淺談貝類毒素及其常用檢測技術

馮春艷，梁瓊，趙曉野，王儒，王婷

海南省食品藥品檢驗所海口分所（海口 570311）

貝類在生長過程中，位置相對固定，因其具有非選擇性濾食習慣[2]，容易受到海洋環境中農獸藥殘留、重金屬、生物毒素的污染。胡蓉等[1]在海南島近岸海域貝類中的腹瀉性貝類毒素的研究中發現海南島海域貝類毒素的腹瀉性毒素超標率高達33.68%，而廣東省也曾發生過因使用有毒貝類引起消費者中毒和死亡的事件[3]。海南是沿海省份，貝類產品的人均食用量大，發生食用貝類產品中毒的概率大大增加，近年來海南貝類養殖規模不斷擴大，關于海南島海域赤潮的報告也不斷增加[4]，這說明海南貝類養殖的食用安全存在較大風險。因此，人們對貝類食用安全性的關注度日益升高。主要對貝類毒素研究過程中毒素的分類、貝類毒素作用機理及中毒表現、貝類毒素的高發季節、貝類毒素常用檢測方法等方面進行闡述。

1 貝類毒素的分類

貝類毒素具有突發性和廣泛性，是危害較大的海洋毒素之一。根據其毒性作用機制可分為麻痹性貝類毒素（PSP）、腹瀉性貝類毒素（DSP）、神經性貝類毒素（NSP）和健忘性貝類毒素（ASP）四大類。由于其毒性大、反應快、無適宜解毒劑，四類毒素均無特效治療藥。

2 貝類毒素作用機理及中毒表現

麻痹性貝類毒素（PSP）是一類劇毒的含氯雜環有機化合物，毒性與河豚毒素相當，一些赤潮生物種，如甲藻類中的亞歷山大藻、膝溝藻屬、原甲藻屬等是PSP的直接生產者。根據基團的相似性，可分為氨甲酰基類毒素（Carbamoyl toxin）、氨甲酰基-N-磺基類毒素（N-Sulfo carbamoyl toxin）、去氨甲酰基類毒素（Decarbamoyl toxin）三大類。其主要是通過對細胞鈉通道的阻斷，造成神經系統傳輸障礙而產生麻痹作用。中毒的主要癥狀為口唇刺痛和麻痹，并擴散至面部、脖子、肢端，伴有頭痛、暈眩、嘔吐、腹痛、腹瀉等，嚴重者會停止呼吸、窒息死亡。

腹瀉性貝類毒素（DSP）是聚醚或大環內酯化合物，具有脂溶性，主要來自于自于鰭藻屬（Dinophysis）、原甲藻屬（Prorocentrum）等藻類。DSP由軟海綿酸及衍生物鰭藻毒素-1與鰭藻毒素-3、扇貝毒素（大環內酯化合物櫛膜毒素）、硫化物毒素三種不同的聚醚化合物組成。其主要作用機制是通過激活腸道細胞內環磷酸腺苷（cAMP）介質系統而引起水瀉[5]。中毒的主要癥狀是惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等，中毒癥狀可能會持續3 d，不會留下后遺癥，更不會致命。

神經性貝類毒素（NSP）為多環聚醚化合物，高脂溶性，主要來自于短裸甲藻。其主要作用機制與麻痹性毒素相似，作用于鈉通道，但其作用位點與石房蛤毒素不同，引起鈉通道維持開放狀態，從而引起鈉離子內流，造成神經細胞膜去極化。中毒的主要癥狀為肌關節無力、冷熱感覺顛倒、說話吞吐困難等。

健忘性貝類毒素（ASP）主要來自于軟骨藻酸。其作用機制是作用于中樞神經系統紅藻酸受體，導致去極化、鈣的內流以及細胞的死亡。中毒的主要癥狀是頭暈、眼花、短期記憶功能喪失。

3 貝類毒素的高發季節

季節的不同，海水水體溫度、光照條件、pH、海水鹽度等環境因素變化，進而影響藻類種群、數量和貝類的生理狀態。PSP與DSP的高發季節為秋末和冬季[6]。據文獻表明，南海中部浮游甲藻密集且主要存在海南島東南部[7]，產PSP的亞歷山大藻在15～20 ℃的低溫下生長較好，且細胞毒力較強[8-9]，因此甲藻在冬季數量激增，為貝類提供了豐富的食物資源，這可能是秋冬季海南島近岸貝類體內PSP含量增多的主要原因之一，這與李政菊等[6]關于海南島近岸海域貝類中的麻痹性貝類毒素的研究顯示的海南島近岸海域養殖的主要貝類體重PSPDE檢出率為62.5%結論一致。還有研究表明，海南島近岸DSP陽性檢出率和超標率的最低值均出現在夏季，最高值均出現于冬季[1]。有利瑪原甲藻和D. caudata等是目前已被確定產生DSP的毒藻，海南島海域大量存在有利瑪原甲藻和D.caudata，且浮游植物細胞密度呈在冬季初期最高，秋季次之，夏季最低的趨勢[10]，這與胡蓉等[1]的研究DSP檢出率達46.32%，超標率達33.68%，且呈冬季最高，夏季最低的結論相一致。由于秋末冬初海水溫度、pH、海水鹽度等條件適宜，為有毒藻類的繁殖提供有利的條件，因此夏末至冬季這一時間段為研究海南島近岸貝類PSP和DSP的重點監測期。

4 貝類毒素常用檢測方法

4.1 小鼠生物測定法

小鼠生物測定法是將貝類樣品的酸性提取液注射到體質量約為20 g的小鼠腹腔中，在24～48 h內觀察小鼠的病理效應。該方法均可用于ASP、DSP、NSP、ASP的檢測，使用“鼠單位”（Mu）表達，一個鼠單位（Mu）指一只20 g體質量的小鼠在腹腔注射后15 min內死亡的毒素最小劑量，PSP的檢出限為4 Mu/g，DSP的檢出限為0.05 Mu/g[11]

該方法檢驗技術容易掌握，不需要大型精密的儀器和專門的操作人員，被美國分析化學家協會（AOAC）確定為檢測PSP的標準方法[11]，但該方法只能確定毒素的有無和大小，不能確定樣品中毒素的成分和結構并準確定量；且小鼠的死亡時間受小鼠的個性特征、實驗室的飼養條件、實驗人員操作技術、樣品基質如游離脂肪酸等內源性化合物的影響，導致該方法特異性不高，易出現假陽性結果；此外，小鼠活體實驗在道德倫理上受到動物保護主義者的反對，目前很多國家已逐步禁止使用該方法。

4.2 酶聯免疫分析法

酶聯免疫分析法以抗原抗體特異性反應為基礎，將毒素與酶連接，酶與底物發生顯色反應，通過分析特定波長的吸收強度對毒素進行定性定量分析。主要包括放射免疫分析（EIA）法、酶聯免疫吸附（ELISA）法和競爭性酶免疫分析（EIA）法三種。目前很多公司已經研制出酶聯免疫吸附檢測試劑盒并被廣泛應用，其檢測貝類毒素的檢出限甚至低至ng/g級，如DSP檢測限為0.1 ng/g、PSP檢測限為0.02 ng/g、NSP檢測限為0.01 ng/g、ASP檢測限為0.5 ng/g[11]。

酶聯免疫法具有靈敏度強、特異性高、檢測用樣少、操作簡單等特點，不需要大型儀器設備和專門操作人員，適用于大批量樣本的分析，近年來在海洋生物毒素的快速檢驗中得到廣泛應用。但酶聯免疫法也有一定的缺陷，例如貝類毒素種類繁多，而目前用于檢測貝類毒素的商品化檢測試劑盒種類不全，且免疫反應不是針對毒素結構，而是根據毒素結構的表位進行定性定量，因此對于生物基質復雜的毒素，有存在交叉反應、試驗結果重現性差的風險。此外，由于商品化試劑盒價格較昂貴，在一定程度上也限制其推廣使用。

4.3 高效液相色譜-熒光檢測法

高效液相色譜-熒光檢測法包括柱前衍生反應法和柱后衍生反應法，其原理是利用合適的溶劑提取出樣品中的待測物質，加入衍生化試劑使待測物發生衍生化作用并在一定波長激發光的照射下產生熒光，通過分析熒光的吸收強度對待測物質進行定性定量。該方法可用于幾乎所有貝類毒素的檢測，是目前國內外檢測PSP和DSP常用的方法之一[12]，PSP的檢測低限甚至達到了6.5～129 μg/kg[11]。

該方法檢測時間較小鼠生物測定法短，具有靈敏度高、檢測范圍廣，能夠完成大批量的檢測任務等優點，但由于同系貝類毒素結構相似、保留時間基本相同的特點，高效液相色譜-熒光檢測法對同系毒素的定性能力較差。另外，由于在檢測過程中用到的衍生化試劑也比較昂貴，部分熒光試劑不穩定，需要現用現配等原因，使該方法的使用也受到一定的限制。

4.4 液相色譜-質譜聯用法

液相色譜-質譜聯用法是目前貝類毒素檢測中最有優勢的一種分析方法，將液相色譜的分離技術與質譜的分析技術有效結合起來對毒素的化學成分和結構進行分析。GB 5009.213—2016第四法液相色譜-質譜聯用法中PSP的檢出限為25.0～50.0 μg/kg[13]；GB 5009.212—2016第三法液相色譜-質譜聯用法中DSP檢出限為10.0 μg/kg[14]；GB 5009.198—2016第三法液相色譜-質譜聯用法中ASP檢出限為0.005 μg/kg[15]。

液相色譜-質譜聯用法不需要實現待測物質與干擾組分的完全色譜分離，即可提供待測物質的結構信息。其具有分析速度快、檢出限低、選擇性好、穩定性好、抗干擾能力強、定性定量結果準確等優點，使得該方法在貝類毒素檢測中發展迅速。目前，該方法已收錄至國內的國家標準方法中[13-15]，該方法具有定性和篩查未知物的能力，對新型毒素的發現和驗證有廣闊的發展前景。缺點是液相色譜-質譜聯用儀價格昂貴且需要專業的技術人員，檢測成本高。

5 結語

我國是貝類養殖大國，近年來由于赤潮出現頻繁，貝類毒素嚴重影響著貝類的食用安全和商品出口。目前針對貝類毒素的研究已經引起人們的廣泛關注。建議加強對有毒藻類的類型、貝類養殖水域的質量狀況、貝類毒素高發季節的影響因素和貝類毒素的檢測方法進行綜合性的研究，以確保貝類產業的健康發展。

海南島是我國的第二大島，僅次于臺灣。豐富的海洋資源和得天獨厚的生態環境為熱帶貝類養殖提供了有利條件。貝類養殖作為海南海產養殖的重要產業，其產業的健康發展關系著海南島藍色經濟帶的建設。隨著近年來該海域有毒赤潮的不斷發生，該海域養殖貝類的食用安全存在較大風險，但關于海洋毒素在海南島貝類中染毒狀況的研究卻非常少見[5]。這樣不利于海南省日常監測工作的展開和貝類養殖業的可持續發展，為了保證水產品的食用安全性，減少食源性中毒的公共衛生突發事件，提高消費者的意識，急需了解貝類生物毒素污染狀況，不同產地、不同季節、不同貝類品種間貝類生物毒素分布規律，進而為提高和改善水產品的質量及安全性提供參考依據。