百會及印堂穴對七氟醚麻醉后大鼠認知功能的影響及機制探究

詹飛燕 魏教華 吳仁慶

摘要?目的：觀察電針百會穴、印堂穴對七氟醚麻醉后大鼠認知功能的影響，同時檢測腦組Sonic Hedgehog（Shh）通路標志性蛋白水平的變化。方法：納入30只SPF級SD大鼠，隨機分為空白組、麻醉組及電針組，每組10只。空白組大僅進行模擬捉拿，麻醉組大鼠吸入3.0%七氟醚30 min，隨后用1.5%七氟醚麻醉維持3 h，電針組在此基礎上進行電針干預，連續干預7 d。干預結束后用Morris水迷宮檢測各組學習記憶能力變化，HE染色法觀察各組海馬組織的結構變化，Western blot及Real-Time PCR法檢測各組海馬組織Shh、Gli、PI3K、pAKT蛋白及mRNA的水平變化。結果：1）Morris水迷宮顯示：麻醉組及電針組大鼠游泳總路程及逃避潛伏期明顯較空白組延長（P<0.05），其中電針組較麻醉組明顯改善（P<0.05）。2）HE染色提示空白組大鼠海馬組織結構形態正常，麻醉組及電針組大鼠海馬組織均出現明顯結構破壞，細胞排列錯亂，神經元細胞出現明顯變形縮小，其中電針組海馬形態結構較麻醉組改善。3）Western blot及PT-PCR的結果顯示，麻醉組及電針組大鼠海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表達較空白組降低（P<0.05），其中電針組較麻醉組改善（P<0.05）。結論：七氟醚可對認知能力產生一定損害效應，電針百會穴、印堂穴可明顯提升認知能力，其作用機制可能與激活Shh通路通路有關。

關鍵詞?七氟醚;學習記憶能力;百會穴;印堂穴;海馬;Shh通路

Study on Effects of Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）on Cognitive Function of Rats After Sevoflurane Anesthesia and Its Mechanism

ZHAN Feiyan，WEI Jiaohua，WU Renqing

（Department of Anesthesiology，United Logistics Support Force 908 Hospital，Nanchang 330000，China）

Abstract?Objective：To observe effects of electroacupuncture at Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）on cognitive function after sevoflurane anesthesia in rats，and to detect level changes of Shh pathway marker protein in brain tissue.Methods：Thirty SPF SD rats were included in this study and randomly divided into blank group（n=10），anesthesia group（n=10）and electroacupuncture group（n=10）.The rats in the blank group were only subjected to simulated capture.The rats in the anesthesia group inhaled 3.0% sevoflurane for 30 min，then they were anesthetized with 1.5% sevoflurane for 3 h.On this basis，the electroacupuncture group was treated with electroacupuncture for 7 d.After the intervention，Morris water maze was used to detect changes of learning and memory ability in each group.HE staining was used to observe structural changes of hippocampal tissue in each group.Western blot and Real-Time PCR were used to detect level changes of Shh，Gli，PI3K，pAKT protein and mRNA in hippocampal tissue in each group.Results：The Morris water maze showed that total swimming distance and escape latency in the anesthesia group and electroacupuncture group were significantly longer than those in the blank group（P<0.05），and those in the electroacupuncture group were significantly improved compared with those in the anesthesia group（P<0.05）.2）HE staining showed that the morphology of hippocampal tissue was normal in the blank group，and the hippocampal tissue in the anesthesia group and electroacupuncture group showed obvious structural destruction，disordered arrangement of cells and obvious deformation and reduction of neuron cells.The morphological structure of hippocampus in the electroacupuncture group was better than that in the anesthesia group.3）Western blot and PT-PCR showed that the expressions of Shh，Gli，PI3K，p-AKT protein and mRNA in hippocampus of rats in the anesthesia group and electroacupuncture group were lower than those in the blank group（P<0.05），and those in electroacupuncture group were better than those in the anesthesia group（P<0.05）.Conclusion：Sevoflurane can have a certain damage effect on cognitive ability.Electroacupuncture at Baihui（GV 20）and Yintang（EX-HN3）can obviously improve cognitive ability，and its mechanism may be related to activation of Shh pathway.

Keywords?Sevoflurane; Learning and memory ability; Baihui（GV 20）; Yintang（EX-HN3）; Hippocampus; Shh pathway

中圖分類號：R245文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.013

術后認知障礙（Postoperative Cognitive Dysfunction，POCD）指的是患者手術麻醉前無認知功能障礙，術后出現注意力、記憶力、定向力等認知功能減退表現的中樞神經系統并發癥[1-2]。有數據顯示，POCD的老年患者發生阿爾茲海默病的風險明顯高于認知功能正常的老年人群[3-5]，因此降低POCD發生率具有重要的臨床意義。學者認為多途徑綜合作用導致POCD的發生，隨著研究的不斷深入POCD的發病機制逐漸傾向于麻醉劑促使中樞神經炎性反應激活，對中樞神經產生一定的神經毒性而出現認知受損。Sonic Hedgehog（Shh）信號通路在海馬神經發生發育中占據重要位置，近年來有研究[6-7]顯示成年大鼠受到炎性刺激后腦組織Shh被激活，更有研究人員[8]認為腦組織Shh信號激活具有炎性反應依賴性。

針灸是中醫學的重要組分，大量資料顯示刺激特定穴位可明顯改善認知功能。百會穴位于機體巔頂，是三陽五會之穴;印堂穴位于額葉，解剖學顯示印堂穴所在皮下分布大量的末梢神經。本團隊在前期研究證實刺激百會穴、印堂穴對POCD療效確切，但其作用機制不清，故本研究利用動物模型進一步探析百會穴、印堂穴治療POCD的作用機制，具體如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?30只SPF級SD大鼠，均購自長沙市天勤生物有限公司;許可證號為scxk（湘）2014-0010，scxk（湘）2014-0011。體質量550～600 g，平均體質量（575±5.84）g，鼠齡16～18個月，平均鼠齡（17±0.35）個月。

1.1.2?儀器與試劑?Morris水迷宮（江蘇賽昂斯公司）;Shh一抗抗體（Abcam公司，ab19897）、Gli一抗抗體（Abcam公司，ab151796）、PI3K一抗抗體（Abcam公司，ab129182）、p-AKT一抗抗體（Abcam公司，ab129402）;Model68酶標儀（美國Bio-Rad Laboratories）;七氟醚（山東魯南貝特制藥有限公司，批號：65170507）;Vamos氣體檢測儀（德國Draeger公司）;針具（華佗牌0.3 mm×25 mm）;SDS配膠試劑盒（碧云天生物公司）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

1.2.1.1?分組?將30只大鼠按照隨機數字法分為空白組、麻醉組及電針組，每組10只。3組大鼠在鼠齡、體質量、飼養環境等方面差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2.1.2?POCD模型制備

1）空白組處理方法：僅將空白組大鼠置于麻醉箱內，持續吸入純氧3 h，隨后返回飼養籠內，安靜情況下飼養，自由飲水攝食。

2）麻醉組及電針組處理方法：依據參考文獻[9]中的方法建立POCD模型，將麻醉組及電針組大鼠置于鋼化麻醉箱（70 cm×50 cm×40 cm）中，麻醉箱設置2個端口，一個端口接入麻醉機，另一個端口接入氧氣管，隨后麻醉機釋放七氟醚，同時使用Vamos氣體檢測儀對麻醉箱內七氟醚濃度進行檢測，使其保持濃度3.0%，持續吸入30 min，隨后用1.5%七氟醚麻醉及2 L/min氧氣流量維持3 h。隨后吸入純氧10 min，待大鼠清醒后返回飼養籠內，安靜情況下飼養。

1.2.2?干預方法?電針組大鼠針刺百會穴、印堂穴，取穴位置參照參照李忠仁主編[10]的《實驗針灸學》，針刺深度為3 mm，每10 min行針1次，留針30 min，1次/d，連續治療14 d。空白組和麻醉組均未治療，針刺干預者對動物分組不知情。

1.2.3?觀察指標與方法

1.2.3.1?行為學檢測

1）Morris水迷宮測試：將水迷宮設置為4個象限，分別是第一象限、第二象限、第三象限及第四象限。將平臺放在西南象限（第三象限）正中距池壁22 cm處，迷宮中清水平面高于安全平臺1 cm，水溫（22±0.5）℃，室溫25 ℃，訓練期間保持環境安靜，迷宮外參照物不變，并在計算機軟件中標記平臺位置，隨后將大鼠分別從一、二、三、四個象限的順序放入水中，記錄大鼠尋找到平臺的時間，設置為逃避潛伏期，同時記錄大鼠尋找到平臺的總路程。造模前對所有大鼠進行適應性訓練2 d，4次/d。

2）定位航行實驗：測量大鼠對學習記憶的獲取能力。實驗歷時5 d，受試動物每天分別從東北、西北2個象限入水點依次進行訓練，將大鼠面向池壁放入水中，記錄其逃避潛伏期（從入水至找到安全平臺的時間），測試時間限定為60 s，超過者以60 s計。

3）空間探索實驗：完成定位航行實驗步驟后將平臺撤離，從4個象限中挑選任意一象限作為固定入水點，大鼠面向池壁放入池中，記錄大鼠在60 s內穿越原先平臺位置的次數。

1.2.3.2?HE染色觀察海馬病理結構改變?干預結束后從各組隨機選取3只大鼠，充分麻醉后灌流4%多聚甲醛溶液，隨后快速取出腦組織后分離出海馬，并隨機置于4%多聚甲醛溶液中。將標本置于包埋盒中，用流水充分去除固定液，持續30 min。用100%乙醇10 min→95%乙醇，5 min→80%乙醇5 min進行脫水后將樣本置于二甲苯中透明，將已透明的樣本置于已溶化的石蠟中進行包埋，將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成薄片5 μm薄片，撈片至載玻片后放置于45 ℃恒溫箱中烘干。染色前將石蠟切片脫蠟至水，用蘇木素染色5 min后流動水沖洗1 min，再用1%鹽酸乙醇分化1 min，再用流動水沖洗15 min后進行反藍30 min，繼續用流動水沖洗15 min后將樣本玻片置于0.5%伊紅水溶液中復染2 min，在進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，隨后將玻片置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3.3?Western blotting檢測海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白表達水平的變化?從各組中隨機抓取3只大鼠，充分麻醉后取出海馬組織，切割成約100 mg，加入1 mLRAPI裂解液，室溫條件下靜置30 min，4 ℃、15 000 r/min條件下離心5 min，取上清備用。取出25 μL進行BCA法測定樣本蛋白濃度，根據樣本上樣緩沖液=4∶1的比例進行均勻混合后將每份待測置于100 ℃水浴鍋中加熱變性7 min，變性后迅速將樣本放于冰上冷卻，保存于-20 ℃冰箱備用。隨后根據計算得出的上樣量加樣至先前配制好的SDS-PAGE凝膠孔中，進行跑膠，將目的蛋白轉膜只PVDF膜，再用封閉液對PVDF膜進行封閉，封閉后將PVDF膜置于TBS中漂洗3次，5 min/次，隨后用一抗稀釋液按照1∶500的比例稀釋β-actin、Shh、Gli、PI3K、p-AKT，4 ℃孵育過夜后置于TBS中漂洗3次，5 min/次，然后加入堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG（二抗稀釋液1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h，再用TBS漂洗3次，5 min/次。結束后在PVDF膜上滴入ECL顯影液顯影、拍照，用計算機掃描圖像，并由Bio-Rad Image軟件（Bio-Rad公司，Model Gel Doc 2000，美國）分析處理。

1.2.3.4?Real-Time PCR法檢測海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKTmRNA表達水平的變化?從各組中隨機抓取3只大鼠，充分麻醉后取出海馬組織，切割成約100 mg，加入1 mLTrizol，冰上靜置5 min后加入200 μL氯仿粉后充分混勻，冰上靜置5 min后置于4 ℃，15 000 r/min條件下離心10 min，摒棄上清液，20 μL DEPC水，根據說明書進行逆轉錄成cDNA，逆轉錄過程如下：95 ℃（6 min）→55 ℃（90 s）→72 ℃ 90 s）→72 ℃（10 min）→5 ℃（1 h）。以GAPDH為內部參照，利用ABI7500軟件得出（Ctcycle threshold）值，空白組△Ct值作為校正數值，軟件根據2-△△Ct數值計算得出Shh、Gli、Ptch1mRNA濃度水平。

1.3?統計學方法?采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，3組數據同時符合正態分布和方差齊性則采用單因素方差分析，若其中一組數據不符合正態分布，則采用多組秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?3組行為學變化?麻醉組及電針組大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期較空白組延長（P<0.05），穿越平臺次數減少（P<0.05），其中電針組明顯較麻醉組改善（P<0.05）。見表1及圖1。

2.2?3組HE染色結果比較?HE染色提示空白組大鼠海馬組織結構形態正常，麻醉組及電針組大鼠海馬組織均出現明顯結構破壞，細胞排列錯亂，神經元細胞出現明顯變形縮小，其中電針組海馬形態結構較麻醉組改善。見圖2。

2.3?3組海馬組織Shh、Gli達水平的變化?Western blot及PT-PCR的結果顯示，麻醉組及電針組大鼠海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表達較空白組降低（P<0.05），其中電針組較麻醉組改善（P<0.05）。見圖3及表2、表3。

3?討論

POCD具有一過性，是手術麻醉后出現的輕度的神經功能紊亂綜合征[11]，常發生于老年患者，主要以學習力、記憶力受損、執行力及注意力減弱為表現，其中學習記憶能力受損是POCD的核心癥狀，可在各年齡層患者發病。有研究人員[3]對1 064例不同年齡層的手術患者進行觀察，在術后3個月隨訪時發現18～39歲年齡層有5.7%患者出現POCD，而60歲以上人群有12.7%出現POCD，且POCD的老年患者出現后3個月內的死亡率明顯增加。由此對POCD進行積極預防與治療具有重要臨床意義。

臨床實踐證實刺激特定的穴位在防治POCD方面有重要療效，有團隊[12]以“健忘””呆病”“遺忘”“不識人”“恍惚”“忘前失後”“善忘”“怔忡”為術語對學習記憶障礙古籍進行梳理，結果顯示百會穴是使用頻次最高的穴位（31次），印堂穴（10次）。《黃帝內經》曰：“陽氣者，精則養神，柔則養筋”，認知為神，形以衡為代表，督脈乃陽脈之海，百會穴別名“三陽五會”，《針灸甲乙經》云：“百會為督脈，足太陽之會”，《類經圖翼》描述：“百會為督脈，足太陽、手足少陽和足厥陰之會”，以上均揭示百會穴是治療神志疾病的要穴。印堂穴亦為督脈的要穴，有醒腦開竅、安神活絡的作用。《難經·二十八難》云：“督脈者，起于下極之輸，并于脊里，上至風府，入屬于腦”[13-16]。由此可見，刺激督脈可養神充髓。本研究利用七氟醚制備POCD模型，用水迷宮檢測大鼠學習記憶能力，結果顯示POCD大鼠學習記憶能力明顯較正常大鼠明顯減退，且在研究中用HE染色發現POCD大鼠海馬區出現明顯結構破壞，細胞排列錯亂，神經元細胞出現明顯變形縮小，提示POCD與海馬結構受損關系密切。同時，刺激百會穴、印堂穴后大鼠的學習記憶能力明顯改善，且海馬的病理結構出現一定程度的修復，提示百會穴、印堂穴改善POCD模型鼠學習記憶能力與修復海馬病理結構有關。

Sonic Hedgehog（Shh）信號通路與神經系統疾病關系密切，近年來該通路與神經細胞炎性反應的關系備受關注[17]。Patched（ptc）和Smoothed（Smo）2種受體共同調控Shh通路的信號傳遞，Ptc受體與配體結合后對Shh信號通路產生負調控效應，而Smo對Shh通路的調控需在無Ptch的條件下進行，Smo被激活后介導Shh通路下游的核轉錄因子Gli的活性，從而活化PI3K/AKt信號通路，從而減輕炎性反應[18-20]。利用Western blot及Real-Time PCR顯示POCD海馬組織Shh、Gli、PI3K、p-AKT蛋白及mRNA表達均明顯下降，提示Shh信號通路參與了POCD的發生發展過程，而百會穴、印堂穴改善POCD模型鼠學習記憶能力可能是通過激活Shh通路實現的。

由此可以認為，七氟醚可對大鼠造成一過性認知障礙，百會穴、印堂穴改善POCD模型鼠學習記憶能力的作用機制可能與激活Shh信號通路有關。

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（2019-03-21收稿?責任編輯：芮莉莉）