(jīng)興奮度，減輕運(yùn)動(dòng)障礙程度，縮短運(yùn)動(dòng)障礙癥狀的持續(xù)時(shí)間。

5 結(jié)論

小美牛肝菌內(nèi)含的氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)，改善了小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙癥狀，對帕金森病引起的運(yùn)動(dòng)性障礙有一定的功效。其作用機(jī)理可能是對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷的抑制，但小美牛肝菌也含有生物堿類毒物，對運(yùn)動(dòng)障礙的治療效果和副作用還有待臨床驗(yàn)證。