苯甲酸型芳香小分子的電噴霧多級質譜裂解規律

王天山，何春剛，文俏慧，劉沛銘，楊 媚

（海南師范大學 化學與化工學院，海南 海口 571158）

苯甲酸型芳香小分子廣泛存在于藥用植物與食用真菌中，是一類常見的天然物質，具有重要的生理作用和生物活性；是多種藥用植物的抗腫瘤活性部位的主要化學成分，也是多種中藥揮發油的主要化學成分[1-6]。其作為植物的次生代謝產物，普遍認為是經過苯丙氨酸途徑合成的，與木脂素類和黃酮類化合物是同根同源的[7]。到目前為止，尚未有文獻系統地報道這類芳香小分子的電噴霧多級質譜的裂解途徑及其規律。本研究所選擇的11種苯甲酸型芳香小分子化合物有羧酸，酯類和醛類，在苯環的間位和/或對位有1至3個羥基和/或甲氧基，是具有代表性的天然源的化合物。采用三重四級桿離子阱串聯質譜分析，通過解析碎片離子的結構及裂解順序，總結該類化合物的質譜裂解規律，可為該類化合物的結構分析和快速鑒定提供數據依據，也為研究其他同源的擁有相似結構單元的木脂素類和黃酮類化合物質譜裂解提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

實驗儀器：Esquire HCT 型電噴霧離子阱質譜儀（德國Bruker公司）；FA1604型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）。

沒食子酸三甲醚，自制；丁香酸，上海生工生物公司；香草酸、異香草酸、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、香草酸甲酯、異香蘭素、對羥基苯甲醛，上海阿拉丁公司；丁香醛，分離純化于藥用植物香花暗羅；香蘭素，自制；HPLC級甲醇，上海MACRON精細化工公司。

1.2 質譜條件

電噴霧電離離子源（ESI），采用ESI正離子和負離子掃描模式；掃描范圍為m/z 50～300；掃描方式：自動一級質譜全掃描，手動多級質譜提取離子掃描；毛細管電壓為104 Volt；掃描速度26000 m/z；樣品通過蠕動泵以4 μL/min的速率送入離子源；噴霧電壓3500 V；干燥氣N2溫度為300 ℃；流速8 L/min；霧化氣N2壓力為6.9×104Pa；引入少量氦氣（約5.0×105Pa）作為多級質譜的碰撞氣，同時可以提高離子的誘捕效率；多級質譜的碰撞能量為0.8 V。進樣方式為直接進樣；采用四舍五入法將離子的質荷比歸整。

2 結果與討論

2.1 羧酸類化合物的多級質譜裂解

選擇5種苯甲酸衍生物作為研究對象，分別是沒食子酸三甲醚（1）、丁香酸（2）、香草酸（3）、異香草酸（4）和對羥基苯甲酸（5）。在自然界中，苯甲酸的衍生物多被羥基及甲氧基取代，取代在苯甲酸的間位和對位，其中沒食子酸三甲醚和丁香酸是在苯甲酸的間位和對位有3個取代基，而香草酸、異香草酸和對羥基苯甲酸在間位和對位有兩個取代基。通過研究上述羧酸的多級質譜裂解碎片，闡述羧基及苯環上的取代基裂解的順序及中性小分子或自由基的形式（表1）。

表1 羧酸類化合物1～5多級質譜裂解碎片Table 1 MSn fragment ions of acids 1～5

2.1.1 正離子[M+H]+模式羧酸的裂解途徑

由質譜數據分析發現，沒食子酸三甲醚和丁香酸這兩種化合物總體存在兩條裂解途徑。第一條途徑是先在-COOH上脫去CO2得到三取代苯與H+加合正離子，接下來是斷裂取代基，在取代基中較優先斷裂的是從甲氧基丟失甲基自由基。第二條途徑是羧基與加合H+離子脫水生成酰基正離子或者直接脫羥基生成羧酸正離子。

沒食子酸三甲醚的苯環上的間位和對位取代基均為甲氧基，其經過脫CO2和依次丟失三個甲基自由基（m/z 169，154和139）后，由酚式結構經烯醇式-酮式互變異構形成鄰苯二醌的結構（m/z 124）。丁香酸的結構與沒食子酸三甲醚相似，分析其二級碎片離子發現有[M+H-17]+（m/z 182）的二級碎片離子，對應的是丟失對位羥基自由基，然后加合離子H+遷移至對位形成間位二甲氧基苯甲酸正離子；另外一種方式是按照途徑一得到的鄰二酚離子m/z140再脫OH自由基（m/z 123）后苯環縮環裂解（m/z 95）（圖1）。

圖1 化合物1和2在[M+H]+模式下的多級質譜裂解Figure 1 Fragmentation pathway of 1 and 2 in[M+H]+mode

在化合物3～5中也存在與化合物1和2相似的裂解規律，即優先脫羧，脫水和脫羥基等中性小分子和自由基（圖2）。采用多級碰撞誘導解離（CID）技術掃描香草酸和異香草酸的二級離子[M+H-CO2]+（m/z 125），發現有[M+H-CO2-14]+的三級子離子生成，對應于裂解掉一個CH2碎片；其可能的裂解方式是當甲氧基的鄰位未被取代時，甲氧基上的氫經五中心過渡態遷移至鄰位，斷掉亞甲基的同時生成酮式結構；由于該酮式結構不穩定，隨即發生酮式-烯醇互變異構恢復芳香體系生成酚式結構（m/z 111）。

2.1.2 負離子[M-H]-模式羧酸的裂解途徑

圖2 化合物3-5在[M+H]+模式下的多級質譜裂解Figure 2 Fragmentation pathway of 3-5 in[M+H]+mode

在負離子[M-H]-模式下，發現這5種苯甲酸類化合物有一種相同的裂解方式，先是脫CO2再斷掉苯環上的甲基，另外也出現先斷苯環上的甲基再脫CO2的過程，這兩種過程都生成多取代苯酚負離子[M-H-59]-（圖3、圖4）。還發現化合物1有一個碎片離子比母離子m/z 196少了57 Da（[M-H-CH3-57]-），這可能是經過斷掉甲基后發生縮環反應丟失C2O2H單元，生成二取代環戊二烯酮負離子m/z 139。化合物1經脫羧后，接下來再失去苯環上的甲基或者亞甲基，生成醌式（m/z 137）或者酚式負離子（m/z 153和123）。

圖3 化合物1和2在[M-H]-模式下的多級質譜裂解Figure 3 Fragmentation pathway of 1 and 2 in[M-H]-mode

圖4 化合物3-5在[M-H]-模式下的多級質譜裂解Figure 4 Fragmentation pathway of 3-5 in[M-H]-mode

2.2 酯類化合物的多級質譜裂解

香草酸甲酯（6）和對羥基苯甲酸甲酯（7）同是苯甲酸甲酯的衍生物，在間位和對位均有供電子基羥基和甲氧基。研究這兩種化合物的多級質譜，以便獲得酯基的開裂方式和苯環上的羥基和甲氧基裂解的順序（表2）。

2.2.1 正離子[M+H]+模式酯的裂解途徑

在[M+H]+模式下，芳香酯類化合物首先在酯基上發生裂解，斷掉CH3OH和CO2的中性小分子，或者斷掉CO2CH3自由基。該酯類化合物的酯基是經過三中心骨架重排使甲基遷移至苯環上的同時脫掉CO2分子，生成[M+H-CO2]+的甲苯型碎片離子，接下來斷掉該甲基生成酚正離子，其結果與直接斷掉CO2CH3自由基生成[M+H-59]+的碎片離子一樣。另外，化合物6和7還存在[M+H-32]+的碎片離子，提示斷掉1分子CH3OH生成苯甲酰基正離子；其中7 的苯環上沒有OCH3，說明丟失的CH3OH 碎片來自酯基中的-OCH3和加合H+離子。該[M+H-32]+苯甲酰基正離子再依次從苯環上斷掉甲基和羥基自由基。化合物6的m/z 136離子生成m/z 124的碎片離子是經過苯環縮環丟失一個CHO自由基，化合物7的酰基正離子m/z 121在苯環上脫水生成苯炔類正離子m/z 103（圖5）。

表2 酯類化合物6和7的多級質譜裂解碎片Table 2 MSn fragment ions of esters 6 and 7

圖5 酯類化合物在[M+H]+模式下的多級質譜裂解Figure 5 Fragmentation pathway of esters in[M+H]+mode

2.2.2 負離子[M-H]-模式酯的裂解途徑

在負離子[M-H]-模式，酯類化合物在間位和對位存在羥基和甲氧基時，優先斷裂的是酯基。酯類化合物常見的是先脫甲基自由基再脫羧。脫羧有兩種形式，即脫-CO2H自由基和脫CO2分子。化合物6在MS2-3中分別觀察到2個子離子依次減少15Da的離子為m/z 166和151，提示依次失去分子中的兩個-CH3。化合物7 的酯基還出現了先經過三中心甲氧基重排脫去CO，生成比準分子離子m/z 151 少28Da 的碎片負離子m/z 123，該負離子再丟失1個甲基自由基生成對苯二醌負離子m/z 108。此外，還發現化合物7在酯基上脫CH2得到m/z 137，可能是按照五元環重排使甲基上的1個H遷移到CO的氧原子上而使CH2自由基斷裂（圖6）。

2.3 醛類化合物的多級質譜裂解

醛類化合物的結構與羧酸類和酯類化合物的結構相似，天然源的苯甲醛類衍生物的取代基集中在間位和對位，也是以羥基和甲氧基為主。以丁香醛（8）、香蘭素（9）、異香蘭素（10）和對羥基苯甲醛（11）為例，采用CID技術分別掃描準分子離子峰（[M+H]+和[M-H]-）和一些重要的碎片離子，得到的主要多級質譜裂解碎片列于表3。

圖6 酯類化合物在[M-H]-模式下的多級質譜裂解Figure 6 Fragmentation pathway of esters in[M-H]-mode

表3 醛類化合物8～11的多級質譜裂解碎片Table 3 MSn fragment ions of aldehydes 8～11

2.3.1 正離子[M+H]+模式醛的裂解途徑

在正離子[M+H]+模式，醛類化合物都一致優先從醛基上脫去1分子CO，得到比準分子離子少28Da的對應的酚醚類加合離子。接下來是斷裂苯環上的甲氧基和羥基，并且甲氧基優先于羥基斷裂；甲氧基可以斷掉甲基自由基-CH3（8）和亞甲基-CH2-（9和10），也可以斷掉甲氧基和甲醇分子的（8）。如果苯環上只有羥基的，就直接把羥基質子化而脫掉一個水分子（10和11）。最后是苯環的裂解，常見的也是脫去中性分子CO和自由基CHO（8和10）（圖7）。

2.3.2 負離子[M-H]-模式醛的裂解途徑

醛類化合物在負離子[M-H]-模式下的裂解方式較為多樣化。其基本裂解規律是從醛基上脫CO 或者CHO自由基，比如化合物11在二級譜中由準分子離子m/z 121分別生成m/z 92和m/z 93的子離子；當苯環上有甲氧基時，則優先斷裂掉甲基自由基生成醌負離子（化合物8依次斷掉2個甲基分別生成m/z 166和151的醌負離子），或者斷裂掉亞甲基自由基生成酚負離子（化合物10斷掉亞甲生成m/z 137的酚負離子）；接下來醌負離子和酚負離子再從醛基上脫CO（圖8）。

圖7 醛類化合物在[M+H]+模式下的多級質譜裂解Figure 7 Fragmentation pathway of aldehydes in[M+H]+mode

圖8 醛類化合物在[M-H]-模式下的多級質譜裂解Figure 8 Fragmentation pathway of aldehydes in[M-H]-mode

3 結論

選擇研究了11種苯甲酸型芳香小分子的電噴霧多級質譜數據，通過分析碎片離子裂解的先后順序，總結出該類型化合物的質譜裂解規律。研究結果發現，化合物在電噴霧質譜中裂解優先發生在主要的官能團，即羧基，酯基和醛基。第二階段是脫去苯環上的取代基，主要是甲氧基和羥基，由于氧與苯環的p-π共軛效應使得C-O比較牢固，因此取代基的斷裂優先從甲氧基上脫去甲基；當甲氧基的鄰位未被取代時，常觀察到從甲氧基經重排反應后丟失亞甲基，這一過程可能是經過五元環氫遷移到鄰位得到酮式結構，該酮式結構再恢復芳香體系得到酚式結構。最后是苯環的裂解，常見的是發生縮環反應脫去CO或者CHO自由基。