柚皮苷對脂多糖誘導的人牙周膜成纖維細胞增殖及炎癥因子表達的影響

劉 景，袁 媛

牙周炎(periodontitis)是口腔常見的慢性炎癥性疾病，多由以革蘭陰性厭氧菌(如內毒素脂多糖)為主的病原微生物引起，以牙周組織破壞為基本特征，是成人缺失牙的主要原因之一[1-2]。有研究表明[3]，病原微生物對牙周組織的直接破壞作用有限，而破壞牙周組織的主要原因是由病原微生物激發的宿主免疫反應，影響牙周防御細胞增殖、分化，而牙周防御細胞在抵抗病原微生物的同時釋放可導致牙周組織破壞的炎癥因子，最終導致牙周組織損傷。

柚皮苷(naringin，NRG)是一種雙氫黃酮類化合物，是傳統中藥骨碎補、枳殼、枳實和化橘紅等的主要藥效成分，亦存在于葡萄柚、橘、橙等蕓香科植物的果皮和果肉中。有研究表明，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血脂、抗動脈粥樣硬化和調節血糖等多種生物活性和藥理作用[4-6]，且可促進成骨細胞增殖分化、調節骨誘導生長因子，促進骨損傷部位的骨質生長，從而增強牙周組織的成骨能力[7-8]。為了明確柚皮苷對牙周再生治療的作用機制，本研究從細胞水平研究柚皮苷對內毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導下人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblast，HPDLF)增殖及白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-1β表達的影響，為臨床應用柚皮苷防治牙周炎提供基礎性理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

HPDLF細胞株(上海拜力生物科技有限公司)，柚皮苷(含量：98.28%，批號：MUST-16041912，成都曼思特生物科技有限公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，批號：10099133，上海栩冉生物科技有限公司),DMEM培養基 (批號：12800017，上海江林生物科技有限公司)，噻唑藍(MTT，批號：146500700，美國Sigma 公司)，IL-6、IL-8、IL-1β ELISA試劑盒(美國R&D公司)，IL-6抗體、IL-8抗體、IL-1β抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標記二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo公司)，ECL發光液和硝酸纖維素膜(美國Millipoer公司)。

1.2 主要儀器

Roche Light Cycler 96實時熒光定量PCR儀(Roche公司)；SpectraMax iD5-多功能酶標儀(中國上海美谷分子儀器有限公司)；H1650臺式高速離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與處理 HPDLF培養于含10%FBS、1×105U/L青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于95%空氣+5% CO2、37℃的培養箱中培養。當HPDLF生長占培養瓶面積80%～90%時，常規傳代培養，選擇生長狀態良好的3～6代細胞進行實驗。

1.3.2 MTT法檢測細胞存活率 將生長良好的HPDLF培養至密度為90%左右，進行細胞計數，以4×103個/孔細胞密度接種于96孔細胞培養板中，實驗共分為5組，即空白對照(CON)組、脂多糖(LPS)組、脂多糖+柚皮苷高劑量(LPS+NRG 40 μg/mL)組、脂多糖+柚皮苷中劑量(LPS+NRG 20 μg/mL)組、脂多糖+柚皮苷低劑量(LPS+NRG 10 μg/mL)組。各組細胞置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞貼壁后更換無血清培養液繼續培養過夜后，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組分別加入相應劑量藥物，LPS組、CON組加入等量的無血清DMEM低糖培養液；0.5 h后，除CON組外，其余各組均加入LPS(終濃度100 μg/mL)，CON組加入等量的無血清DMEM低糖培養液代替，繼續培養24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃ 孵育4 h，小心吸棄培養液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min使形成的紫色甲瓚結晶完全溶解，用酶標儀于570 nm處測定各孔吸光度值(A)，計算各組細胞存活率。細胞存活率=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞周期 將生長良好的HPDLF培養至密度為90%左右，進行細胞計數，以4×103個/孔細胞密度接種于6孔細胞培養板中，細胞培養、處理及分組同1.3.2項。除CON組外，其余各組細胞最后經LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，1 000 r/min離心10 min，收集細胞。70%冰乙醇固定細胞，4 ℃過夜。用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期。

1.3.4 ELISA法檢測HPDLF培養液中炎癥因子的表達 將生長良好的HPDLF培養至密度為90%左右，進行細胞計數，以4×103個/孔細胞密度接種于6孔細胞培養板中，細胞培養、處理及分組同1.3.2項。除CON組外，其余各組細胞最后經LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，1 000 r/min離心10 min，取細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書進行操作，用酶標儀在490 nm處測樣品吸光度值，計算細胞培養上清液中IL-6、IL-8和 IL-1β的含量。

1.3.5 Western blot法檢測HPDLF中炎癥因子蛋白的表達 將生長良好的HPDLF培養至密度為90%左右，進行細胞計數，以4×103個/孔細胞密度接種于6孔細胞培養板中，細胞培養、處理及分組同1.3.2項。除CON組外，其余各組細胞最后經LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，收集細胞，以Western blot法檢測HPDLF中炎癥因子的表達。具體步驟：將收集的細胞用預冷PBS沖洗3次，加入RIPA裂解液提取細胞蛋白后，BCA法進行蛋白定量，加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(電壓60 V至指示劑進入分離膠，繼以120 V電泳至結束)，蛋白分離后采用濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上(4℃，電壓100 V，1 h)，5%脫脂奶粉4 ℃條件下封閉1 h，IL-6、IL-8、IL-1β和GAPDH一抗(1∶1 000)稀釋液室溫孵育過夜，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標記的二抗(1∶10 000)稀釋液室溫孵育1 h，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，將ECL試劑盒說中發光液均勻地滴在PVDF膜上，反應1 min，再將PVDF膜放入暗室壓片成像。結果用目的蛋白的灰度值與內參(GAPDH)的灰度值的比值表示，用Image J軟件分析成像結果，進行IL-6、IL-8和IL-1β蛋白定量。

1.3.6 Real-time PCR法檢測HPDLF中炎癥因子的表達 將生長良好的HPDLF培養至密度為90%左右，進行細胞計數，以4×103個/孔細胞密度接種于6孔細胞培養板中，細胞培養、處理及分組同1.3.2項。除CON組外，其余各組細胞最后經LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，收集細胞，Trizol法提取總RNA，去除DNA污染后，使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒處理，合成cDNA，按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明方法進行實時定量。PCR反應條件為：95 ℃(30 s)預變性后，95 ℃(5 s)→60 ℃(30 s)，40個循環；PCR引物序列為IL-6：Sense：5′-CAAATTCGGTACATCCTCG-3′，Antisense：5′-GCCTCTTTGCTGCTTTCA-3′；IL-8：Sense：5′-ACTCCAAACCTTTCCACC-3，Antisense：5′-CTTCTCCACAACCCTCTG-3′；IL-1β：Sense：5′-TGATGGCTTATTACAGTGGC-3′，Antisense：5′-TGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3′；GAPDH：Sense：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′；Antisense：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用2-ΔΔCt方法分析相關mRNA的表達量[9]。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 柚皮苷對脂多糖誘導的牙周膜成纖維細胞增殖的影響

與CON組比較，LPS組細胞存活率顯著降低(P<0.05)；40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL的柚皮苷均可不同程度抑制LPS誘導的HPDLF損傷，與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+ NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組細胞存活率均顯著提升(P<0.05)(圖1)。

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖1柚皮苷對脂多糖誘導的牙周膜成纖維細胞增殖的影響

Fig.1Effect of naringin on proliferation of periodontalligament fibroblasts induced by lipopolysaccharide

2.2 柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF細胞周期的影響

與CON組比較，LPS組HPDLF細胞周期進程減慢，S期、G2/M期細胞百分率顯著降低，但G0/G1期細胞百分率明顯增加；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF細胞周期進程減慢，S期和G2/M期細胞百分率均顯著增加，G0/G1期細胞百分率顯著降低，見圖2。

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖2柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF細胞周期的影響

Fig.2Effect of naringin on lipopolysaccharide-inducedcell cycle of HPDLF

2.3 柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF培養液中炎癥因子水平的影響

ELISA方法檢測結果顯示，與CON組比較，LPS組HPDLF培養液中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子含量顯著升高，組間差異具有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子含量顯著降低，組間差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF培養液中炎癥因子水平的影響

組別劑量/(μg/mL)IL-6/(pg/mL)IL-8/(pg/mL)IL-1β/(pg/mL)CON組—21.06±2.2424.08±2.4930.26±3.16LPS組—66.23±6.64?#70.25±7.06?#88.21±9.02?#LPS+NRG組4032.05±5.56?33.05±3.82?36.05±3.81?2030.25±3.05?32.21±3.41?34.08±3.52?1029.21±3.21?32.03±3.32?33.51±3.41?

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

2.4 柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF中炎癥因子蛋白表達的影響

Western blot方法檢測結果顯示，與CON組比較，LPS組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子蛋白表達顯著升高，組間差異具有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子蛋白表達水平顯著降低，組間差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.5 柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF中炎癥因子基因表達的影響

Real-time PCR方法檢測結果顯示，與CON組比較，LPS組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子mRNA表達顯著升高，組間差異具有統計學意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子mRNA表達水平顯著降低，組間差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖3柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF中炎癥因子蛋白表達的影響

Fig.3Effect of naringin on the expression of inflammatoryfactors in lipopolysaccharide-induced HPDLF

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖4柚皮苷對脂多糖誘導的HPDLF中炎癥因子基因表達的影響

Fig.4Effect of naringin on expression of inflammatory factor gene in lipopolysaccharide-induced HPDLF

3 討 論

HPDLF是一組具有多向分化潛能的異質性多能干細胞，作為牙周組織的主要細胞之一，其具有牙周組織再生能力，可分化形成牙骨質、牙周膜、牙槽骨[10-11]。在牙周組織再生過程中，如存在牙周炎癥微環境，可影響牙周炎患者HPDLF促進組織再生的過程[12]。因此，抑制炎癥因子的產生，可有效阻斷牙周炎癥對牙周組織的過度破壞。

LPS是革蘭陰性厭氧菌外膜主要成分，被公認為牙周病致病因子。有研究表明[13-15]，LPS可通過破壞牙齦結合上皮進入牙周組織，與HPDLF的磷脂相互結合，發揮細胞毒作用，破壞細胞膜結構，影響HPDLF生長、合成代謝，使細胞溶酶體酶大量釋放，激活緩激肽系統，并刺激巨噬細胞、單核細胞、成纖維細胞等分泌IL-6、TNF-α等多種炎癥細胞因子，而齦溝液中的炎癥細胞因子，可介導局部炎癥反應，從而參與牙周炎的發生和發展過程。Liu等[16]研究結果顯示，LPS可通過TLR4調節NF-κB信號通路及其與CD14的相互作用，激活宿主細胞HPDLF表達多種前炎癥細胞因子，從而始動牙周組織的破壞過程。基于上述研究成果，炎癥微環境是牙周炎患者牙周組織的主要微環境，亦是影響牙周組織再生的關鍵因素，如在藥物作用下克服牙周組織局部的炎癥環境，可有效促進牙周組織再生。本研究結果顯示，經LPS刺激后的HPDLF存活率顯著降低，細胞周期進程減慢，S期、G2/M期細胞百分率顯著降低，但G0/G1期細胞百分率明顯增加；而40 μg/mL、 20 μg/mL、10 μg/mL的柚皮苷均可不同程度抑制LPS誘導的HPDLF損傷，細胞存活率均顯著提升，細胞周期進程減慢，S期和G2/M期細胞百分率均顯著增加，G0/G1期細胞百分率顯著降低。

IL-1β、IL-8等炎癥細胞因子是來源于單核-巨噬細胞的多功能生物活性物質，因單核細胞是機體抵御病原生物感染的主要效應細胞，因此，IL-1β、IL-8等細胞因子水平高低決定單核細胞參與抗感染和炎癥反應的能力[17-18]。有研究表明[19]，炎癥損傷級聯反應中，炎癥組織細胞將釋放過量的IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥細胞因子入血，成為神經毒性因子，彼此之間相互作用，形成惡性循環，從而使組織損傷加重。其中，IL-1β屬于IL-1家族成員之一，是由單核-巨噬細胞分泌的細胞調節因子，由于其本身就是內源性的致熱源，可以自我激活表達，促使一些炎癥因子的活化及異常表達，從而刺激血管內皮細胞，使更多的粘附分子表達，啟動多種細胞因子產生級聯反應，致使白細胞聚集、浸潤，與牙周組織破壞密切相關。IL-8由單核-巨噬細胞分泌，中性粒細胞、多形核白細胞等多種細胞產生，其主要功能是趨化并活化嗜中性粒細胞、單核細胞等，參與炎癥反應和免疫應答過程。IL-8的異常分泌會造成局部組織的炎癥反應，在低氧、缺血等條件下可引導合成和釋放具有白細胞趨化活性的多源性細胞因子，引導中性粒細胞進入齦溝液，在中性粒細胞的選擇性補充和激活過程中有重要作用。IL-6屬促炎癥細胞因子，是由活化的成纖維細胞和T淋巴細胞產生的淋巴細胞因子，在正常健康的生理狀態下，IL-6生理性存在于齦溝內，在血液及組織中的含量比較低，但是在炎癥反應過程中大量表達使其濃度升高，可協同集落刺激因子，促進原始骨髓細胞分化和增殖。所以 IL-6的含量可以作為炎癥反應程度的指標，IL-6在血液及組織細胞中的水平越高則表示炎癥反應程度越重，一定程度上反應了牙周炎的嚴重程度[13]。另有研究表明，IL-6可以誘導免疫反應過程中的T淋巴細胞和巨噬細胞分泌，在成骨細胞的形成過程中IL-6大量表達[20]。本研究結果表明，經LPS刺激后的HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白表達顯著升高，而經不同濃度(40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL)的柚皮苷預處理后，HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白表達水平顯著降低，提示柚皮苷可通過調節HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β分泌及其相互級聯作用，降低牙周組織炎癥反應，拮抗LPS作用。

本研究結果表明，NRG對LPS誘導的HPDLF損傷具有保護作用，并可通過抑制LPS誘導的HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白及基因表達水平，促進HPDLF增殖，即柚皮苷可通過拮抗LPS對HPDLF增殖的抑制作用，減弱LPS對HPDLF及牙周組織破壞程度。以上研究結果為開發以柚皮苷為藥效成分治療牙周病提供了基礎理論依據。但上述作用機制可能僅僅是一方面，有關柚皮苷對LPS誘導的HPDLF增殖作用的具體機制，尚需進一步研究探討。