補陽還五湯對局灶性缺血模型大鼠認知能力及PI3/KAKT信號通路的影響

董元 王志勝 張金 張兆鵬 劉玉瑩 李萍

摘要?目的：觀察補陽還五湯對局灶性缺血模型大鼠認知能力的改善作用，同時探討其對PI3K-AKT信號通路的影響。方法：選取30只SD大鼠按數字隨機法分為假手術組、模型組及中藥組，每組10只。模型組及中藥組接受改良急性局灶性缺血模型制備（MCAO術）成模后中藥組大鼠接受補陽還五湯灌胃，1次/d，連續干預14 d。假手術組及模型組大鼠接受等劑量的生理鹽水灌胃，時間同中藥組。干預結束后，比較各組行為學、腦梗死體積、海馬形態學、腦組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白/mRNA水平變化。結果：補陽還五湯可明顯縮短大鼠游泳軌跡路程及逃避潛伏期，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;補陽還五湯可縮小MCAO大鼠的腦梗死體積，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）;補陽還五湯可減少MCAO后大鼠海馬組織病理損傷征象，上調PI3K、p-Akt、Bcl-2蛋白及mRNA表達，降低Bax蛋白及mRNA水平，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：補陽還五湯可改善MCAO大鼠認知能力，其作用機制可能與介導PI3K-AKT信號通路有關。

關鍵詞?局灶性缺血;模型大鼠;補陽還五湯;認知;水迷宮;腦梗死體積;PI3K-AKT信號通路;機制

Effects of Buyang Huanwu Decoction on Cognitive Ability and the PI3/KAKT Signaling Pathway in Model Rats with Focal Ischemia

DONG Yuan，WANG Zhisheng，ZHANG Jin，ZHANG Zhaopeng，LIU Yuying，LI Ping

（Sunshine Union Hospital，Weifang 261000，China）

Abstract?Objective：To observe improvement effect of Buyang Huanwu Decoction in cognitive ability of focal ischemia model rats and explore its effects on the PI3K-AKT signaling pathway.Methods：A total of 30 SD rats were randomly divided into sham operation group（n=10），model group（n=10）and Chinese materia medica group（n=10）.The rats in the model group and the Chinese materia medica group received modified acute focal ischemia modeling（MCAO）.After the modeling，the rats in the Chinese materia medica group received intragastric administration of Buyang Huanwu Decoction once a day for 14 d.The rats in the sham operation group and the model group were given the same dose of normal saline for the same time as the Chinese materia medica group.After the intervention，behavior，volume of cerebral infarction，morphology of hippocampus and levels of PI3K，Akt and p-Akt protein/mRNA in brain tissue were compared in each group.Results：1）Buyang Huanwu Decoction could significantly shorten the swimming track and escape latency of rats，and there was significant difference compared to that in the model group（P<0.05）.2）Buyang Huanwu Decoction could reduce the cerebral infarction volume of MCAO rats，and there was significant difference compared to that in the model group（P<0.05）.3）Buyang Huanwu Decoction could reduce pathological injury signs of hippocampal tissue after the MCAO，up-regulate the expressions of PI3K，p-Akt，Bcl-2 protein and mRNA，and decrease the levels of Bax protein and mRNA，which were significantly different from those in the model group（P<0.05）.Conclusion：Buyang Huanwu Decoction can improve the cognitive ability of MCAO rats，and its mechanism may be related to mediating the PI3K-AKT signaling pathway.

Keywords?Focal ischemia; Model rats; Buyang Huanwu Decoction; Cognition; Water maze; Cerebral infarction volume; PI3K-AKT signaling pathway; Mechanism

中圖分類號：R289.5;R543文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.05.014

腦卒中具有極高的死亡率及致殘率，是腦組織血液循環障礙性疾病，隨著現代醫學水平的逐年提高，腦卒中的死亡率在逐年下降，但仍有接近80%的患者遺留明顯的神經功能缺損[1-3]，其中認知障礙是重要的后遺癥之一，影響患者康復訓練的依從性，阻礙康復。中醫在治療腦卒中方面的優勢有目共睹，其分為氣虛血瘀、痰瘀阻絡、肝腎虧虛等證型，其中氣虛血瘀臨床發病率最高[4-6]。補陽還五湯是經典傷寒經方，數百年來均廣泛運用于中風病及其相關后遺癥的治療，目前臨床資料顯示該湯劑可有效治療氣虛血瘀型腦卒中[7-9]，但其作用機制目前尚不明了。PI3K-AKT信號通路示迄今為止最重要的細胞凋亡相關性通路[10-12]，大量腦保護因子通過介導PI3K-AKT信號通路而產生療效。我們將MCAO大鼠作為研究對象，對其進行補陽還五湯干預，并檢測PI3K-AKT信號通路標志性蛋白水平的變化，以期進一步完善補陽還五湯的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

選取6周齡的雄性SPF級的SD大鼠30只納入研究，體質量230～250 g，平均體質量（215±9.38）g，均購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2007000509960，許可證號：SC-SCXK（滬）2007-0005，飼養于本院動物實驗中心。

1.1.2?試劑與儀器

電泳凝膠成像分析系統（Bio-Rad，型號：ChemiDocXRS+，購自上海伯樂生命醫學產品有限公司），BCA蛋白檢測試劑盒（西安晶彩生物科技有限公司，批號28392），SDS-PAGE電泳凝膠試劑盒（購自碧云天生物公司，批號A293）、PI3K單克隆一抗抗體（美國CST公司，批號17366S）、Akt單克隆一抗抗體（美國CST公司，批號4685S）、p-Akt單克隆一抗抗體（美國CST公司，批號：4060T）、Bcl-2單克隆一抗抗體（美國CST公司，批號15071T），Bax單克隆一抗抗體（美國CST公司，批號5023T），β-actin抗體（美國CST公司，批號3700T）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將30只大鼠隨機數字法分為假手術組、模型組及中藥組，每組10只。各組大鼠在體質量、鼠齡等方面比較差異無統計學意義（P>0.05）。具有可比性。其中模型組及中藥組大鼠參照改良的Zea Longa線栓法進行MCAO模型的制備[6]：所有大鼠適應性喂養7 d，造模前動物禁食不禁水，參照改良的Zea Longa線栓法進行MCAO模型的制備[10]。采用10%水合氯醛以0.3 mL/kg比例進行腹腔注射麻醉，頸部正中切口，鈍性分離皮下組織，逐漸分離出右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內動脈（ICA），將ECA近心端結扎，于CCA處（距離ECA、ICA交叉口0.5 cm）做一大小約0.25 mm切口，線栓經ICA插進去至大腦中動脈入口，長18～20 mm，隨后將線栓固定于CCA，隨后縫合皮膚，將線栓尾部暴露于皮膚外，2 h后輕輕拔出線栓。假手術組大鼠僅進行麻醉及分離血管后縫合皮膚。實驗過程中大鼠保溫（24 ℃）喂養，自由攝食飲水。

1.2.2?給藥方法

中藥組大鼠在造模第二天開始接受補陽還五湯灌胃治療：赤芍12 g、川芎12 g、當歸尾9 g、地龍9 g、黃芪30 g、桃仁9 g、紅花9 g。水煎，劑量按照按人/鼠公斤體質量的等效劑量計算，1次/d，連續干預7 d。模型組及假手術組以等體積生理鹽水灌胃。

1.2.3?檢測指標及方法

水迷宮：將各組大鼠于造模前及干預后進行Morris水迷宮實驗，將水迷宮池（規格：直徑2.0 m），高0.5 m，水深0.3 m水溫（25±2）℃，將水迷宮池分為4等距離點象限，選定第一象限后將直徑6 cm的平臺放置于低于水平面2 cm處的中央位置，設置為水迷宮定位航行平臺，將大鼠于第一象限放入水中，記錄其尋找平臺的游泳軌跡以及時間（逃避潛伏期）。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色：預結束后從各組大鼠中隨機選取3只大鼠，麻醉處死后冰上將大鼠腦袋迅速取出，并將腦袋置于-20 ℃冰箱中冰凍30 min，隨后沿著冠狀面將腦組織切成6個薄片，每個薄片厚度約2 mm，將切好的腦組織薄片浸泡于TTC溶液中，避光條件下反應，每2 min用毛筆翻動腦片1次，讓TTC溶液充分接觸腦片使其充分染色，反應結束后將腦片輕輕置于帶有刻度的平臺上，用高分辨率相機拍攝（佳能powershot 600X），使用Image-Pro Plus圖像分析處理系統（Motic Med 6.0 System）計算每片腦梗死體積。

HE染色：干預結束后從各組大鼠中隨機選取3只大鼠，麻醉脫頸處死后將事先配制好的多聚甲醛溶液從下腔靜脈灌流固定，隨后取出海馬組織浸泡于4%甲醛溶液，梯度乙醇進行脫水，再用二甲苯進行透明組織，將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。待石蠟完全浸入組織塊后進行包埋，再將蠟塊切成薄片，撈片后將組織置于45 ℃恒溫箱中烘干，再用二甲苯、梯度乙醇脫蠟，再用蘇木精染色15 min，再用伊紅染色數秒，隨后再次用梯度乙醇及二甲苯處理后利用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察海馬組織的病理結構。

Western blotting檢測：干預結束后從各組大鼠中隨機選取3只大鼠，麻醉處死后冰上將大鼠腦袋迅速取出，并分離出海馬組織，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL PMSF進行組織裂解，充分反應后將樣本置于4 ℃，12 000×g分離15 min，吸取上清液后加入4X蛋白上樣緩沖液，在金屬浴儀中進行蛋白變性7 min，將樣品加入至事先配制好的SDS-PAGE電泳凝膠內，總蛋白兩30 μg、電泳結束后將目標蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），轉膜后用脫脂奶粉封閉2 h，用0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗干凈后分別加入PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax以及β-actin一抗抗體，4 ℃下孵育24 h，次日取出PVDF膜后用TBST清洗3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶1 000）室溫下孵育1 h，加入ECL溶液，反應1 min后進行曝光掃描，用Image J軟件掃描條帶灰度值。

1.3?統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（±s）來描述，組間比較采用兩樣本t檢驗或兩樣本秩和檢驗;組內比較采用配對t檢驗或配對秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?各組大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期比較

與假手術組比較，模型組及中藥組大鼠游泳軌跡和逃避潛伏期延長，其中中藥組較模型組改善明顯，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1及圖1。

2.2?各組腦梗死體積比較

假手術組未見腦梗死病灶，模型組和中藥組可見明顯腦梗死病灶（表現為蒼白色區域），中藥組干預后的腦梗死病灶體積百分比明顯小于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3?各組海馬組織病理結構比較

假手術組組織結構正常，細胞排列整齊，模型組海馬組織細胞排列紊亂，大量的壞死神經元細胞，部分存活的神經元細胞明顯縮小;中藥組大鼠海馬組織細胞排列較模型組整齊，僅有部分細胞排列散亂，部分神經元細胞出現壞死征象，大部分神經元細胞體積大與模型組。見圖2。

2.4?各組Western blotting結果

Western blotting顯示造模后大鼠腦組織PI3K、p-Akt、Bcl-2表達降低，Bax水平減少，經過補陽還五湯干預后上述指標有所恢復，與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3及圖3。

3?討論

腦卒中是臨床發病率極高的高血管事件種類，其中缺血性腦卒中占近75%，是腦卒中的主要類型，因此研究缺血性腦卒中的治療方案具有重要臨床意義。在過去數十年間，全球近200種藥物進入腦卒中治療的臨床實驗，但僅有組織型纖維蛋白溶活劑（tissue-type Plasminogen Activator，tPA）獲得美國國家食品藥品管理局批準應用于臨床治療，但有數據顯示僅有3%～5%的患者對tPA顯示出臨床敏感性[13-14]。高達95%～97%的缺血性腦卒中患者目前未有確實有效的治療藥物，形勢非常嚴峻。研究人員認為，目前缺血性腦卒中療效不盡人意的主要原因有[15-16]：神經保護類藥物作用機制過于單一;缺血性腦卒中后神經修復時間窗短。因此具有較長作用“時間窗”的多靶點的神經保護類藥物將是研發缺血性腦卒中藥物的關鍵。本研究利用補陽還五湯對MCAO大鼠進行干預，結果顯示補陽還五湯可明顯改善缺血性腦卒中后大鼠的認知能力，同時縮小其腦梗死組織的區域，并改善了海馬的組織結構。

中醫學認為人之一身離不開氣血，《黃帝內經》云：“人之所有者，血與氣耳”“氣血不和，則百病乃變化而生”。由此可見，氣血是諸病之主因。氣虛、氣滯則血運失常而致瘀血內生，而瘀血亦可加重氣機運行不暢，惡化氣虛之證，二者互為因果。早在《黃帝內經》即已記載正氣虧虛，風邪趁虛而入，瘀血阻絡而成中風;東漢張仲景亦以“內虛邪中”解釋中風病病機，故認為治療“本氣自虛”是本病的主要治則。《諸病源候論》中寫到：“風半身不遂者，脾胃氣弱，血氣偏虛”。故從氣血虧虛研究中風的發生發展具有理論依據。劉完素亦認為“人卒中，則氣血不通而偏枯也”，所以氣血運行不暢是偏枯的緣由。王清任認為人之氣血分為十，若氣血虧虛至五時則半身無氣，氣虛則血瘀，停滯脈絡，必然出現偏癱之證，故其創立了大補元氣、活血化瘀通絡的補陽還五湯。方中黃芪為君藥，具有益氣健脾、升陽舉陷、益衛固表、利尿消腫、托毒生肌之功，是大補元氣之要藥，氣足則血行[17-18]。當歸主要入心、肝、脾經，有補血活血之功，是補血之圣藥，《醫學啟源》云：“當歸，氣味溫甘，能和血補血，尾破血，身和血”。故本方用當歸尾以奏活血化瘀之功。桃仁、紅花均可活血化瘀，瘀去則新血生，正如《本草匯言》有載“紅花，破血、行血、活血、調血之藥也”。川芎乃“血中之氣藥”，可行氣活血散瘀，《神農本草經》記載：“主中風入腦頭痛、寒痹，筋脈緩急”。可見川芎亦為只要中風諸證之要藥[19]。赤芍微苦，有散瘀止痛之功，地龍善走串于經絡間，有通絡、息風之功，與黃芪、當歸、川芎諸藥合用，可加強祛瘀通絡之功[20]。本研究通過動物實驗再次確認補陽還五湯確對腦中風具有理想的療效，其可明顯改善大鼠的認知能力。

本研究發現PI3K-Akt信號通路的標志性蛋白水平發生了變化，補陽還五湯上調PI3K、p-Akt、Bcl-2的表達水平，降低Bax的水平，這提示補陽還五湯對MCAO大鼠的神經保護效應可能與抗凋亡通路有關。缺血性腦卒中的發病機理復雜，但大部分病理過程與細胞的異常凋亡關系密切，PI3K-Akt信號通路是凋亡相關的重要生物學通路[10-11]。PI3K是脂質激酶，磷酸化后生成磷脂酰肌醇磷酸，促使Akt移聚至細胞膜上引起其構象改變，Akt是PI3K下游的靶向因子之一，PI3K通過磷酸化作用使其Ser473位點效應產生改變，對Akt進行聯級活化，發生核移位，影響大量轉錄子調節器和因子，其中包括Bcal-2及Bax等。有數據顯示PI3K-Akt信號通路對神經突觸的生長及其可塑性關系密切，從而影響學習、記憶等認知功能的改變，本研究亦證實了這一觀點。

總之，補陽還五湯可改善局灶性缺血模型大鼠認知能力，其作用機制可能與介導PI3K-AKT信號通路有關。

參考文獻

[1]陳雨，謝懿，張榕，等.氯吡格雷聯合低分子肝素鈣治療進展性缺血性腦卒中效果分析[J].當代醫學，2018，24（28）：74-76.

[2]張耀軍.早期靜脈溶栓治療急性缺血性腦卒中的臨床療效[J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（82）：9-10.

[3]符茂東，張雯，李笑笑，等.急性缺血性腦卒中病人Barthel指數與中醫證型的相關性分析[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2018，16（16）：2300-2303.

[4]潘亞茹，王厚強，王丹，等.中醫為主綜合治療缺血性腦卒中恢復期的臨床療效分析[J].臨床研究，2018，26（9）：24-25.

[5]徐俊，胡承志，丁斌，等.高血壓頸動脈粥樣硬化患者血清25（OH）D及vWF水平變化及其關系[J].安徽醫學，2018，39（7）：813-815.

[6]韓陳香.中醫辨證治療缺血性進展性腦卒中急性期的臨床觀察[J].臨床醫藥文獻（連續型電子期刊），2018，5（53）：31-32.

[7]高偉紅.補陽還五湯聯合天麻鉤藤飲治療腦梗死的臨床效果[J].內蒙古中醫藥，2018，37（8）：28-29.

[8]靳向前，梁學艷，杜安民，等.補陽還五湯配合體外沖擊波穴位沖擊治療腦卒中后下肢肌力下降的臨床研究[J].內蒙古中醫藥，2018，37（8）：14-15.

[9]李亞，鮑治誠，曹君君，等.康復治療結合加味補陽還五湯方在腦梗死患者恢復過程中的價值研究[J].雙足與保健，2018，27（15）：181-182.

[10]秦春明.網絡藥理的大黃素及其類似物抗腫瘤分子機制研究[J].中國藥物經濟學，2019，14（4）：50-53，58.

[11]賴文芳，洪海棉，張小琴，等.紅景天苷通過激活PI3K/AKT/NRF2通路減輕MCAO大鼠的神經細胞凋亡[J].中華中醫藥雜志，2016，31（5）：1883-1886.

[12]席晅，任小瓊.姜黃素通過PI3K/AKT信號通路調控神經干細胞增殖和凋亡實驗研究[J].新中醫，2016，48（3）：217-221.

[13]Goldstein LB.Acute ischemic stroke treatment in 2007[J].Circulation，2007，116（13）：1504-1514.

[14]Smith WS.Pathophysiology of focal cerebral ischemia：a therapeutic perspective[J].J Vasc Interv Radiol，2004，15（1 Pt 2）：S3-12.

[15]Muresanu DF，Buzoianu A，Florian SI，et al.Towards a roadmap in brain protection and recovery[J].J Cell Mol Med，2012，16（12）：2861-2871.

[16]Fisher M，Feuerstein G，Howells D W，et al.Update of the stroke therapy academic industry roundtable preclinical recommendations[J].Stroke，2009，40（6）：2244-2250.

[17]劉波.補陽還五湯結合川芎嗪對急性腦梗塞患者血液流變學的影響及療效探討[J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（81）：134-135.

[18]楊天賜.中藥黃芪的藥理作用及臨床應用效果臨床研究[J].當代醫學，2018，24（25）：103-105.

[19]楊廣訓.補陽還五湯治療缺血性中風氣虛血瘀型療效觀察[J].中醫藥臨床雜志，2018，30（9）：1703-1704.

[20]應鑫.加味補陽還五湯治療缺血性腦卒中后抑郁癥的臨床觀察[J].中國中醫藥現代遠程教育，2018，16（18）：86-87.

（2019-07-20收稿?責任編輯：楊覺雄）