高通量測序在重癥肺部感染患者中的應用效果

任迪 李穎 曾晶晶

[摘要] 目的 探討高通量測序技術在重癥肺部感染患者中的應用效果。 方法 回顧性分析2018年1～12月廣東省深圳市第二人民醫院重癥醫學科收治的87例重癥肺部感染患者的臨床資料。采用數字隨機表法分為應用高通量測序患者下一代測序技術（NGS）組43例，對照組44例。比較NGS組病原體檢出率，兩組患者抗生素使用強度，重癥監護病房（ICU）住院天數及28 d病死率。 結果 兩組患者治療前基線資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。NGS組中高通量肺泡灌洗液標本中病原體檢出率明顯高于常規培養，NGS組抗生素使用強度低于對照組，ICU住院時間短于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組患者28 d病死率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 高通量測序技術的應用能提高重癥肺部感染患者肺泡灌洗液病原體的檢出率，降低抗生素使用強度及縮短住院時間。

[關鍵詞] 高通量測序;重癥肺部感染;抗生素使用強度;宏基因組學;下一代測序技術

[中圖分類號] R563? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（a）-0094-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of high-throughput sequencing technology in patients with severe pulmonary infection. Methods A retrospective analysis of the clinical data of 87 patients with severe pulmonary infection were admitted to the Department of Critical Medicine， Shenzhen Second People′s Hospital from January to December 2018. Random table method was used to divide 43 cases of next generation sequencing （NGS） group and 44 cases of control group. The pathogen detection rate in the NGS group， the intensity of antibiotic use， the number of days in the intensive care unit （ICU）， and the 28-day mortality of two groups were compared. Results There was no significant difference in baseline data of patients between the two groups before treatment （P > 0.05）. The detection rate of high-throughput pathogens in the NGS group was significantly higher than that of conventional culture， the intensity of antibiotic use in the NGS group was lower than that in the control group， and the ICU hospital stay was shorter than that in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in the 28 days mortality between the two groups （P > 0.05）. Conclusion The application of high-throughput sequencing technology can improve the detection rate of alveolar lavage fluid pathogens in patients with severe pulmonary infection， reduce the intensity of antibiotic use and shorten the length of hospitalization.

[Key words] High-throughput sequencing; Severe pulmonary infection; Antibiotics use density; Metagenomics; Next generation sequencing technology

重癥肺部感染患者是感染性疾病的主要組成部分，病情復雜、病死率高[1]，需要及時有效地抗感染治療。在無病原學前提下，臨床醫生根據經驗選用抗生素，同時送標本做微生物涂片及培養，待結果回報后決定是否調整抗生素。因常規微生物培養陽性率低且容易受多種不確定因素影響，這將可能導致抗生素多用、濫用，及時找出致病微生物是感染性疾病治療的關鍵。高通量測序技術又稱下一代測序技術（NGS）是新型病原檢測手段，有快速、精準、陽性率高等特點，非常適合病原體診斷[2]。本研究回顧性分析NGS的重癥肺部感染患者病原體檢出率、抗生素使用強度及住院時間，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2018年1～12月廣東省深圳市第二人民醫院重癥醫學科收治的符合入選排除標準的87例重癥肺部感染患者的臨床資料。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。納入標準：①年齡>18歲;②符合《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南》[3]2016版本中的重癥肺部感染診斷;③應用抗生素前已留取了肺泡灌洗液及血樣本;④病程中有根據NGS結果進行了抗生素調整記錄;⑤患者或其家屬已簽署知情同意書。排除標準：①妊娠期婦女;②急性生理與慢性健康評分（APACHE Ⅱ）>35分或<15分;③合并肺外感染;④送檢樣本的微生物核酸含量<100 copies/mL。根據隨機數字表法分為兩組，應用高通量測序患者NGS組43例及對照組44例，兩組患者年齡、APACHE Ⅱ評分、簡化臨床肺部感染評分（CPIS）[4]比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

兩組患者均給予經驗性抗感染、必要的呼吸機輔助通氣、早期腸內營養、維持內環境穩定及臟器功能支持等綜合治療，應用抗生素前收集患者外周血樣本2份和肺泡灌洗液樣本2份，同時送醫院微生物培養以及華大基因臨床檢驗中心進行高通量病原體檢測（BGISEQ-50平臺）。樣本量：醫院微生物培養需要外周靜脈血2套（需氧瓶+厭氧瓶，各2瓶，每瓶10 mL）及肺泡灌洗液樣本至少10 mL，均及時送檢;高通量測序樣本需要外周靜脈血至少2 mL，DNA試管常溫暫存，肺泡灌洗液至少需要采集5 mL，4～20℃暫存，2 h內送檢，如不能及時送檢，血樣本常溫保存，肺泡灌洗液-20℃保存，24 h內均能送檢。

1.2.1 高通量檢測陽性判定方法

參照日本名古屋大學醫學院研究判定的方法，細菌的判定要求Reads>200，同時P1（占所有微生物的比例）>0.5[5]。

1.2.2 高通量檢測微生物致病與定植的判定方法

結合臨床，如患者有發熱、炎性指標升高、痰液性狀改變及影像學改變，判為致病菌;如無臨床感染征象，判為定植菌。

1.2.3 抗生素調整方案

均需與臨床相結合。

1.2.3.1 NGS組? 陽性：根據測序出的病原體針對性調整抗生素為單藥窄譜;陰性：繼續經驗性用藥。

1.2.3.2 對照組? 根據臨床培養結果決定是否調整抗生素。

1.2.4 治療終點臨床治愈、出科。

1.3 觀察指標兩組患者病原體檢出率、抗生素使用強度、重癥監護病房（ICU）住院天數、28 d病死率。

1.4 統計學方法

采用SPSS 24.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料以例數或百分比表示，比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NGS組兩種檢測方法病原體檢出率比較

肺泡灌洗液標本中，高通量病原體檢出率明顯高于常規培養，差異有統計學有意義（P < 0.05）;血標本中，高通量與常規培養比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.2 兩組患者抗生素使用情況比較

NGS組抗生素使用強度明顯低于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;其中碳青霉素類抗生素使用人數及使用強度比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表3。

2.3 兩組患者ICU住院天數及28 d病死率比較

NGS組ICU住院天數明顯短于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）;兩組患者28 d病死率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表4。

3 討論

高通量測序技術是近十余年發展起來的技術，2014年首次被報道用于診斷中樞神經系統感染鉤端螺旋體的病例[6]。該方法可以快速對樣本中全部DNA或RNA進行測序[7-8]。該技術也已經被報道用于血流感染[9]、呼吸道[10]、中樞神經[11]膿腫液、局灶組織[12]等不同標本類型的病原體檢測。現已逐漸應用于重癥患者的病原微生物的檢測中，理論上具有高效、準確及檢出未知病原體的特點。2019年2月發布的《宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識》[13]中肯定了高通量測序技術在危重癥患者病原微生物檢測中的應用價值。針對重癥肺部感染病原體進行高通量測序的研究，經檢索國內外文獻，僅有少量相關研究發表，Li等[14]針對重癥感染患者進行高通量檢測病原體的研究中提示，血及肺泡灌洗液樣本的NGS組病原檢出率均明顯高于常規培養組。Xie等[15]研究中也提示，應用了NGS的重癥肺部感染患者可以早期明確病原菌，細菌陽性率明顯高于對照組，28 d和90 d死亡率明顯低于對照組。Pan等[16]在免疫功能低下的社區獲得性肺部感染13例患者研究提示，NGS在病毒和真菌檢測領域具有明顯的優勢，而在細菌檢測方面未顯示出優勢。劉孝榮等[17]在針對兒童重癥肺部感染肺泡灌洗液應用NGS檢測病原體的研究中提示，NGS組靈敏度高（86.84%），能檢出未知病原體，優于傳統的臨床檢驗方法。本研究中NGS組中高通量病原體檢出率顯著高于常規培養，NGS組陽性的樣本中檢出的病原菌有肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌、乳糖奈瑟球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、棒狀桿菌、黏液羅氏菌等，還有部分沒有免疫功能障礙基礎疾病的患者檢測出較高序列數的人類皰疹病毒5型（CMV）、人類皰疹病毒4型（EB病毒）。考慮可能與重癥患者免疫功能受到影響有關，未檢出真菌及原蟲，可能與真菌細胞壁較厚，DNA胞外釋放量少有關，而常規培養方法僅檢出常見微生物。在不明確致病微生物前提下，臨床醫生往往給予經驗性的廣譜抗生素治療。有研究提示[18]，相對于有明確致病菌而進行的針對性窄譜抗生素治療，并不能顯著改善臨床癥狀及預后且并發癥明顯增高，NGS是實現感染性疾病精準治療、避免抗生素濫用的關鍵技術之一[19]。然而，通過NGS結果指導臨床抗生素的應用研究較少，本研究根據理論依據，應用NGS指導抗生素的應用，取得了一定的效果。本研究結果顯示，NGS組抗生素使用強度明顯低于對照組。在患者28 d死亡率評價中，本研究數據差異無統計學意義，與Xie等[15]研究不一致，可能與疾病嚴重程度、樣本量不同等因素有關。

目前針對高通量測序檢測病原體的結果判定還尚無統一標準或共識，Somasekar等[20]自定義mNGS的判讀標準，細菌、真菌和寄生蟲要求每百萬映射讀取的Reads（rpm）≥陰性對照的10倍，病毒Reads≥20，同時覆蓋度>2%。Zinter等[21]將所有微生物以同一標準劃分，要求rpm≥10同時自定義的Z評分≥2分。Simner等[22]在腦脊液病原體測序中沿用了以上的標準，同時認為致病原應排在所有微生物的前5名。Grumaz等[23]設計出SIQ評分試圖找到更接近感染的Reads數。國內有部分研究[8，24]，判定標準也尚不統一。本研究中仍在一些不足之處，本研究所采用的日本名古屋大學醫學院研究的判定方法是否合適仍需要進一步探討，NGS陽性的病原菌也未進行PCR驗證。現階段我們正在進行重癥感染患者常見不同細菌感染的陽性判斷標準的序列研究。

綜上所述，NGS是一種新型檢測致病微生物的方法，本研究中提高病原體的檢出率，減少抗生素的使用強度及住院天數，臨床應用中仍有較多的不足之處，需要開展更多的相關研究。

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