脂聯素受體在人牙齦成纖維細胞中的表達研究

王麗美，支 敏，呂沛穎，高鵬飛，藺 晨，楊艷艷，王永蘭

牙周炎是以菌斑微生物為始動因子的感染性疾病。大量流行病學研究表明,牙周疾病與肥胖(特別是腹型肥胖)密切相關[1-3]。脂聯素(Adiponectin, APN)是脂肪組織產生的生物活性分子，作為一種負性調節因子，它可促進脂肪酸的氧化、增加胰島素敏感性、抗炎等[4-5]。脂聯素表達水平在肥胖與牙周炎患者中均下降[6-7]。脂聯素與其受體結合發揮生理作用，目前發現脂聯素受體中發揮作用的主要為兩種：脂聯素受體1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂聯素受體2(adiponectin receptor 2,AdipoR2)[8]。脂聯素在與受體結合后，激活其位于膜內的N端，使其和APPL1接頭蛋白相連接，激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)和氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)-α配體，參與葡萄糖、脂肪代謝調節,發揮抗炎、抗糖尿病等作用[9-10]，因此在靶組織中AdipoR1和AdipoR2表達量的改變均有可能直接影響脂聯素的作用效能。

對肥胖相關疾病的研究[1]表明:肥胖不僅可以降低血清脂聯素水平，還可以降低靶器官AdipoR1和AdipoR2水平，使其對脂聯素的敏感性下降，形成 “脂聯素抵抗”，進一步產生胰島素抵抗[11]。然而對于牙周組織而言，牙周炎癥環境對脂聯素受體表達的影響至今仍存在爭議。Nokhbehsaim等[12]認為在人牙周膜細胞中P.gLPS促進了脂聯素受體的表達，而Yamaguchi等[13]則認為牙周炎癥狀態會下調人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts,HGFs)脂聯素受體的表達。脂聯素受體的表達水平與牙周炎的關系存在爭議，有必要進一步研究,從而為闡釋肥胖與牙周炎相關性的內在機制提供依據。本研究通過腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.g)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、APN刺激HGFs并測定其脂聯素受體表達的情況來探討脂聯素受體表達與牙周炎癥的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 HGFs的培養及分組 選取自2017年3月—2017年5月在天津醫科大學口腔醫院頜面外科就診的需要拔除埋伏阻生智齒患者，共5位(年齡18～24歲，平均22歲)。排除患有全身系統性疾病如糖尿病、心血管病等，妊娠，吸煙，近3個月內使用抗生素史者，患者知情同意(經天津醫科大學倫理審查委員會審查同意)。

術中收集新鮮且色形質正常、無明顯炎癥的牙齦組織,運用組織塊培養法培養原代HGFs并進行傳代，當細胞傳至4～6代時將細胞接至12孔板進行實驗，隨機分為4組，每組4孔：空白對照組(10%FBS培養基)；TNF-α刺激組(50 ng/mL TNF-α+10% FBS培養基刺激)；P.gLPS刺激組(0.1 μg/mLP.gLPS+10% FBS培養基刺激)；APN刺激組(1 μg/mL APN+10% FBS培養基刺激)。

1.1.2 主要試劑及儀器 RT-PCR試劑盒(sigma公司，美國)；引物(生物公司，上海)；P.gLPS(InvivoGen公司，美國)；TNF-α (Peprotech公司,英國)；APN(Peprotech公司,英國 )。

1.2 方法

1.2.1 HGFs的培養與鑒定 運用組織塊培養法培養原代HGFs并進行傳代,通過顯微鏡下形態學觀察與細胞免疫細胞化學法-SP法鑒定所培養的細胞為中胚層來源的人牙齦成纖維細胞,且不含上皮細胞。

1.2.2 RT-PCR檢測 Trizol提取人牙齦成纖維細胞總RNA, superRTcDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,引物序列:AdipoR1(169 bp) ：(5′-CGAGAGGGCCTAGGATTGGA-3′)和(5′-CTGATGGTAGACAAGCCGGG-3′), AdipoR2 (213 bp)：(5′-AGACACGCGGATCAACTCAC-3′)和(5′-TGCACCCCAATCGGTT-TTCT-3′)，β-actin：(268 bp)(5′-CCATCCTGGCCT-CGCTGT-3′) 和(5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′),95 ℃預變性約5 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃終延伸10 min，電泳，凝膠成像儀拍照，目的基因與β-actin灰度積分比值表示基因表達水平。

1.2.3 TNF-α或P.gLPS或APN刺激HGFs 取5代HGFs(1×105個/孔)均勻鋪在12孔板上，于37 ℃，5%的CO2溫箱內孵育2 d使細胞貼壁融合至80%時。根據組別在12孔板內每孔依次加入50 ng/mL TNF-α 2 mL，0.1 μg/mLP.gLPS 2 mL，1 μg/mL APN 2 mL，空白對照(10%FBS培養基)2 mL,每組均設置3個復孔，于37 ℃，5% CO2溫箱孵育1 d，將培養液丟棄，提取培養0、0.5、12、24 h的HGFs的總mRNA。

1.2.4 real-time PCR檢測 用real-time PCR檢測各組HGFs中AdipoR1和AdipoR2的表達，以β-actin作為內參，2-△△ct法處理數據，與對照組進行比較。

1.3 統計學方法

用IBM SPSS Statistics 23.0統計軟件對實驗所得數據進行數據分析，結果均采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素ANOVA方差分析(完全隨機設計)，以P<0.05認為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 HGFs的培養與鑒定

組織塊培養法培養HGFs，3 d后可見組織邊緣隱約有成纖維細胞樣細胞游出,細胞極性較強，排列呈漩渦狀(圖1A)。當細胞匯合至80%～90%時，進行首次傳代，隨培養時間和代數增加，細胞形態單一呈長梭型(圖1B)。免疫組化結果顯示細胞抗波形蛋白染色陽性(圖2A)，抗角蛋白染色陰性(圖2B)，證實所培養的細胞為中胚層來源，并未混雜任何上皮源性細胞。

A:原代HGFs第3天細胞從組織周圍爬出；B:第4代HGFs

圖1細胞形態學觀察(×100)

Fig.1Morphological observation (×100)

A: 細胞抗波形蛋白染色陽性;B:細胞抗角蛋白染色陰性

圖2HGFs組織來源的鑒定(免疫組織化學SP法)

Fig.2Identification of source of HGFs(Immunohistochemistry SP)

2.2 RT-PCR檢測結果

如圖3所示，健康HGFs中有AdipoR1、AdipoR2的表達，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物顯示目的基因片段與預期一致，且AdipoR2的條帶亮度更高。

圖3 RT-PCR檢測健康HGFs AdipoR1、AdipoR2的表達

2.3 real-time PCR檢測結果

與空白對照組相比，各時間點TNF-α均明顯下調HGFs的AdipoR2 mRNA的表達，上調HGFs的AdipoR1的 mRNA的表達，且有統計學差異(P<0.05)，圖4A。與空白對照組相比，在培養0.5、12 h時P.gLPS上調HGFs的AdipoR1和AdipoR2的表達，且有統計學差異(P<0.05)，在24 h時，與空白對照組相比，P.gLPS上調HGFs的AdipoR2表達，但無統計學差異(P>0.05)，圖4B。與空白對照組相比，在0.5、12、24 h時，APN均顯著上調了HGFs的AdipoR1和AdipoR2的表達，且有統計學差異(P<0.05)，圖4C。

各組AdipoR1、AdipoR2 mRNA水平是與空白對照組數值比較的相對率，*:AdipoR1基因水平和對照組相比,P<0.05,**:AdipoR2基因水平和對照組相比,P<0.05

A: 50 ng/mL TNF-α刺激；B: 0.1 μg/mLP.gLPS刺激；C: 1 μg/mL APN刺激

圖4不同因子對HGFs脂聯素受體AdipoR1、AdipoR2 mRNA表達的影響

Fig.4Effects of different factors on the expression of adiponectin receptor genes (AdipoR1and AdipoR2) in HGFs

3 討 論

2003年，Yamauchi等[14]首先從細胞內克隆出兩個脂聯素特異性受體亞型，將其命名為AdipoR1/R2。國內外關于脂聯素受體在牙周組織的表達研究不完全相同[13，15]。本實驗證實人牙齦成纖維細胞只表達兩種脂聯素受體，這與文獻[16]的結論一致。同時本研究表明AdipoR2條帶較AdipoR1更亮，在人牙齦成纖維細胞中，脂聯素受體表達可能以AdipoR2為主，這與Yamaguchi等[13]關于小鼠牙齦組織脂聯素受體的表達研究結果一致，進一步探討需要siRNA實驗和蛋白實驗證實。

在炎癥狀態的牙齦組織中，TNF-α作為一個多向性感染細胞因子發揮著及其重要的作用。在牙周炎患者的齦溝液和牙齦組織中，TNF-α含量明顯增高[17]。本實驗所用TNF-α因子濃度和刺激時間基于Yamaguchi等的研究[13]，且在前期預實驗中人重組TNF-α(50 ng/mL)被證實可明顯抑制HGFs脂聯素受體表達。循環脂聯素水平與血清TNF-a水平負相關[18]，具體機制不明確，可能是由于TNF-α可抑制PPAR-a通路[19]和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)活化通路[20]。TNF-α有兩個不同受體，TNF受體-1(TNF receptor-1,TNFR1)和TNF受體-2(TNF receptor-2,TNFR2)。目前主要觀點認為，TNFR1介導了核因子(nuclear factor-κB,NF-κB)信號通路的激活和成骨分化的抑制[21]，也有研究表明TNFR1誘導的信號通路可以破壞胰島素作用[22]。我們發現培養0.5、12、24 h時TNF-α明顯下調AdipoR2 mRNA的表達，上調AdipoR1 mRNA表達。這與Yamaguchi等[13]的研究不同，其結果表明：高濃度TNF-α在0.5 h和1 h明顯抑制AdipoR1的表達,對AdipoR2的表達無影響。AdipoR1在與APN結合后主要激活下游AMP及肝臟激酶B1(liver kinase B1,LKB1)分子，激活AMPK通路，促進脂肪酸氧化與葡萄糖攝入[23]；而AdipoR2在與APN結合后主要激活下游PPARs(包括如PPAR-α和PPAR-γ配體)，激活PPAR信號通路，促進脂肪酸氧化[24]。AMPK及PPARs等信號通路的激活在一定程度上可以拮抗NF-κB信號通路[25]，促進巨噬細胞向M2型(抗炎型)極化[26]從而抑制炎癥反應。有研究證實脂聯素可能主要通過AdipoR2調節胰島素敏感性和發揮抗炎作用[27]，且本研究表明在HGFs中脂聯素受體表達以AdipoR2為主,因此TNF-α下調AdipoR2 mRNA的表達可能是TNF-α降低脂聯素敏感性和發揮促炎作用的重要原因，而TNF-a對牙周組織AdipoR1表達的影響尚需更多研究來證實和解釋。

P.gLPS作為重要毒力因子常被用于體外構建牙周炎模型[28]。本研究表明：P.gLPS促進HGFs表達AdipoR1和AdipoR2,這與Nokhbehsaim等關于人牙周膜細胞的體外實驗[12]結論一致:在1 d時，P.g顯著增加了脂聯素受體AdipoR1的mRNA表達,在1 d和3 d上調脂聯素受體AdipoR2的表達,但無統計學差異。Yamaguchi等[13]則認為P.gLPS并不會影響到牙齦成纖維細胞中脂聯素受體表達水平。目前各研究結果存在爭議，需更多實驗證實P.gLPS誘導的信號通路在HGFs脂聯素受體表達中的作用。

有研究在對牙周炎患者的血清及牙齦組織活檢中，發現其脂聯素濃度下降[29]。那么脂聯素濃度的降低是否會影響脂聯素受體的表達？本實驗所用APN濃度為1 μg/mL(在正常齦溝液脂聯素濃度范圍內[6])，同時本研究表明，脂聯素在該濃度作用下相較于空白對照組明顯上調AdipoR1和AdipoR2 mRNA表達，這提示我們脂聯素在一定程度上可對其自身受體正向調節。在牙周炎患者中，脂聯素的表達水平下降[29]，有可能引起脂聯素受體AdipoR1/2的mRNA表達下降，使脂聯素作用效能在一定程度上降低，產生脂聯素抵抗。這一結果與Nokhbehsaim等的研究[12]并不一致，他們的結果表明，脂聯素在第1天時下調了兩個脂聯素受體的表達，截至目前實驗結果仍然存在爭議，脂聯素對自身受體的調控仍然需要進一步研究。

牙周炎的發生和發展極其復雜，由一復雜的菌斑生物微環境來調控，其它細菌致病成分或者炎癥因子，如白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等是否會影響脂聯素受體的表達值得進一步研究。在牙周炎癥狀態下，脂聯素受體表達下降，及時輔助APN受體激動劑等局部藥物治療對于控制炎癥、防止病情加重有一定意義[30-31]。此外，脂聯素受體研究可以進一步了解脂聯素的作用及牙周炎、肥胖的分子機制，從而為設計以AdipoR1和AdipoR2受體激動劑作為靶點藥物輔助應用于肥胖伴牙周炎患者治療提供基礎。最近已有研究表明，脂聯素受體激動劑AdipoRon (APR)在肥胖相關糖尿病動物模型中不但可以降低血糖含量，還可以顯著降低炎癥牙齦中CC趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2,CCL2)和IL-6的含量，同時降低破骨細胞數量進而改善牙周狀況[31]，證實APR可作為肥胖相關性糖尿病合并牙周炎患者的多效靶向藥物，為這類患者的有效治療帶來福音。