丹參酮合成相關(guān)的SmCYP81C16基因克隆和功能研究

張建紅 王喆 陳泓宇 嚴(yán)黎 呂海舟 劉琬菁 徐志超 羅紅梅

摘要?目的：丹參（Salvia miltiorrhiza）根中所含的丹參酮為二萜醌類化合物，而鑒定參與丹參酮合成的CYP450基因成為解析丹參酮生物合成途徑分子機(jī)制的關(guān)鍵步驟。方法：本實(shí)驗(yàn)從丹參基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到SmCYP81C16基因，采用RT-PCR方法克隆獲得基因cDNA全長(zhǎng)序列，利用生物信息學(xué)分析方法分析其所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域等，建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了該基因的組織/器官表達(dá)特異性;通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了該基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，通過(guò)化學(xué)檢測(cè)及代謝組學(xué)分析丹參酮類化合物在對(duì)照株系和過(guò)表達(dá)株系中的含量變化。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了毛狀根中丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果：SmCYP81C16基因全長(zhǎng)1 497 bp，編碼498個(gè)氨基酸殘基，該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為55.8 kDa;SmCYP81C16在丹參莖和根的周皮部高表達(dá);通過(guò)化學(xué)檢測(cè)及代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照株系比較，在SmCYP81C16過(guò)表達(dá)陽(yáng)性株系中，丹參酮類化合物的含量升高;過(guò)表達(dá)毛狀根中丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量顯著上升。結(jié)論：本研究結(jié)果表明SmCYP81C16具有正向調(diào)控丹參酮生物合成的功能。本研究為利用生物技術(shù)方法提高丹參酮類化合物含量奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?丹參;細(xì)胞色素P450;丹參酮;生物合成;基因克隆;生物信息學(xué)分析;基因過(guò)表達(dá);轉(zhuǎn)基因毛狀根

Cloning and Functional Research of SmCYP81C16 Related to Tanshinone Biosynthesis

ZHANG Jianhong1， WANG Zhe2， CHEN Hongyu1， YAN Li1， LYU Haizhou1， LIU Wanjing1， XU Zhichao1， LUO Hongmei1

（1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine， Ministry of Education， Key Lab of Chinese Medicine Resources Conservation， National Administration of Traditional Chinese Medicine of the People′s Republic of China， China Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College， Beijing 100193， China; 2 State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines， Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences &Peking Union Medical College， Beijing 100050， China）

Abstract?Objective：Tanshinone in Salvia miltiorrhiza root is a diterpene quinone compound.Identification of the CYP450 gene involved in tanshinone synthesis has become a key step in analyzing the molecular mechanism of tanshinone biosynthesis pathway.Methods：SmCYP81C16 was screened from the genome and transcriptome data of S.miltiorrhiza and the full-length cDNA sequence was obtained and cloned by RT-PCR method.Bioinformatics analysis was used to analyze the characteristics of physicochemical properties of the coded protein， to predict the secondary structure， conserved domains， etc.of the protein， to establish phylogenetic tree; real-time quantitative PCR method was used to detect the relative expression specificity of this gene in the tissues/organs of S.miltiorrhiza.The overexpressing transgenic hairy root was obtained by genetic transformation， and the content of tanshinones was analyzed by chemical detection and metabolomics.Real-time quantitative PCR method was used to detect the comparative expression levels of key enzymes in tanshinone biosynthetic pathway in hairy roots.Results：The full-length of SmCYP81C16 was 1 497 bp， encoding 498 amino acid residues.The relative molecular weight of this protein was 55.8 kDa.SmCYP81C16 was highly expressed in the stem and the periderm of S.miltiorrhiza.Through chemical detection and metabolomics analysis， it was found that compared with the control strain， in SmCYP81C16 overexpressing strains， the content of tanshinone compounds increased; the expression level of key enzyme genes of tanshinone synthesis pathway in overexpressing hairy roots increased significantly.Conclusion：SmCYP81C16 has the function of positively regulating tanshinone biosynthesis.This study lays a foundation for improving tanshinone biosynthesis content by using biotechnology.

Keywords?Salvia miltiorrhiza; Cytochrome P450; Tanshinones; Biosynthesis; Gene clone; Bioinformatics analysis; Gene overexpression; Transgenic hairy roots

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.009

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬多年生直立草本植物，根和根莖入藥，是一種傳統(tǒng)的具有重要藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥用植物[1]。丹參中的丹參酮類化合物在心腦血管疾病治療方面效果顯著[2]，以丹參為君藥的“復(fù)方丹參滴丸”順利完成美國(guó)食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）III期臨床實(shí)驗(yàn)，有望成為首例獲得美國(guó)FDA認(rèn)證的復(fù)方中藥。此外，有研究表明，丹參酮I具有顯著的抗癌活性[3]，丹參酮II A在抗菌抗炎[4-5]、抗腫瘤[6-7]方面也具有一定療效。

丹參酮為脂溶性二萜類化合物[8]，包括丹參酮I（Tanshinone I）、丹參酮IIA（Tanshinone IIA）、隱丹參酮（Cryptotanshinone）、二氫丹參酮I（Dihydrotanshinone I）等十余種化合物。丹參酮類化合物通過(guò)定位在植物細(xì)胞質(zhì)中的甲戊二羥酸途徑（Mevalonate Pathway，MVA）和定位在質(zhì)體中的2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑（2-methyl-D-erythritol 4-phosphate Pathway，MEP）合成丹參酮前體物質(zhì)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl Diphosphate，GGPP）。GGPP經(jīng)二萜合酶柯巴基焦磷酸合酶（Copalyl Diphosphate Synthase，CPS）及類貝殼杉烯合酶（Kaurene Synthase-like，KSL）環(huán)化得到二萜類化合物骨架次丹參酮二烯（Miltiradiene）;次丹參酮二烯再經(jīng)一系列細(xì)胞色素P450單加氧酶（Cytochrome P450，CYP450）的修飾作用最終生成丹參酮類化合物[9-12]。由此可見，CYP450與丹參酮類化合物的生物合成過(guò)程密切相關(guān)，因此，CYP450的基因克隆和功能研究對(duì)解析萜類生物合成途徑具有重要作用。

CYP450是含有亞鐵血紅素的一類酶，在細(xì)胞中主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上，是植物代謝最大的酶家族之一，約占植物基因組編碼基因的1%[13]。它作為一種末端加氧酶，具有廣泛的催化活性，參與多種生物化學(xué)途徑，產(chǎn)生初級(jí)和次級(jí)代謝物如苯丙烷類、生物堿類、萜類、脂類等[14-15]。近年來(lái)，對(duì)CYP450的結(jié)構(gòu)、功能特別是對(duì)其在次生代謝途徑中的功能研究取得較大進(jìn)展。在丹參中，已經(jīng)鑒定到3個(gè)CYP450參與丹參酮生物合成途徑：CYP76AH1能夠催化次丹參酮二烯合成鐵銹醇（Ferruginol）[16];CYP76AH3催化鐵銹醇可以同時(shí)合成11-羥基鐵銹醇（11-hydorx Ferruginol）、柳杉酚（Sugiol）和11-羥基柳杉酚（11-hydorxy sugiol）;CYP76AK1可分別羥基化11-羥基鐵銹醇和11-羥基柳杉酚的C20位點(diǎn)生成11，20-二羥基鐵銹醇（11，20-hydorx Ferruginol）及11，20-二羥基柳杉酚（11，20-hydorxy Sugiol）[17]。據(jù)推測(cè)的丹參酮生物合成途徑，除了已經(jīng)鑒定的3個(gè)CYP450外，仍有其他CYP450參與丹參酮生物合成過(guò)程。

本研究基于Xu等篩選的33個(gè)丹參根周皮顯著高表達(dá)的CYP450[18]，結(jié)合已發(fā)表的丹參全基因組及轉(zhuǎn)錄組信息[19-20]，篩選并克隆到可能參與丹參酮合成的SmCYP81C16;系統(tǒng)分析其進(jìn)化關(guān)系及其表達(dá)譜，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及保守結(jié)構(gòu)域等;構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化丹參，獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根陽(yáng)性株系，利用UPLC及代謝組學(xué)檢測(cè)分析技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)和對(duì)照株系中丹參酮類化合物含量變化，有助于進(jìn)一步驗(yàn)證SmCYP81C16的具體催化功能，為進(jìn)一步揭示丹參酮類化合物生物合成途徑奠定重要基礎(chǔ)。

1?儀器與試藥

1.1?儀器?超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：NanoDrop 2000C）;凝膠成像系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)：GelDoc XR+）;電泳儀（北京市六一儀器廠，型號(hào)：DYY-8C型）;熱循環(huán)儀（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：9700系列）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，型號(hào)：CFX96）;制冰機(jī)（SANYO，日本，型號(hào)：Sim-F140）;電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，型號(hào)：AL204-IC）;小型臺(tái)式高速離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：Sigma-1-14）;金屬浴（北京銀金杏生物科技有限公司，型號(hào)：DK-8D）;搖床（太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠，型號(hào)：DDHZ-300）;-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，型號(hào)：ULT2586-4-V48）;UPLC system BCH C18 column（Waters，美國(guó)，1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;HPLC-LTQ/FTICR-MS（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）。

1.2?試劑?RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP441）、質(zhì)粒小提試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP103-03）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)：DP209-03）、PrimeScriptTM II 1st strand cDNA Synthesis Kit（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號(hào)：6210A）、PyrobestTM DNA Polymerase（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號(hào)：R005A）、T4 DNA Ligase（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，貨號(hào)：2011A）、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：CB501-02）、Gateway BP ClonaseTM II Enzyme Mix（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：11789-020）、Gateway LR ClonaseTM II Enzyme Mix（Invitrogen公司，美國(guó)，貨號(hào)：11791-020）;菌株E.coil DH5α Competent Cells（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司，貨號(hào)：ZK206）。

1.3?樣品?兩年生丹參（S.miltiorrhiza）99-3植物采自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所試驗(yàn)地，于盛花期采集丹參根、莖、葉、花等部位，清水洗凈，置于液氮中速凍，并保存于-80 ℃冰箱中備用。

2?方法與結(jié)果

2.1?RNA提取和cDNA合成?取丹參不同部位的樣品，置于研缽中，液氮研磨至均勻粉末，依據(jù)天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作步驟提取丹參總RNA，利用NanoDrop2000進(jìn)行含量測(cè)定以及1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性。利用無(wú)RNA酶的脫氧核糖核酸酶（DNase I）對(duì)提取的RNA進(jìn)行處理，去除RNA提取物中所含的DNA;再利用寶日醫(yī)公司的PrimeScriptTM II 1st strand cDNA合成試劑盒，按照提供的反應(yīng)條件和步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈互補(bǔ)鏈DNA（cDNA）。

2.2?SmCYP81C16基因克隆及生物信息學(xué)分析?基于丹參基因組中的SmCYP81C16基因全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)擴(kuò)增的特異引物SmCYP81C16-F/R，引物序列見表1。使用TaKaRa公司的Pyrobest DNA聚合酶擴(kuò)增SmCYP81C16基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后連接pEASY-Blunt Zero載體進(jìn)行測(cè)序。將克隆到的正確序列使用Softberry（http：//linux1.softberry.com/）提供的FGENESH工具進(jìn)行基因序列分析，得到基因結(jié)構(gòu)和編碼的蛋白質(zhì)序列。使用SOMPA在線網(wǎng)站進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)ExPASy（https：//web.expasy.org/compute_pi/）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，在InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/）在線工具中進(jìn)行同源搜索，預(yù)測(cè)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)Swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三維同源建模。

丹參酮合成途徑研究較為深入，SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1是丹參酮合成途徑的關(guān)鍵酶[16-17]，SmCYP71D375也參與了丹參酮合成途徑[21]。另外，在NCBI中下載搜索其他植物中已經(jīng)鑒定功能的CYP450蛋白序列，通過(guò)Clustal W方法對(duì)所選蛋白序列進(jìn)行序列比對(duì)，在MEGA6中使用鄰接法（Neighbour Joining Method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3?構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體?設(shè)計(jì)SmCYP81C16基因全長(zhǎng)的過(guò)表達(dá)（Over-expression，OE）引物，根據(jù)Gateway原理在引物前添加attB序列，所用引物名稱為：SmCYP81C16-OEF/R，引物序列見表1。以重組質(zhì)粒pEASY-SmCYP81C16OE為模板，使用SmCYP81C16-OEF/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物回收，再將回收產(chǎn)物進(jìn)行BP反應(yīng)，BP反應(yīng)體系：25 ng attB-PCR回收產(chǎn)物，75 ng pDONR221入門載體，1 μL LR clonase II enzyme，補(bǔ)充ddH2O至5 μL。將其反應(yīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含50 mg/L Kan（卡那霉素）的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，回收pDONR221-OE重組質(zhì)粒進(jìn)行LR反應(yīng);LR反應(yīng)體系：75 ng pDONR221-OE回收產(chǎn)物，75 ng pK7WG2D受體載體，1 μL LR clonase II enzyme，補(bǔ)充ddH2O至5 μL。反應(yīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取200 μL菌液涂布于含50 mg/L Spec（壯觀霉素）的LB固體培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，菌落PCR檢測(cè)后選擇陽(yáng)性菌株送公司測(cè)序;取測(cè)序正確的克隆提取重組質(zhì)粒pK7WG2D-SmCYP81C16，將重組質(zhì)粒（pK7WG2D-SmCYP81C16）和空載體（pK7WG2D）分別轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060中，分別獲得SmCYP81C16的過(guò)表達(dá)毛狀根株系（C16oe）和對(duì)照株系（pkoe）。

2.4?侵染丹參葉片?取生長(zhǎng)旺盛的丹參組培苗幼嫩葉片，剪切成0.5 cm2大小的葉盤于MS培養(yǎng)基25 ℃預(yù)培養(yǎng)2 d。將轉(zhuǎn)化得到發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060 28 ℃培養(yǎng)于含50 mg/L Spec+50 mg/L Rif（利福平）的液體YEB培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4～0.6，使用MS培養(yǎng)基重懸菌體，侵染丹參葉盤后將葉盤置于MS平板上，25 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)48～72 h。將共培養(yǎng)的葉盤分別用無(wú)菌水和含500 mg/L Car（羧芐青霉素）的無(wú)菌水洗干凈后，置于含500 mg/L Car+50 mg/L Kan的MS平板上，25 ℃黑暗條件下篩選培養(yǎng)，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的毛狀根，待其生長(zhǎng)至2.0～3.0 cm后切下，置于含200 mg/L Car+15 mg/L Kan+0.1 mg/L IAA的6，7-V固體培養(yǎng)基上刺激一周后轉(zhuǎn)接至不含IAA的固體培養(yǎng)基，待長(zhǎng)出較多側(cè)根后，使用熒光顯微鏡檢測(cè)載體質(zhì)粒含有的標(biāo)簽蛋白——綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況，判斷轉(zhuǎn)基因毛狀根是否為陽(yáng)性株系。將選擇的2株陽(yáng)性株系標(biāo)記為C16oe-4、C16oe-6轉(zhuǎn)接至6，7-V液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5?丹參SmCYP81C16基因表達(dá)分析?取液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)了1個(gè)月的只轉(zhuǎn)化了空載體的對(duì)照株系（pkoe）和轉(zhuǎn)化了SmCYP81C16過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的株系（C16oe），以及丹參根（R）、莖（S）、葉（L）、花（F）、周皮（R1）、韌皮部（R2）和木質(zhì)部（R3），分別提取總RNA，再將這些RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。挑選SmCYP81C16基因特異性片段設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）引物：SmCYP81C16-qF/R，引物序列見表1。以丹參SmACTIN（HM231319.1）作為內(nèi)參基因，制備qRT-PCR體系：2×SYBR Premix Ex Taq II 2.5 μL，cDNA模板1 μL，引物各1 μL，RNase-free ddH2O 4.5 μL。qPCR反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。65～95 ℃時(shí)做熔解曲線，收集Ct值，以2-△△Ct方法[22]計(jì)算不同樣品間該基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.6?UPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮類化合物含量?毛狀根在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4個(gè)月后取出拍照，烘干后稱重，使用球磨儀打粉，每100 mg毛狀根用0.5 mL甲醇提取，提取物超聲處理30 min，8 000 r/min離心10 min，用0.22 μm尼龍過(guò)濾器將上清過(guò)濾至棕色液相小瓶中，采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm;Waters）;檢測(cè)波長(zhǎng)，255 nm;柱溫，25 ℃;流速，0.25 mL/min;進(jìn)樣量，2 μL，流動(dòng)相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫條件為20%～60% A（0～5 min），60%～70% A（5～20 min），70%～80% A（20～25 min），80%～100% A（25～26 min），100% A（26～30 min）。記錄各化合物的峰面積，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2.7?代謝組學(xué)分析轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮類化合物含量?將丹參樣本在液氮冷凍下粉碎研磨成粉末后，精密稱取上述樣品約200 mg置于10 mL具塞玻璃離心管中，加入2 mL 75%甲醇和100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，封口膜封好瓶蓋，渦旋60 s，超聲提取60 min（功率140 W，頻率42 kHz），4 500 r/min離心10 min后，取上清液過(guò)0.22 μm微孔濾膜后進(jìn)樣分析。色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB C18柱（100×2.1 mm，3.5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B）;流速：0.3 mL/min;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm、360 nm;梯度洗脫：0～10 min，5%～15%A;10～40 min，15%～35%A;40～50 min，35%～65%A;50～55 min，65%～100%A;55～56 min，100%～5%A;56～60 min，5%A。質(zhì)譜條件：離子源：ESI;檢測(cè)模式：正離子;噴霧電壓：4.2 kV;鞘氣（N2）流速：40 arb;輔助氣（N2）流速：15 arb;吹掃氣（N2）流速：3 arb;毛細(xì)傳輸管電壓：42 V;毛細(xì)傳輸管溫度：275 ℃;錐孔電壓：106 V;掃描方式：FT全掃描（Full Scan）;掃描范圍：m/z 100～2 000 Da;分辨率：50 000;MSn采用LTQ全掃描（Full Scan）方式進(jìn)行掃描，通過(guò)數(shù)據(jù)依賴掃描（data dependent scan）模式對(duì)最強(qiáng)和次強(qiáng)的離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離（CID）;CID分辨寬度為2 Da;碰撞能量：35%;碰撞氣：高純氦氣（He）。數(shù)據(jù)采集采用Xcalibur 2.0 SR2（Thermo Fisher Scientific）軟件。

2.8?轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量檢測(cè)?設(shè)計(jì)丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因DXS2、CPS1、KSL1、CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1的特異性片段擴(kuò)增引物，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)這些基因在轉(zhuǎn)基因毛狀根株系和對(duì)照株系中的相對(duì)表達(dá)量，以丹參SmACTIN（HM231319.1）作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。丹參酮生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的引物見表2。

2.9?結(jié)果

2.9.1?SmCYP81C16基因克隆及其編碼的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析?利用RT-PCR方法克隆得到SmCYP81C16基因全長(zhǎng)1 497 bp，編碼498個(gè)氨基酸殘基，二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，SmCYP81C16蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占48.59%，β-折疊占4.02%，延伸鏈占11.24%，無(wú)規(guī)卷曲占36.14%。通過(guò)ExPASy對(duì)該蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為55.8 kDa，理論等電點(diǎn)為8.32。通過(guò)Interpro進(jìn)行同源搜索，預(yù)測(cè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域，其結(jié)果顯示該蛋白在Inerpro數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列為IPR001128。見圖1。預(yù)測(cè)該蛋白在5～27位氨基酸為跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)SWISS-MODEL對(duì)其進(jìn)行3D同源建模，模型以5ylw.1.A為模板構(gòu)建，模板蛋白質(zhì)與SmCYP81C16蛋白質(zhì)序列的序列同源性可達(dá)33.68%，覆蓋率為91.9%。見圖2。

2.9.2?系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析?將SmCYP81C16蛋白質(zhì)序列與其他CYP450蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，所選序列為：丹參中的SmCYP76AH1（JX422213）、SmCYP76AH3（KR140168）、SmCYP76AK1（KR140169）和SmCYP71D375（AWD93836），人參（Panax ginseng C.A.Mey）中的PgCYP716A47（JN604537）和PgCYP716A53v2（JX036031），水稻（Oryza sativa L.）中的OsCYP99A3（LOC4335091）、OsCYP701A8（LOC4341343）作為參考序列，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，見圖3，結(jié)果顯示SmCYP81C16與SmCYP71D375親緣關(guān)系最為相近。

2.9.3?SmCYP81C16的表達(dá)譜分析?利用SmCYP81C16的qRT-PCR的引物，以2年生丹參的根（R）、莖（S）、葉（L）、花（F）、周皮（R1）、韌皮部（R2）和木質(zhì)部（R3）的cDNA為模板，檢測(cè)了該基因在丹參不同組織/器官中的表達(dá)特點(diǎn)。結(jié)果表明，該基因在丹參的莖（S）和根的周皮部（R1）中顯著高豐度表達(dá)，在葉中的表達(dá)量最低。見圖4。

2.9.4?SmCYP81C16過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因毛狀根獲得?將含有SmCYP81C16基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌（ACCC10060）最終獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。利用qRT-PCR方法檢測(cè)了不同轉(zhuǎn)基因毛狀根株系中SmCYP81C16的相對(duì)表達(dá)量，與對(duì)照株系比較，過(guò)表達(dá)株系C16oe-4和C16oe-6中基因的過(guò)表達(dá)倍數(shù)分別為2.34倍和92.9倍，如圖5A所示，表明已成功獲得該基因的過(guò)表達(dá)毛狀根株系;SmCYP81C16過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因毛狀根和對(duì)照株系中的毛狀根示于圖5B，可見這些毛狀根的生長(zhǎng)發(fā)育正常，無(wú)表型差異。

2.9.5?轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮類化合物含量檢測(cè)篩選出的丹參轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性毛狀根在液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)4個(gè)月后，拍照，見圖5B，UPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照株系比較，二氫丹參酮Ⅰ，見圖6A、隱丹參酮，見圖6B、丹參酮Ⅰ，見圖6C和丹參酮ⅡA，見圖6D的含量在SmCYP81C16過(guò)表達(dá)的C16oe-4毛狀根株系中均呈上升趨勢(shì)，在C16oe-6株系中變化不明顯。見圖6。

2.9.6?SmCYP81C16轉(zhuǎn)基因毛狀根代謝組學(xué)分析利用高效液相色譜-傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀對(duì)丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根進(jìn)行化學(xué)成分檢測(cè)，與對(duì)照株系比較，二氫丹參酮Ⅰ，見圖7A、隱丹參酮，見圖7B、丹參酮Ⅰ，見圖7C、丹參酮ⅡA，見圖7D、丹參酮ⅡB，見圖7E、丹參酸甲酯，見圖7F和柳杉酚，見圖7H的含量在C16oe-4株系中含量顯著升高，鼠尾酮，見圖7G的含量在C16oe-4和C16oe-6株系中呈升高趨勢(shì)。其中在C16oe-4株系中，柳杉酚，見圖7H含量是對(duì)照組的3.39倍，以上數(shù)據(jù)為SmCYP81C16參與丹參體內(nèi)丹參酮的生物合成提供依據(jù)。

2.9.7?SmCYP81C16轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量檢測(cè)?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照株系比較，丹參酮生物合成途徑關(guān)鍵酶基因DXS2（脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因），見圖8A、CPS1，見圖8B、KSL1，見圖8C、CYP76AH1，見圖8D的表達(dá)量在過(guò)表達(dá)毛狀根中均顯著提高。其中C16oe-4和C16oe-6株系中DXS2的基因表達(dá)量是對(duì)照的4.34和12.70倍，見圖8所示。CYP76AH3，見圖8E和CYP76AK1，見圖8F只在C16oe-6中顯著高于對(duì)照株系，但在C16oe-4株系中與對(duì)照株系比較，變化不明顯。

3?討論

隨著分子生物學(xué)以及本草基因組學(xué)[23-24]相關(guān)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展，CYP450在次生代謝途徑中的功能正在逐步得以驗(yàn)證。近年來(lái)，利用異源表達(dá)和RNA干擾等技術(shù)相繼在人參[25]、黃花蒿（Artemisia annua Linn.）[26]等多種藥用植物中鑒定出參與次生代謝途徑的CYP450。在丹參酮生物合成途徑中，目前只鑒定了3個(gè)參與丹參酮類化合物結(jié)構(gòu)修飾的CYP450基因：CYP76AH1、CYP76AH3和CYP76AK1，仍有若干參與丹參酮合成的CYP450基因有待于鑒定。本研究通過(guò)對(duì)于丹參基因組[19]以及轉(zhuǎn)錄組[20]數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，篩選并克隆丹參酮生物合成途徑的候選基因，為丹參酮生源途徑的解析提供參考。

Xu等[18]證實(shí)丹參根周皮是丹參酮合成和積累的主要部位，丹參酮生物合成途徑關(guān)鍵酶編碼基因在根及根周皮中顯著高表達(dá)。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SmCYP81C16在丹參的周皮部高豐度表達(dá)，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，SmCYP81C16與SmCYP71D375親緣關(guān)系最為相近，SmCYP71D375被證實(shí)在丹參體內(nèi)催化丹參酮的生物合成[21]，表明SmCYP81C16可能參與丹參酮的生物合成。進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因毛狀根、UPLC和代謝組學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行鑒定，研究發(fā)現(xiàn)SmCYP81C16過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因丹參毛狀根中4種主要的丹參酮類化合物的含量與對(duì)照相比呈升高趨勢(shì)，在C16oe-4株系中較明顯，在C16oe-6株系中不明顯，可能與轉(zhuǎn)基因毛狀根不同株系的穩(wěn)定性不一樣有關(guān)。同時(shí)，檢測(cè)了在SmCYP81C16過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量變化，與對(duì)照株系相比，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵酶基因表達(dá)量均呈上升趨勢(shì)，此結(jié)果為SmCYP81C16在丹參體內(nèi)催化丹參酮的生物合成提供證據(jù)。

本研究推測(cè)SmCYP81C16具有正向調(diào)控丹參酮生物合成的作用，但其具體催化底物及催化產(chǎn)物仍未知，后期將通過(guò)體外酶促反應(yīng)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)和解析SmCYP81C16催化丹參酮生物合成的機(jī)理，為丹參酮生物合成途徑的解析奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]Wang X，Morris-Natschke SL，Lee KH.New developments in the chemistry and biology of the bioactive constituents of Tanshen[J].MedRes Rev，2007，27（1）：133-148.

[3]Kim MK，Park GH，Eo HJ，et al.Tanshinone I induces cyclin D1 proteasomal degradation in an ERK1/2 dependent way in human colorectal cancer cells[J].Fitoterapia，2015，101（Complete）：162-168.

[4]Zhang K，Wang J，Jiang H，et al.Tanshinone IIA inhibits lipopolysaccharide-induced MUC1 overexpression in alveolar epithelial cells[J].Am J Physiol Cell Physiol，2014，306（1）：59-65.

[5]Yu QX，Chen HL，Sheng LL，et al.Sodium tanshinone IIA sulfonate prolongs the survival of skin allografts by inhibiting inflammatory cell infiltration and T cell proliferation[J].Int Immunopharmacol，2014，22（1）：277-284.

[6]Munagala R，Aqil F，Jeyabalan J，et al.Tanshinone IIA inhibits viral oncogene expression leading to apoptosis and inhibition of cervical cancer[J].Cancer Letters，2015，356（2）：536-546.

[7]Yun SM，Jung JH，Jeong SJ，et al.Tanshinone IIA induces autophagic cell death via activation of AMPK and ERK and inhibition of mTOR and p70 S6K in KBM-5 leukemia cells[J].Phytother Res，2014，28（3）：458-464.

[8]Zhou L，Zuo Z，Chow MS.Danshen：An overview of its chemistry，pharma-cology，pharmacokinetics，and clinical use[J].J Clin Pharmacol，2005，45（12）：1345-1359.

[9]Kai GY，Xu H，Zhou CC，et al.Metabolic engineering tanshinone biosynthetic pathway in Salvia miltiorrhiza hairy root cultures[J].Metab Eng，2011，13（3）：319-327.

[10]Xu ZC，Ji AJ，Zhang X，et al.Biosynthesis and regulation of active compounds in medicinal model plant Salvia miltiorrhiza[J].Chin Herbal Meds，2016，8：3-11.

[11]Peters RJ.Two rings in them all：the labdane-related diterpenoids[J].Nat Prod Rep，2010，27：1521-1530.

[12]Ma Y，Yuan L，Wu B，et al.Genome-wide identification and characterization of novel genes involved in terpenoid biosynthesis in Salvia miltiorrhiza[J].J Exp Bot，2012，63（7）：2809-2823.

[13]Nelson D，Werck-Reichhart D.A P450-centric view of plant evolution[J].Plant J，2011，66（1）：194-211.

[14]Mizutani M.Impacts of diversification of cytochrome P450 on plant metabolism[J].Biol Pharm Bull，2012，35（6）：824-832.

[15]Pateraki I，Heskes A M，Hamberger B.Cytochromes P450 for terpene functionalisation and metabolic engineering[J].Adv Biochem Eng Biot，2015，148：107-139.

[16]Guo J，Zhou YJ，Hillwig ML，et al.CYP76AH1 catalyzes turnover of miltiradiene in tanshinones biosynthesis and enables heterologous production of ferruginol in yeasts[J].PNAS，2013，110（29）：12108-12113.

[17]Guo J，Ma X，Cai Y，et al.Cytochrome P450 promiscuity leads to a bifurcating biosynthetic pathway for tanshinones[J].New Phytologist，2015，210（2）：525-534.

[18]Xu Z，Peters RJ，Weirather J，et al.Full-length transcriptome sequences and splice variants obtained by a combination of sequencing platforms applied to different root tissues of Salvia miltiorrhiza and tanshinone biosynthesis[J].Plant J，2015，82（6）：951-61.

[19]Xu HB，Song JY，Luo HM，et al.Analysis of the genome sequence of the medicinal plant Salvia miltiorrhiza[J].Molecular Plant，2016，9（6）：949-952.

[20]Luo HM，Zhu YJ，Song JY，et al.Transcriptional data mining of Salvia miltiorrhiza in response to methyl jasmonate to examine the mechanism of bioactive compound biosynthesis and regulation[J].Physiologia Plantarum，2014，152：241-255.

[21]浦香東，徐志超，宋經(jīng)元.基于組學(xué)的丹參酮生物合成途徑新基因CYP71D375克隆和功能研究[J].中國(guó)科學(xué)，2018，48（4）：390-398.

[22]Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[23]宋經(jīng)元，徐志超，陳士林.本草基因組學(xué)專輯簡(jiǎn)介[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2018，48（4）：349-351.

[24]Xin TY，Zhang Y，Pu XD，et al.Trends in Herbgenomics[J].Science China：Life Sciences，2019，62（3）：288-308.

[25]Han JY，Kim HJ，Kwon YS，et al.The Cyt P450 enzyme CYP716A47 catalyzes the formation of protopanaxadiol from Dammarenediol-II during ginsenoside biosynthesis in Panax ginseng[J].Plant Cell Physiol，2011，52（12）：2062-73.

[26]Komori A，Suzuki M，Seki H，et al.Comparative functional analysis of CYP71AV1 natural variants reveals an important residue for the successive oxidation of amorpha-4，11-diene[J].FEBS Lett，2013，587（3）：278-84.

（2020-02-10收稿?責(zé)任編輯：徐穎）