人參多糖對腦出血模型大鼠的干預效果及對海馬區細胞凋亡的影響

鄭希院,翟潔敏，李會琪，趙龍斌，高章代

腦出血是非外傷性腦組織內血管破裂引起的出血，是一種常見疾病、多發疾病，發病率與病死率呈上升趨勢，屬于急性腦血管病中的危重類型，嚴重危害人類的身體健康[1]。 患者在腦出血時，不但會出現血腫性病變，還會繼發腦水腫、缺血、炎性反應、血腫周圍組織能量代謝紊亂等一系列腦損傷[2]。腦出血患者發病年齡逐漸年輕化，即使幸存者亦會遺留不同程度的神經功能障礙，對患者的生活質量造成了嚴重影響，帶來了沉重的經濟負擔[3]。腦出血造成的腦損傷，主要由血腫擴大導致的機械性壓迫所致周圍組織缺血及在血塊形成過程中和形成后導致[4]。現觀察人參多糖對腦出血模型大鼠的干預效果及對海馬區細胞凋亡的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物：健康雄性SD大鼠50只，月齡6～10(8.8±0.7)月，體質量340～480(360.0±58.6)g，由北京科奧力飼料有限公司提供[合格證號：京動(2000)第015號]。大鼠均生活于(24.0±2.1)℃的環境、無病原菌的飼養籠中，予高溫及高壓消毒的食物和水喂養。(2)試劑：人參多糖(陜西斯諾特生物科技有限公司)，水合氯醛[生工生物工程(上海)股份有限公司]，酶聯免疫試劑盒(北京維德維康生物技術有限公司)，TBARS試劑盒(江蘇江萊生物科技有限公司)。(3)儀器：光鏡(美國Ted Pella)；冰箱(Eppendorf艾本德中國有限公司，型號 ep000000)；電子天平(北京金達陽光科技有限公司，型號 CP153)；恒溫干燥箱(東菀市譜標實驗器材科技有限公司，型號 SPCC)；SuperMaze Morris水迷宮實驗裝置(上海欣軟信息科技有限公司，型號 XR-XM101)；BD FAC SCanto Ⅱ流式細胞儀(北京德利卡生物科技有限公司，型號 DLK0002051)。

1.2 實驗方法 2019年5—7月于西安醫學院第二附屬醫院神經內科實驗室進行實驗。

1.2.1 人參多糖提取物制作： 人參50 g加入蒸餾水100 ml中，冷浸過夜后，加熱煮沸30 min,留取清亮液體小火加熱濃縮到10 ml，制成含生藥2 g/ml的藥液，陰涼后以濾紙過濾藥液，再用一次性針頭濾器過濾后，分裝于安瓿滅菌后放入冰箱備用。

1.2.2 大鼠腦出血模型建立：隨機選取大鼠10只作為正常組， 余大鼠40只使用Rosenberg法制作腦出血模型[5]，以10%水合氯醛400 mg/kg于大鼠腹部注射麻醉，固定在立體儀上，在頭部正中進行縱行切口，剝離骨膜，使冠狀縫和前囟裸露；在前囟前中線右側2.0～3.0 mm處鉆直徑>1.0 mm小孔。使用微量注射器抽取股動脈50 μl血液，在鉆孔處垂直進針6.0 mm左右，注入10 μl血液，2 min后以10 μl/min的速度將剩余的40 μl血液注入，留針10 min后，將針退出，并用消毒針將切口縫合，完成建模。大鼠腦橫斷面中出現明顯血腫，血液無針道反流情況，無蛛網膜下腔出血，無血腫破入腦室視為造模成功。

1.2.3 分組及用藥：將建模成功的大鼠40只以隨機數字表法分為模型組及人參多糖低劑量組、中劑量組、高劑量組，各10只。人參多糖低劑量組給予2 mg/kg人參多糖，中劑量組4 mg/kg，高劑量組8 mg/kg，均灌胃3周。正常組及模型組大鼠均給予同等體積的無菌生理鹽水灌胃。治療期間所有大鼠均自由飲食。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 大鼠腦出血組織觀察： 大鼠在最后1次給藥后4 h進行麻醉斷頭處理，取腦組織放置于4℃冰箱固定48 h，石蠟包埋切片、常規脫蠟、乙醇浸水，HE染色，光鏡下常規組織學檢查。

1.3.2 腦含水量、神經缺損評分及學習記憶能力評分測定：(1)腦組織含水量：使用干濕質量法檢測，用精確度0.1 mg的電子天平分別測量5組大鼠的腦組織濕重，放在100℃的恒溫干燥箱烘24 h至腦組織不再減輕為止，然后測量烘培后大鼠腦組織質量。腦組織含水量=(腦組織濕質量-腦組織干質量)/腦組織濕重×100%。(2)神經功能評分：使用Longa評分法[6]，分為0～4級即為0～4分，無體征為0級，記0分；大鼠不能完全伸直前肢為1級，記1分；大鼠一側肢體癱瘓，有追尾現象為2級，記2分；大鼠不能打滾或者站立為3級，記3分；無自發性活動，有意識障礙為4級，記4分。分值越高說明大鼠神經功能損傷越嚴重。(3)學習記憶能力評分：參照彭璇等[7]介紹的方法采用Morris水迷宮實驗裝置進行動態圖像采集，分析大鼠學習記憶能力評分。大鼠在Morris水迷宮中訓練5 d后，在第6天記錄時間均值作為最終測定效果。

1.3.3 大鼠海馬區細胞凋亡率檢測： 使用流式細胞儀檢測細胞凋亡，以37 ℃、5% CO2環境中進行培養傳代至5孔板中的細胞，加入0.25%胰蛋白酶進行消化，使用2 000 r/min的離心機處理海馬區細胞5 min后使用PBS緩沖液清洗2次，在避光常溫環境中收取離心的海馬區細胞，加入PI染液1 ml，放置1 h，然后用特異熒光標記后，使用鞘液包裹，在高速流動條件下，嚴格按照流式細胞儀操作說明檢測細胞凋亡率。

涂料生產過程中VOCs的產生量取決于溶劑種類、生產設備和生產工藝等。一般而言，涂料生產過程中低沸點溶劑的用量越多，涂料生產過程為開放式、生產溫度較高、生產時間越長，并且因生產自動化程度低而需要頻繁清洗設備，那么VOCs的產生量就越多。

1.3.4 腦勻漿TNF-α、MDA含量檢測： 取大鼠血腫周圍的新鮮腦組織200 mg加入PBS緩沖液，離心處理15 min后棄去清液，待測。使用酶聯免疫吸附實驗法檢測TNF-α濃度，嚴格按照酶聯免疫試劑盒說明書操作。將采集后的腦組織勻漿使用硫代巴比妥酸法檢測MDA含量，嚴格按照TBARS試劑盒說明書進行操作。

1.3.5 大鼠海馬區相關蛋白Bcl-2、Akt、PI3K表達檢測： 采用Western-blot法檢測各組大鼠海馬組織中Bcl-2、Akt、PI3K表達量，以GAPDH作為內參蛋白。

2 結 果

2.1 5組大鼠腦出血組織觀察比較 與正常組比較，模型組出現腦出血組織細胞間隙增大，神經細胞固縮，膠質細胞增生等變化。與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組腦組織的神經細胞和膠質細胞腫脹、間質水腫和炎性細胞浸潤等均減輕。與低劑量組、中劑量組比較，高劑量組腦組織排列規整，間質水腫、膠質細胞腫脹等明顯消退，見圖1。

2.2 5組大鼠腦含水量、腦神經缺損評分及學習記憶能力評分比較 模型組大鼠腦含水量、腦神經缺損評分及學習記憶能力評分高于正常組(P均<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組低于模型組(P均<0.05)，中劑量組低于低劑量組，高劑量組低于中劑量組(P均<0.05)，見表1。

表1 5組大鼠腦含水量、腦神經缺損評分及學習記憶能力評分比較

2.3 5組大鼠海馬區細胞凋亡率比較 模型組細胞凋亡率高于正常組(P均<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組低于模型組(P均<0.05)；中劑量組低于低劑量組，高劑量組低于中劑量組(P均<0.05)，見表2。

表2 5組大鼠海馬區細胞凋亡率比較

圖1 5組大鼠腦出血組織形態觀察(HE染色，×400)

表3 5組大鼠腦勻漿TNF-α、MDA含量比較

2.5 5組大鼠海馬區相關蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達比較 模型組大鼠海馬區相關蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達均低于正常組(P均<0.05)，低劑量組、中劑量組、高劑量組均高于模型組(P均<0.05)，中劑量組高于低劑量組，高劑量組高于中劑量組(P均<0.05)，見表4。

表4 5組大鼠海馬區相關蛋白Bcl-2、PI3K/Akt表達比較

3 討 論

腦出血屬于一種急性疾病，發病率、病死率、致殘率均較高，是神經系統的常見疾病，近年來我國腦出血的發病率逐漸升高，發病年齡也逐漸年輕化[8]。腦出血是重要的腦卒中類型，全世界范圍的發病人數每年約有200萬，腦出血占腦卒中的30%左右，病死率極高，即使幸存下來也會發生非常嚴重的神經功能障礙[9]。腦出血是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血，腦組織神經細胞凋亡在病理生理過程中極其重要[10]。

人參在中醫領域的應用歷史悠久[11]。研究發現，人參除了根以外，莖、葉、花及果中都含有比例各異、組分不同的生物活性分子[12]。人參中主要有人參皂甙、人參多肽、人參多糖和人參花揮發油等生物活性物質，降解分離可以獲得多種必需的氨基酸、脂肪酸及微量元素等[13]。人參多糖是最早研究的多糖類生物活性成分，主要作用是對免疫功能的影響及所產生的免疫性抗腫瘤活性[14]，還能增加免疫力、降血糖、促進造血、抗衰老、抗菌、抗炎等[15]。

TNF-α可在組織損傷中增加腦血管內皮細胞一氧化氮的毒性作用，增加血管內皮的通透性，破壞血腦屏障，使血管源性腦水腫加重。TNF-α可以趨化中性粒細胞、單核細胞及淋巴細胞從而導致白細胞聚集阻塞微血管，導致繼發性缺血缺氧，從而使腦水腫和繼發性腦損傷加重[16]。基于人參多糖具有抗炎、增強免疫力的藥理作用，在本研究中分析人參多糖對腦出血大鼠腦勻漿TNF-α含量的影響，結果顯示，人參多糖干預后，腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量顯著降低，且劑量越高腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量越趨近于正常。此結果說明，人參多糖可通過降低腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α含量，來抵抗大鼠機體炎性反應，增強免疫力，修復大鼠腦損傷。MDA屬于自由基與生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的代謝產物，反映氧自由基含量的指標[17]。腦出血患者發病后血腫周圍存在組織損傷和水腫區域，該區域內腦組織會發生復雜的病理變化，對腦出血患者病情程度及預后造成了嚴重影響，在病理因素中，自由基的作用非常重要[18]。腦出血發生后，大鼠腦組織勻漿中MDA含量顯著增加，其增加實質為自由基所引起的神經細胞過氧化，而人參多糖可增強機體清除自由基的能力，降低MDA含量，進而減輕腦損傷。本研究結果顯示，運用人參多糖干預的腦出血大鼠腦勻漿中MDA含量均顯著降低，且劑量越高腦出血大鼠腦勻漿中TNF-α、MDA含量越趨近于正常，此結果說明，人參多糖可通過降低自由基所引起的神經細胞過氧化，來抑制MDA表達，降低腦損傷程度。

神經細胞凋亡的發生與氧自由基、細胞內鈣超載及興奮性氨基酸毒性等因素引起線粒體的損傷等有關，通過抗氧自由基、抑制細胞內鈣超載等措施來減少細胞凋亡能起較好的神經保護作用。而人參多糖可降低自由基所引起的神經細胞過氧化。本結果顯示，人參多糖干預腦出血模型大鼠海馬區細胞凋亡率相對較低，并隨著時間的推移，細胞凋亡率不斷下降，說明使用人參多糖干預腦出血模型大鼠對海馬區細胞起到抑制凋亡的作用。PI3K不僅具有脂類激活酶活性，還具有蛋白激酶的活性。腦出血后，機體釋放一些具有酪氨酸激酶受體激活物質，激活PI3K從而磷酸化細胞膜上的肌醇。Akt屬于PI3K下游的效應分子，活化后可通過控制凋亡的方式，促進細胞存活生物效應并實現調控生長因子來誘發細胞生長[19]。Bcl-2屬于重要的抗凋亡基因。本結果顯示，人參多糖對腦出血模型大鼠進行干預后，腦出血模型大鼠Bcl-2、Akt、PI3K表達量相對較高，說明人參多糖能夠促進海馬區細胞的增殖，進而修復腦損傷。

綜上所述，人參多糖治療腦出血，能夠改善大鼠記憶能力，減少腦含水量，抑制海馬區細胞凋亡，降低腦出血后繼發性損傷，為臨床治療腦出血提供理論依據。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

鄭希院、翟潔敏：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；李會琪、趙龍斌：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核,進行統計學分析;高章代：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改