母親齲易感性與嬰兒口腔微生物多樣性關系的縱向探究

吳祎培，張 羽，陳 曦，馮希平

齲病是造成嬰幼兒牙齒疼痛及牙齒缺失的主要原因之一。由于兒童生長發育和牙齒生理與解剖的特點，致使兒童齲病與成人相比病損波及范圍更廣泛，進展更迅速，危害更大。2017年第四次全國口腔健康流行病學調查結果顯示，中國5歲兒童的患齲率為70.9%，與10年前相比呈上升趨勢[1]。

微生物因素被普遍認為是齲病的發生發展中一個重要因素[2]。齲病發生后，口腔內的部分細菌對不斷變化的環境有更強的適應能力，從而成為優勢菌群[3-4]，同時唾液組成的變化也影響著口腔微生物群的平衡失穩[5-6]。本次研究基于MiSeq測序平臺構建口腔微生物的16s rRNA基因文庫進行高通量測序，旨在對不同齲易感性母親的嬰兒在不同時期的唾液微生物組群多樣性特征進行系統發生學表征和比較，觀察微生物多樣性的差異及變化，進一步認識微生物多樣性與嬰幼兒齲病之間的關系，為預測低齡兒童齲提供一定的依據，也為早期兒童齲病的預防與預測提供健康指導。

1 資料與方法

1.1 研究對象的選擇

對2016年8月份至2017年11月份在上海市浦東新區惠南鎮社區衛生服務中心兒童保健科建卡妊娠期女性篩查隨訪。納入嬰兒及其母親共10對，根據嬰兒1個月月齡(1月齡)時對母親的齲病臨床檢查結果分為母親有齲組(7對)與母親無齲組(3對)，其中男性嬰兒6例，女性4例。納入標準：母親及嬰兒無系統性疾病以及先天性疾病；母親口腔除齲病外無其他疾病；嬰兒為足月生產兒；嬰兒及母親1月齡至6個月齡(6月齡)隨訪前兩周內未使用抗生素；嬰兒出生后未接受任何口腔治療。上海交通大學醫學院附屬第九人民院倫理委員會批準通過該研究(倫理批號：2015-135)，自愿參與該研究的嬰兒母親均簽署知情同意書。

1.2 口腔臨床檢查與唾液樣本的收集

母親的口腔臨床檢查主要包括恒牙牙冠狀況、可視菌斑、牙齦探診出血、牙周袋深度及附著喪失。口腔臨床檢查由一名經培訓的檢查者完成。在調查實施前，按照WHO《口腔健康調查基本方法》第5版[7]中的齲病標準和釉質發育缺陷標準，由參考檢查者對檢查者進行齲病和牙周檢查標準的培訓。

所有受試者要求取樣前1小時禁止進食及飲水，嬰兒唾液樣本的收集使用無菌棉簽提取嬰兒口內的唾液，4～5根完全浸濕的棉簽，保存至提前準備好的滅菌后的5 mL離心管中。所取唾液樣品立刻置于干冰內，確保3 h內轉移至實驗室，-80 ℃冰箱凍存備用。兩組受試者于1月齡時及該嬰兒6月齡隨訪時分別收集唾液樣本。

1.3 微生物多樣性分析

所有樣本經過總基因組DNA樣本制備及PCR擴增構建測序文庫，MiSeq測序平臺測序并對數據質控過濾校正得到優化數據。在97%的序列相似水平下進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)的聚類劃分并完成生物信息統計，獲得樣本在不同的分類學水平下群落組成信息。

1.4 測序結果分析

采用Alpha多樣性分析(Shannon指數)反映嬰兒在1月齡至6月齡時口腔內物種群落豐度和多樣性豐富的變化。通過Venn圖表現各組樣本中的物種OTU數目組成相似性及重疊情況。通過Beta多樣性分析 (主成分分析，principal component analysis，PCA)分析了解樣本間物種組成的相似程度。

1.5 統計學方法

采用 SPSS 軟件(version23.0，IBM,美國) 比較兩組口腔臨床檢查數據的差異，計量資料采用獨立t檢驗，計數資料采用 Fisher’s 精確檢驗，所有統計分析均為雙側檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床檢查結果

對無齲組與有齲組母親進行的口腔臨床檢查結果如表1所示，無齲組與有齲組母親在齲失補指數與齲失補牙面數存在顯著性差異。而無齲組與有齲組母親的牙齦指數與牙周探診深度均無明顯差異。

表1 無齲組與有齲組母親口腔臨床檢查情況比較

2.2 OTU分布分析

以Venn圖統計多組樣本中OTU的數目及分布情況(圖1)。有齲組OTU的數目總體高于無齲組。由下圖可看出無齲組1月齡、無齲組6月齡、有齲組1月齡、有齲組6月齡4組嬰兒OTUs(OTU的種類)分別有106、142、609、392種，其中無齲組1月齡至6月齡共有種類為64種，有齲組1月齡至6月齡共有種類為322種，1月齡時無齲組與有齲組之間共有種類為89種，6月齡時無齲組與有齲組之間共有種類為123種。

2.3 Alpha多樣性分析

為反映不同樣本中微生物群落的多樣性，我們通過Shannon指數分析得到各樣本Alpha多樣性柱狀圖，無齲組在1月齡至6月齡期間口腔內微生物多樣性均有了不同程度的增長，有齲組雖然組內同月齡下口腔內微生物多樣性有所差異，但在1月齡至6月齡期間口腔微生物的多樣性均有增加。1月齡時有齲組嬰兒口腔內微生物多樣性總體高于無齲組，6月齡時有齲組嬰兒口腔內微生物多樣性總體也高于無齲組。

negative1代表1月齡無齲組，positive1代表1月齡有齲組，negative6代表6月齡無齲組，positive6代表6月齡有齲組

A：無齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Venn圖；B：有齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Venn圖；C：1月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Venn圖；D：6月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Venn圖

圖14組受試者OUT分布Venn圖

Fig.1Venn plot of OUT distribution of subjects of four groups

negative1代表1月齡無齲組；positive1代表1月齡有齲組；negative6代表6月齡無齲組；positive6代表6月齡有齲組

A：無齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖；B：有齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖；C：1月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖；D：6月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液Alpha多樣性柱狀圖

圖2各組受試者Alpha多樣性(Shannon指數)

Fig.2Comparison of Shannon microbial diversity index in each group

2.4 Beta多樣性分析及比較

OTU水平下比較各組的Beta多樣性可見，無齲組各個樣本1月齡時較聚集，6月齡時較分散，無齲組在1月齡至6月齡時組內物種組成有較大差異(圖3A)；有齲組在1月齡與6月齡時在圖中的點均較分散，可見有齲組各樣本間在不同時期物種組成組內均差異較大，且這種差異從1月齡時就開始體現(圖3B)；1月齡有齲組與1月齡無齲組各樣本反映在圖中的點多數聚集在同一區域，此時多數樣本的微生物物種組成較為相似(圖3C)；而至6月齡時，無齲組與有齲組各樣本不同組別間的物種組成已經開始發生了變化(圖3D)。

negative1代表1月齡無齲組；positive1代表1月齡有齲組；negative6代表6月齡無齲組；positive6代表6月齡有齲組

A：無齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液PCA分析;B：有齲組1月齡與6月齡嬰兒唾液PCA分析;C：1月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液PCA分析;D：6月齡有齲組與無齲組嬰兒唾液PCA分析

圖3受試者PCA分析

Fig.3Principal component analysis of the genus information

本研究由于無齲組與有齲組之間人數不等，故可通過PLS-DA進行比較分析，進一步了解兩組間微生物的物種構成與物種的相似性。通過PLS-DA在OTU水平下的分析可得到圖4，圖中每個點即代表一個樣本，如樣本物種組成越相似，點與點反映在PCA圖中的距離越近。圖中可看出無齲組1個月與無齲組6個月部分樣本在圖中所反映的點較密集，即組內各樣本間物種組成較相似，有齲組1個月與有齲組6個月在圖中所反映的點較分散，組內各樣本間物種組成差異較大。

3 討 論

當前，低齡兒童患齲率居高不下。在齲病的病因學說中，“生態菌斑假說”這一理論得到了越來越多的學者們的認同[8-9]，細菌是齲病發生發展過程中的關鍵因素[10 ]，迄今為止還沒有一種有效的方法可以提前預見或控制該疾病的發生發展。本研究分別通過對1月齡與6月齡時嬰兒唾液中的微生物多樣性分析，縱向觀察嬰兒期口腔內微生物的群落結構及微生物豐度，為了解低齡兒童齲(early chil-dhood caries，ECC)的病因和發病機制提供了更廣泛的視角，為低齡兒童齲口腔菌群多樣性變化的縱向研究提供相關信息，為兒童齲病風險評估和預測提供理論依據。

positive1代表有齲組1月齡；positive6代表有齲組6月齡；negative1代表1月齡無齲組；negative6代表6月齡無齲組

圖4PLS-DA分析圖

Fig.4Partial least squares discriminant analysis

在相似水平為97%的OTU水平下，無齲組1月齡、有齲組1月齡的OTUs分別為106與609種，而在無齲組6月齡與有齲組6月齡中OTUs為142與392種，同月齡時相比較有齲組OTU的數目總體高于無齲組。Alpha多樣性分析中發現有齲組與無齲組在1～6個月的過程中各組的物種豐度均有了不同程度的增長。有多項研究表明，患有ECC的兒童與無齲兒童相比，口內生物多樣性存在著顯著的差異[10-11]，無齲兒童口腔中微生物多樣性明顯高于ECC兒童，ECC組在齲發生前微生物多樣性呈明顯下降趨勢[12-14]。Tao等對于患有ECC的嬰兒口腔微生物多樣性的縱向研究中，32個月時有齲組微生物的物種豐度顯著低于無齲組。這可能是由于在兒童生命的早期階段，口腔內物種多樣性呈一個上升趨勢[15-16]，牙齒萌出后，在唾液的影響下，優勢菌群的數量逐漸增加[17-19]，致齲細菌在牙齒表面定殖并形成口腔生物膜的一部分，他們可能會隨著時間的推移變得相對穩定從而影響其他微生物的物種豐度，進而導致微生物多樣性的下降[20-21]。

為了比較樣本間微生物組成結構與群落之間的差異，我們通過PCA分析了解樣本間物種組成的相似程度。OTU水平下的PCA分析顯示無齲組在1月齡時樣本間物種組成并無顯著性差異，但在1月齡至6月齡的過程中物種組成有差異性變化；而有齲組1月齡與6月齡各樣本間物種組成差異較大，且這種差異從1月齡時就開始體現。這表明無齲組相較于有齲組在物種組成及群落結構方面更穩定。

本研究同樣也存在不足與一定的局限性。如樣本量較少導致研究結果可能存在偏倚，對口腔內微生物多樣性的變化不能做到全面、辯證的認識；此外，此次研究沒有對影響齲病發生發展的變異鏈球菌等進行針對性檢測。本研究結果作為縱向研究的一部分，后續也將繼續對更高月齡的嬰兒唾液樣本中微生物群落構成與豐度隨訪及分析，而對于重要致齲菌-變異鏈球菌的檢測及觀察其變化等將在后續研究中涉及。