厄貝沙坦減輕糖尿病腎病大鼠腎損傷

張 婭，黃文輝*，侯智敏，劉菊香，劉 靜

(1.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系，甘肅 蘭州 730000)

根據(jù)最新出版的國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation，IDF)地圖集估算的數(shù)據(jù)提示，全球共有4.25億糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者，預(yù)計到2040年將會突破6.42億[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是終末期腎臟疾病(end-stage renal disease, ESRD)和糖尿病患者導(dǎo)致殘疾以及高病死率的一個重要原因。早發(fā)現(xiàn)、早期防治DN對于減少并發(fā)癥、發(fā)病率和病死率以及減輕DN負(fù)擔(dān)對于社會和經(jīng)濟(jì)影響至關(guān)重要。

目前關(guān)于DN的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)中主要還是針對腎臟血流動力學(xué)異常活躍的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)[2]。血管緊張素II受體拮抗劑(angiotensin Ⅱ receptor antagonist，ARB)的腎保護(hù)作用不僅表現(xiàn)在對血流動力學(xué)的影響上，而且表現(xiàn)在對非血流動力學(xué)因素的阻斷上。ARB阻斷RAS抑制腎組織TGF-β1，這是ARB治療DN的重要機(jī)制。已有研究證實，厄貝沙坦(Irbesartan)對健康人血漿miRNA譜的表達(dá)具有調(diào)控作用[3]，且厄貝沙坦在臨床應(yīng)用廣泛，因此選擇厄貝沙坦，探討其在DN中對miRNA譜表達(dá)的調(diào)控，分析其中可能起作用的miRNAs及其作用靶基因，進(jìn)一步探討厄貝沙坦改善腎臟功能的相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性10周齡Wistar大鼠共30只，體質(zhì)量200～230 g[甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，合格證號：SCXK(甘)2017-0004]。

1.1.2 主要試劑：厄貝沙坦[賽諾菲(北京)制藥有限公司]；鏈脲佐菌素STZ、Trizol試劑、氯仿、無水乙醇、異丙醇、DEPC水，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒及引物、蛋白提取試劑 RIPA、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白酶抑制劑 cocktail、Western blot常用試劑、免疫組化常用試劑、PBS、ECL 超敏發(fā)光液、HE、Masson染色常用試劑(廣東銳博生物科技有限公司)；TGF-β1、ZEB 1和Col 1兔抗大鼠多克隆抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為對照組和DN組(高脂飼料喂養(yǎng)：基礎(chǔ)飼料73.6%，豬油15%，膽固醇1.2%，膽酸鈉0.2%，蛋黃粉10%，經(jīng)機(jī)器生產(chǎn)壓制成條狀，喂養(yǎng)結(jié)合腹腔注射小劑量STZ，n=20只)，第6周末大鼠隔夜空腹腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素STZ(28 mg/kg)，繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)。對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。注射STZ間隔72 h后，以兩次隨機(jī)血糖等于或大于16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型制作成功。第14周末，將隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，ACR≥300 μg/mg時認(rèn)為糖尿病腎病造模成功。將DN大鼠隨機(jī)分為：DN 模型組(0.9%氯化鈉溶液灌胃，n=10)、厄貝沙坦組[50 mg/(kg·d),n=10]，連續(xù)飼養(yǎng)至22 周齡。

1.2.2 常規(guī)實驗室檢查：于22周測體質(zhì)量、隨機(jī)血糖、24 h尿微量白蛋白、血肌酐和尿素氮。

1.2.3 腎組織病理學(xué)的觀察：常規(guī)石蠟包埋切片行HE、Masson染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理變化。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測miR-192 mRNA：腎臟組織研磨后裂解組織，按照Trizol試劑的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟抽提總RNA，并用分光光度計測定其濃度，檢測A260 nm/280 nm比值，判斷RNA的純度。應(yīng)用Bulge-LoopTMmiRNA RTPrimer將 miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，應(yīng)用SYBR Green Mix進(jìn)行實時PCR分析。實時PCR條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 10 s，循環(huán)40次。隨后在70 ℃～95 ℃的區(qū)間內(nèi)進(jìn)行融解實驗。以U6RNA作為內(nèi)參照，循環(huán)閾值(Ct)比較法進(jìn)行目的基因表達(dá)的相對定量分析。目的基因相對表達(dá)量=2-ΔΔCt，2-ΔΔCt表示的是糖尿病腎病組和厄貝沙坦治療組目的基因表達(dá)相對于正常對照組的變化倍數(shù)。ΔΔCT=(Ct目的-Ct內(nèi)參)實驗-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對照。

1.2.5 Western blot檢測靶蛋白：提取蛋白用BCA 法測蛋白濃度后100 ℃水浴變性5 min。上樣，8%～10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，依次加一抗、二抗，ECL顯色試劑，X線片曝光、顯影。

1.2.6 免疫組織化學(xué)法檢測靶蛋白：組織固定、脫水、浸蠟、切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水洗，抗原修復(fù)，封閉，與一抗結(jié)合，與二抗結(jié)合，DAB顯色，脫水，透明，封片，光鏡觀察及照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 厄貝沙坦對糖尿病腎病大鼠一般指標(biāo)的影響

與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量、隨機(jī)血糖、血肌酐、尿素氮和24 h尿微量白蛋白顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，厄貝沙坦治療組大鼠體質(zhì)量、隨機(jī)血糖、血肌酐、尿素氮和24 h尿微量白蛋白顯著降低(P<0.05)，厄貝沙坦治療可以改善DN大鼠的一般情況(表1)。

2.2 腎臟病理HE、Masson染色結(jié)果

DN組大鼠腎小球分葉狀，系膜區(qū)增寬，系膜基質(zhì)增加，小管上皮細(xì)胞可見顆粒和空泡樣變性；Masson結(jié)果可見DN組大鼠腎小球及腎間質(zhì)區(qū)染色陽性物質(zhì)，提示纖維化病變；與DN組相比，厄貝沙坦組大鼠腎組織病理改變有所改善(圖1)。

2.3 Real-time PCR檢測的結(jié)果

與對照組相比，模型組miR-192 在DN大鼠腎臟的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與模型組相比，厄貝沙坦組miR-192的表達(dá)上調(diào)(P<0.05)(圖2)。

2.4 大鼠腎組織TGF-β1、ZEB1蛋白表達(dá)

與對照組大鼠相比，DN模型組腎組織的TGF-β1、ZEB1蛋白表達(dá)量明顯增加；與模型組相比較，厄貝沙坦治療可以減少TGF-β1、ZEB1蛋白的表達(dá)(P<0.05)(圖3，表2)。

表1 各組大鼠的一般指標(biāo)結(jié)果比較Table 1 Comparison of general index results of rats in each

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DN group.

圖1 3組大鼠腎臟組織 HE、Masson 染色Fig 1 HE and Masson staining of kidney tissues of rats in three groups(×400)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 com?pared with DN group圖2 PCR檢測各組大鼠腎組織 miR-192 的表達(dá)水平Fig 2 Quantitative RT-PCR to detect the expression of miR-192 in kidney tissues of rats in each

2.5 大鼠腎組織TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白表達(dá)

TGF-β1 主要沉積于腎小管上皮細(xì)胞；ZEB1和collagen Ⅰ主要沉積于近端小管和遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞。與對照組大鼠相比，DN組腎組織TGF-β1、 ZEB1、collagen Ⅰ蛋白表達(dá)增強(qiáng)；與DN組相比較，厄貝沙坦治療組TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白表達(dá)減弱(P<0.05)(圖4，表3)。

圖3 3組大鼠腎臟組織 TGF-β1、ZEB1蛋白表達(dá)水平Fig 3 Expression levels of TGF-β1 and ZEB1 in kidney tissue of rats in three groups

表2 各組大鼠腎臟TGF-β1、ZEB1的蛋白比較

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DN group.

圖4 3組大鼠腎臟組織 TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白免疫組化結(jié)果

表3 各組大鼠腎臟TGF-β1、ZEB1、collagen Ⅰ蛋白免疫組化吸光度值比較

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with DN group.

3 討論

DN發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，TGF-β1是一種調(diào)節(jié)腎臟纖維化和炎性反應(yīng)的重要細(xì)胞因子。TGF-β1通過促進(jìn)細(xì)胞和基質(zhì)之間的黏附來進(jìn)行ECM的積累。miR-192在腎臟中特別是在腎皮質(zhì)中高度表達(dá)，許多研究證實了miR-192在腎臟纖維化中起著重要作用，但對于miR-192在DN中的作用目前仍存在爭議。

為進(jìn)一步研究 miR-192 在DN發(fā)病機(jī)制中的作用，以及厄貝沙坦對DN大鼠miR-192表達(dá)的影響，選擇DN Wistar大鼠作為研究模型，本研究發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦對于大鼠腎組織miR-192的表達(dá)具有一定的影響。TGF-β1可以通過上調(diào)或下調(diào)包括miR-192在內(nèi)的幾個小RNA來控制腎纖維化的進(jìn)程[4-9]。miR-192在腎組織中高度富集，TGF-β1抑制了人近端小管細(xì)胞(proximal tubular cell，PTC)中miR-192的表達(dá)，而miR-192的缺乏與DN中的腎纖維化加速和GFR減少有關(guān)[10]。糖尿病患者的活檢顯示miR-192水平較低，而且隨著病程的發(fā)展,miR-192在腎組織的表達(dá)越低,其下調(diào)促進(jìn)了人類DN中的纖維化進(jìn)程[11]。然而，有幾項研究得出了相反的結(jié)論[12-14]。這些研究發(fā)現(xiàn)，腎臟的miR-192在db/db小鼠和T2DM患者的MCs和TECs中過度表達(dá)，而miR-192的增加與TGF-β1的增加平行。因此，本研究結(jié)果提示 miR-192 可能參與了 DN 的發(fā)病機(jī)制，厄貝沙坦對DN的保護(hù)作用可能是通過調(diào)控miR-192的表達(dá)水平實現(xiàn)的。

通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，TGF-β1、ZEB1是與 DN 相關(guān)的 miR-192靶基因。糖尿病患者腎活檢顯示TGF-β1的表達(dá)顯著增加。鋅指E盒結(jié)合同源盒1(ZEB1)和ZEB2是位于TGF-β1信號通路下游的兩個轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制E-鈣黏蛋白并調(diào)節(jié)腎纖維化。miR-192的過度表達(dá)可通過抑制ZEB1和ZEB2的表達(dá)來抑制TGF-β1介導(dǎo)的E-鈣黏蛋白下調(diào)，進(jìn)而阻止腎臟纖維化。因此，TGF-β1抑制了miR-192的表達(dá)，而miR-192靶向ZEB1/2激活了TGF-β1信號通路，加重了DN的腎纖維化[10]。Collagen Ⅰ是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，Collagen Ⅰ的合成能力和Collagen Ⅰ結(jié)合GBM的結(jié)合能力均導(dǎo)致糖尿病和糖尿病腎病患者循環(huán)纖維連接蛋白升高[15]。研究發(fā)現(xiàn)，高葡萄糖濃度可刺激腎小球系膜細(xì)胞中Collagen Ⅰ的合成，這種作用由TGF-β1介導(dǎo)。

因此，通過本研究，推測厄貝沙坦可能通過阻止大鼠腎組織miR-192表達(dá)的減少，進(jìn)而下調(diào)靶基因TGF-β1、ZEB1的表達(dá)來阻止 ECM 沉積，延緩 DN 腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的發(fā)生。該機(jī)制研究有待于更進(jìn)一步的探討和驗證。