不同濃度鹽存儲液對純鈦表面碳累積效應的影響

唐愷洺，邱 憬

種植義齒是一種比較理想的缺失牙修復方式，具有美觀舒適、不損傷鄰牙等優點，越來越多的缺牙患者將其作為首選治療方案。目前臨床常用的口腔種植系統均采用純鈦種植體。體內外研究表明，鈦的生物相容性與其表面特性密切相關，如表面形貌、親水性、表面能、電荷、化學組成等。這些特性在鈦種植體/骨界面發揮著關鍵作用，包括蛋白質吸附，成骨細胞的粘附、增殖、分化，硬組織形成等[1-3]。為此，國內外學者對鈦種植體的表面處理進行了大量研究，以提高其成骨活性，促進骨結合[4-6]。

鈦種植體在制作完成后，需經存儲、運輸、入庫環節再進入臨床應用。有研究發現，鈦表面經過不同處理后，其生物相容性隨時間延長出現衰退[7]，提示鈦表面活性存在老化現象。而該現象與保存過程中鈦表面的碳污染有關。Lu等[8]和Hayashi等[9]研究證實，暴露在空氣中的鈦表面會吸附空氣中的碳氫化合物，由此形成的碳累積可進一步抑制鈦表面的成骨細胞行為。目前，臨床應用的種植體成品通常保存在含空氣的無菌包裝瓶或包裝袋中，保存期最長可達5年之久。長久的空氣存儲，使得幾乎所有種植體均存在不同程度的碳污染與生物活性老化。

針對這一問題，國內外學者通過研究提出了諸多抗老化方法，如紫外線照射、化學緩沖劑浸泡、含活性離子的水溶液浸泡、惰性氣體存儲等[10-12]。其中，鹽存儲液最為方便、經濟，已開始逐漸進入臨床應用。然而，鹽存儲液抗種植體老化的內在機理，即對鈦表面碳污染的影響尚未見報道。因此，本實驗擬采用鹽存儲液作為存儲介質，通過掃描電鏡觀察、接觸角測試、X射線光電子能譜分析等方法，探究不同濃度鹽存儲液對純鈦表面碳累積效應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

純鈦片(99.5%，寶雞鈦業，中國)，SiC砂紙(天津南景，中國)，無水乙醇、氯化鈉(分析純，國藥，中國)，超聲清洗機(PS-20，DURADSONIC，中國)，掃描電子顯微鏡(1530VP，LEO，德國)，標準型光學接觸角儀(SL200B，科諾，美國)，X射線光電子能譜儀PHI 5000(VersaProbe, Ulvac-Phi，日本)。

1.2 鹽存儲液及試件制備

鹽存儲液的制備：定量稱取氯化鈉粉末，雙蒸水依次稀釋為0.45%、0.9%、10%的氯化鈉溶液。試件制備：選用直徑5 mm、厚1 mm規格的純鈦圓片，SiC砂紙(320目、600目、800目、1200目)逐級打磨拋光，雙蒸水、無水乙醇、雙蒸水中依次超聲清洗10 min，置于60 ℃烘箱中干燥后備用。將試件隨機分為五組，分別密閉保存于空氣、雙蒸水(ddH2O)、0.45% NaCl、0.9% NaCl、10% NaCl溶液中2周，其中，空氣組和雙蒸水(ddH2O)組為對照組，三種鹽存儲液組為實驗組。

1.3 鈦表面微形貌觀察

隨機選取五種介質中存儲14 d后的試件各1枚，超凈臺下自然晾干后，采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察試件的表面微形貌。

1.4 接觸角和表面能測定

檢測接觸角和表面能評價各組試件的表面親水性。隨機選取五種介質中存儲14 d后的試件各3枚，在超凈臺下自然晾干。隨后將2 μL蒸餾水滴在試件表面，采用標準型光學接觸角儀測量試件的接觸角及表面能，每枚試件隨機測量5個點，記錄平均值。

1.5 表面元素分析

采用X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)分析五種介質中存儲14 d后的試件表面元素組成和化學態。入射X線：Al靶，電壓15 kV，功率25 W，入射角45°。元素廣譜分析：160 eV，元素高像素窄譜分析：40 eV。解析元素結合能參考數據庫：National Institute of Standards and Technology XPS Online Database。根據峰面積和原子靈敏度因子進行表面元素含量和化學狀態分析。

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件對各組試件的接觸角和表面能檢測結果進行方差齊性檢驗，顯示數據方差齊，進行單因素方差分析和S-N-K多重比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 鈦表面微形貌

掃描電鏡觀察純鈦試件在五種介質中存儲14 d后的表面微形貌見圖1。各組試件表面均可見微小整齊的機械劃痕。空氣組和ddH2O組試件表面較為潔凈，后者偶見微量晶體吸附，而三種鹽存儲液組試件表面可見散在分布的氯化鈉晶體。該結果表明，鹽存儲液存儲14 d后，純鈦試件表面會吸附部分氯化鈉晶體，但試件的表面微形貌無明顯改變。

2.2 接觸角和表面能

五組純鈦試件的接觸角和表面能測量結果見圖2，3。對照組(空氣組和ddH2O組)之間無顯著差異。與對照組相比，鹽存儲液組的接觸角明顯減小，表面能亦隨之增大，提示鈦表面的親水性得到了更好的留存。此外，該結果顯示，鹽存儲液的濃度越高，鈦表面的親水性越好。10% NaCl組的表面能較0.45% NaCl組提高了約20 mN/m。

2.3 表面元素分析

五組純鈦試件表面元素的XPS分析結果見圖4，5。圖4-a的XPS廣譜分析顯示，各組試件表面均表達鈦(Ti)、氧(O)、碳(C)信號，元素的化學態無區別，但各元素峰值隨儲存介質的不同而變化。碳高像素譜(圖4b)及元素組成分析(圖5)顯示，空氣組試件表面的碳含量最高(43.97%)，而鈦含量(15.47%)和氧含量(36.80%)則最低，提示空氣存儲環境中，鈦表面對二氧化碳及碳氫化合物的吸附較多。相對于對照組，鹽存儲液組試件表面的碳含量顯著減少。10% NaCl組的碳含量降至最低的25.67%，同時鈦和氧含量顯著提高。該結果表明，純鈦試件在鹽存儲液中保存能有效減少碳累積，且鹽存儲液濃度越高，鈦表面的碳累積越少。

圖1 掃描電鏡觀察純鈦試件在空氣、雙蒸水(ddH2O)、0.45% NaCl、0.9% NaCl、10% NaCl溶液中存儲14 d后的表面形貌

*：a，b,c,d,e代表5組，標注字母表示與該組有統計學差異

圖2純鈦試件在五種介質中存儲14 d后的接觸角和表面能

Fig.2Contact angle and surface energy of pure titanium samples under five storage conditions after14days

圖3 純鈦試件在五種介質中存儲14 d后的接觸角圖像

3 討 論

種植體骨結合是種植義齒成功與否的關鍵。具有良好親水性的鈦種植體表面能為骨結合創造更有利的生物學基礎。親水性鈦表面能夠誘導血液迅速擴散，形成生物活性因子的整體包覆，進而通過調節吸附蛋白的結合強度、總量和構象影響成骨細胞的早期粘附、增殖和分化[13]。因此，國內外學者廣泛致力于鈦金屬的表面改性，期望通過不同的表面處理提高鈦表面的親水性，從而促進骨結合。Tallarico等[14]的臨床研究發現，親水性種植體相比傳統噴砂酸蝕處理的種植體更具優勢，可以有效緩解種植體周圍骨重建階段的ISQ值下降。得益于此，親水性種植體開始逐步取代傳統種植體。然而，Wael等[15]研究發現，隨著時間延長，鈦表面存在生物活性向生物惰性的老化過程，表現為親水向疏水轉變。Hayashi等[9]通過細胞實驗進一步證實，與新鮮制備的鈦表面相比，保存4周后鈦表面的蛋白吸附以及成骨細胞粘附、分化能力顯著降低。因此，如何有效保存鈦種植體活性以延緩其自然老化成了近年來的研究熱點。

Wennerber等[16]研究指出，保持生物材料表面活性的一種有效方法是減少大氣中的碳氫化合物污染。碳氫化合物污染，即碳累積現象，會改變鈦表面的元素組成和表面能，進而干擾蛋白質吸附和成骨細胞的粘附、增殖、分化，最終影響骨結合。近年來，有學者提出利用紫外線照射鈦表面，還原鈦表面的碳氫化合物，保持其表面活性[17]，但也有研究認為，隨著時間的推移和能量的自然釋放，由紫外線誘導的超親水性表面難以長期維持[18]。因而，有學者提出將紫外線處理的新鮮鈦表面置于ddH2O[19]或阿侖膦酸鹽[20]中保存，使鈦表面活性獲得有效存留。上述研究表明，液體存儲的抗老化作用較其他方式更為長久、有效。作為一種基礎溶液，鹽溶液是最經濟的存儲介質，在種植體存儲方面具有良好的應用前景。因此，闡明其抗老化的作用機理，探索其濃度與抗老化效應之間的量效關系，可為新型種植體存儲介質的研發提供重要參考依據。

圖4 純鈦試件在五種介質中存儲14 d后的XPS廣譜(a)和高像素譜(b)分析

圖5 純鈦試件在五種介質中存儲14 d后的表面元素組成

為探究鹽存儲液抗鈦表面老化的作用機理，我們選用三種不同濃度的氯化鈉存儲液，并以空氣和ddH2O為對照組。五種存儲條件保存純鈦試件14 d后，進行理化性質檢測。掃描電鏡觀察發現，空氣組和ddH2O組鈦表面相對潔凈，三種氯化鈉存儲液組的鈦表面可見散在分布、大小不一的氯化鈉晶體附著。五組試件表面均可見方向一致的機械劃痕，其微形貌無明顯區別，提示不同存儲條件不會改變光滑鈦表面的微形貌，該結果與Lu等[12]的研究結果一致。隨后我們測量了五組試件的接觸角，發現空氣組和ddH2O組無明顯差異，而三種鹽存儲液組的接觸角顯著減小。更加有趣的是，隨著鹽存儲液濃度的升高，接觸角逐漸遞減，提示鹽存儲液的濃度會影響鈦表面親水性的存留，五組試件表面能的測定進一步驗證了這一發現。為了闡明該現象的內在機理，我們對五組試件的表面元素進行了XPS分析。五組試件表面的主要元素一致，均為Ti、O、C。不同的是，三種鹽存儲液組的碳含量更少，而鈦和氧含量相對較多。在三種鹽存儲液中，隨著濃度的增加，碳含量依次減少。該結果與親水性測試相一致。以上結果說明，鹽存儲液通過減少鈦表面的碳累積，保存了其親水性，且濃度越高，這種抗老化效應越明顯。

新鮮制備的鈦表面在液體中帶正電荷[15]，按照電化學理論，當金屬電極與電解質溶液接觸時，在界面因素的作用下，電極和溶液相之間形成一個在結構和性質上與本體溶液不同的過渡相，形成界面雙電層。緊靠電極表面的內層為吸附的水分子偶極層和特性吸附離子(如氯離子等)，這些離子部分或全部去水化，外層為水化離子層，通過靜電作用吸附至表面。由Boltzman公式可知，電解質濃度越高，雙電層離子濃度越高[21]。基于此理論可知，低濃度氯化鈉存儲液中，界面雙電層的水化鈉離子密度較小，溶液中的碳氫化合物可以穿過雙電層吸附至鈦表面。當鹽存儲液濃度升高時，雙電層水化鈉離子密度增加，碳氫化合物難以穿過而被隔離在雙電層之外(圖6)，從而減少了鈦表面的碳累積，有效保留了親水性。

圖6 鹽存儲液濃度影響鈦表面碳累積效應的作用機理示意圖

綜上所述，我們發現鹽存儲液通過減少鈦表面的碳累積，有效保存了鈦表面的親水性，提出鹽存儲液的濃度會對鈦表面的碳累積效應產生影響，并對其內在機理進行了推理解釋。將種植體存儲在鹽溶液環境中具有抗老化的獨特優勢，但鹽存儲液的最優濃度仍需進一步結合生物相容性實驗予以確定。在此基礎上，新型種植體存儲液的溶劑、溶質種類及其濃度有待于深入而廣泛的探索。