基于斑馬魚模型的知母皂苷BⅡ的血管保護作用及機制研究

杜孟姣 陳堅平 余嘉賢 梅文杰 余楚欽 王延東

摘 要 目的：研究知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）的血管保護作用，并探討其可能的作用機制。方法：以養殖水為空白對照，考察100、200和400 μg/mL TB-Ⅱ培養受精后24 h（24 hpf）的正常斑馬魚胚胎48 h后對其腸下靜脈血管（SIVs）的影響。采用酪氨酸激酶抑制劑PTK787（0.06 μg/mL）誘導斑馬魚腸下血管損傷模型;以0.1%二甲基亞砜、不加PTK787為空白對照，加PTK787、不加藥物為模型對照，考察100、200、400 μg/mL TB-Ⅱ作用48 h后對血管損傷模型斑馬魚SIVs的影響，并采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法檢測斑馬魚體內fam樣酪氨酸激酶1（Flt-l）、含激酶插入區受體（Kdr）、含激酶插入區受體l（Kdr-l）、血管內皮生長因子A（VEGF-A）以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6） mRNA的相對表達量。結果：100 μg/mL TB-Ⅱ作用后可顯著增加正常斑馬魚的SIVs出芽數（P<0.05），200 μg/mL TB-Ⅱ作用后可顯著增加正常斑馬魚的SIVs數（P<0.05）。與空白對照比較，PTK787作用后斑馬魚SIVs數顯著減少（P<0.01），Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;而經不同質量濃度的TB-Ⅱ作用后，血管損傷模型斑馬魚的SIVs數均不同程度地增加，Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA相對表達量均不同程度地升高，除100 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚SIVs數和Flt-l、TNF-α mRNA表達量以及400 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚TNF-α mRNA表達量增加不顯著外，其余指標差異均有統計學意義（P<0.05或P<0.01）。結論：TB-Ⅱ具有一定的促血管新生和修復受損血管的作用，其機制可能與上調血管內皮生長因子受體和促炎細胞因子的表達相關。

關鍵詞 知母皂苷BⅡ;血管保護;斑馬魚;腸下靜脈血管;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the protective effect of timosaponin BⅡ （TB-Ⅱ） on blood vessels and explore its possible mechanism. METHODS： Using aquaculture water as blank control， the effects of 100， 200 and 400 μg/mL TB-Ⅱ treatment for 48 h on the situation of subintestinal veins （SIVs） in normal zebrafish embryos 24 h after fertilization （24 hpf） were investigated. PTK787 （0.06 μg/mL）， a tyrosine kinase inhibitor， was used to induce the model of zebrafish intestinal vascular injury; using combing with 0.1% dimethyl sulfoxide but no PTK787 as blank control， combing with PTK787 but no drug as model control， the effects treatment of 100， 200 and 400 μg/mL TB-Ⅱ for 48 h on the SIVs of zebrafish model with vascular injury were investigated. Relative expressions of fam-like tyrosine kinase 1 （Flt-1）， kinase insert domain containing receptor （Kdr）， kinase insert domain containing receptor l （Kdr-l）， vascular endothelial growth factor A （VEGF-A）， tumor necrosis factor α （TNF-α） and interleukin 6 （IL-6） mRNA were detected by RT-PCR. RESULTS： 100 μg/mL TB-Ⅱ could significantly increase the sprouting vessel of normal zebrafish SIVs sprouting vessel number （P<0.05）， and 200 μg/mL TB-Ⅱ could significantly increase SIVs number of normal zebrafish （P<0.05）. Compared with blank control， SIVs number of zebrafish decreased significantly after PTK787 treatment （P<0.01）， and the relative expressions of Flt-l， Kdr， Kdr-l， VEGF-A， TNF-α and IL-6 mRNA were alse decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with different concentrations of TB-Ⅱ， SIVs number of vascular injury model zebrafish increased to different extents; relative expressions of Flt-l， Kdr， Kdr-l， VEGF-A， TNF-α and IL-6 mRNA were increased to different extents. There was no significant difference in SIVs number and the expression of Flt-l， TNF-α mRNA in zebrafish treated with 100 μg/mL TB-Ⅱ and the expression of TNF-α mRNA in zebrafish treated with 400 μg/mL TB-Ⅱ， but there was statistical significance in other indexes? （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TB-Ⅱ has a certain function of promoting angiogenesis and repairing damaged blood vessels， and its mechanism is related to the up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor and pro-inflammatory cytokine expression.

KEYWORDS? ?Timosaponin BⅡ; Vascular protection; Zebrafish; Subintestinal veins; Mechanism

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的根莖[1]，始載于《神農本草經》，性寒，味苦，具有滋陰降火、止渴除煩等藥理作用，是中醫臨床常用的傳統藥物[2]。知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）作為知母的主要活性成分，具有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗癌[5]等多種藥理活性。Guo CR等[6]在細胞層面的研究發現，TB-Ⅱ具有防止糖尿病心血管并發癥的潛力，可能具有心血管保護作用。但關于TB-Ⅱ的血管保護作用在體內動物模型層面并未被證實，并且在基因層面，TB-Ⅱ的血管保護作用機制也不明確。目前，血管保護藥物的篩選模型多為體外試驗，其結果需要借助體內模型驗證和評價。斑馬魚是一種優良的脊椎動物模型，借助具有快速篩選、高通量化、與人的遺傳物相似度高等優點的轉基因斑馬魚來作為藥物篩選模型，得到了廣泛的關注[7]。而且在斑馬魚發育過程中，其腸下靜脈血管（SIVs）區域是一個光滑的籃網形結構，在發育初期清晰可見，利于觀察和統計[8]，已成為血管研究的重要模型[9]。因此，本研究以熒光轉基因斑馬魚Tg（fli1：EGFP）為體內模型動物，探究TB-Ⅱ的血管保護作用，并利用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（PCR）法檢測不同質量濃度TB-Ⅱ對斑馬魚體內fam樣酪氨酸激酶1（Flt-l）、含激酶插入區受體（Kdr）、含激酶插入區受體1（Kdr-l）、血管內皮生長因子A（VEGF-A）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）的mRNA表達，從而探究TB-Ⅱ保護血管的可能機制，為TB-Ⅱ血管保護作用的進一步開發研究奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Z-A-S5型斑馬魚養殖單元（上海海圣生物實驗設備有限公司）;SZ780型連續變倍體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）;CFX96型實時熒光定量-PCR儀（伯樂生命醫學產品有限公司）;ZXSD-A1090型生化培養箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）;DMi8型熒光顯微鏡（德國Leica公司）;CP225D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）;1424R型低溫冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）;K2800型微量分光光度計（北京凱奧科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

TB-Ⅱ對照品 （西安匯林生物科技有限公司，批號：18041004，純度：≥98%）;酪氨酸激酶抑制劑PTK787（批號：A0625AS，純度：>98%）;胰蛋白酶（批號：19030710，純度：≥99%）均購自大連美侖生物技術有限公司;RNA抽提試劑Trizol（美國Invitrogen公司，批號：15596026）;PCR反應試劑盒、逆轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號分別為RR420AA、2641A-1）;二甲基亞砜（DMSO）、異丙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）堿（廣州化學制劑總廠，均為分析純）;PCR引物由深圳優迪生物技術有限公司設計合成;水為自制養殖水。

1.3 動物

成年熒光轉基因斑馬魚Tg（fli1：EGFP），雌雄兼有，購自中國斑馬魚資源中心。斑馬魚飼養于循環水產養殖系統中，水溫控制在（28.5±1.0） ℃、pH為 6.9～7.5、光照（14 h）/黑暗（10 h）周期交替，每天喂食3次鹽水蝦。

2 方法

2.1 斑馬魚胚胎的培養與收集

在繁殖的前一天晚上，將雌雄斑馬魚按照1 ∶ 1的比例放入繁殖盒中，使用隔板將不同性別的斑馬魚隔開。次日清晨，將繁殖隔板拆掉，在燈亮（光照強度54～324 lux）條件下30 min內，由斑馬魚自然交配，自然產生斑馬魚胚胎。收集斑馬魚胚胎，用水清洗多次，轉入干凈的培養皿中，即獲得了實驗所需的斑馬魚胚胎。

2.2 TB-Ⅱ對正常斑馬魚血管新生的影響考察

將受精后24 h（24 hpf）的斑馬魚胚胎用胰蛋白酶進行脫膜處理后，在體視顯微鏡下將其隨機暴露于24孔板中，每孔16個胚胎。實驗設置TB-Ⅱ不同質量濃度組（100、200、400 μg/mL，以水為溶劑制備）和空白對照組（水），每孔加入相應溶液1 mL。加藥完畢后，將24孔板用錫紙遮光，置于溫度28.5 ℃、光照（14 h）/黑暗（10 h）交替的環境下培養。培養48 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組斑馬魚SIVs數和SIVs出芽數。

2.3 TB-Ⅱ對PTK787誘導的血管損傷斑馬魚血管新生的影響考察

將24 hpf的斑馬魚胚胎用胰蛋白酶進行脫膜處理后，在體視顯微鏡下隨機暴露于24孔板中，每孔16個胚胎。采用酪氨酸激酶抑制劑PTK787誘導斑馬魚腸下血管損傷模型。實驗設置TB-Ⅱ不同質量濃度組（100、200、400 μg/mL TB-Ⅱ溶液+0.06 μg/mL PTK787溶液，DMSO終濃度為0.1%）、模型對照組（0.06 μg/mL PTK787溶液，DMSO終濃度為0.1%）和空白對照組（0.1%DMSO），每組均按1 mL/孔加入相應溶液。加藥完畢后，將24孔板用錫紙遮光，置于溫度28.5 ℃、光照（14 h）/黑暗（10 h）交替的環境下培養。培養48 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組斑馬魚SIVs數。

2.4 TB-Ⅱ對PTK787誘導的血管損傷斑馬魚體內相關因子mRNA表達的影響考察

采用實時熒光定量PCR法進行檢測。將24 hpf的斑馬魚胚胎用胰蛋白酶進行脫膜處理后，在體視顯微鏡下隨機暴露于24孔板中，每孔16個胚胎。實驗分組、給藥及培養情況同“2.3”項。培養48 h后，每孔隨機抽取3條斑馬魚，按照Trizol試劑說明書操作提取斑馬魚總RNA，再按逆轉錄試劑盒說明書方法逆轉錄合成cDNA，并以cDNA為模板采用兩步法進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸34 s，39個循環;反應體系：cDNA（稀釋5倍）5 μL，SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus） 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 4 μL，共20 μL。以甘酒醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，采用2-ΔΔct法計算各目標基因的相對表達量。引物序列及產物長度詳見表1。

2.5 統計學方法

采用GraphPad Prism 6軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用Dunnett檢驗，方差不齊性時組間兩兩比較采用Dunnetts T3檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 TB-Ⅱ對正常轉基因斑馬魚血管新生的影響

與空白對照組比較，TB-Ⅱ 100 μg/mL組斑馬魚SIVs出芽數顯著增加（P<0.05），TB-Ⅱ 200 μg/mL組斑馬魚SIVs數顯著增加（P<0.01），提示TB-Ⅱ具有促進斑馬魚血管新生的作用，結果詳見圖1、表2。

3.2 TB-Ⅱ對血管損傷斑馬魚血管新生的影響

與空白對照組比較，模型對照組斑馬魚SIVs數顯著

3.3 TB-Ⅱ對血管損傷斑馬魚體內Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組斑馬魚體內Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相對表達量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型對照組比較，TB-Ⅱ 100 μg/mL組斑馬魚體內Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相對表達量顯著升高（P<0.05或P<0.01），但Flt-l mRNA的相對表達量差異無統計學意義（P>0.05）;TB-Ⅱ 200、400 μg/mL組斑馬魚體內Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.01），結果詳見表4。

3.4 TB-Ⅱ對血管損傷斑馬魚體內TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，模型對照組斑馬魚體內TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達量顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，TB-Ⅱ 100、400 μg/mL組斑馬魚體內TNF-α mRNA的相對表達量差異無統計學意義（P>0.05），IL-6 mRNA的相對表達量顯著升高（P<0.05或P<0.01）;而TB-Ⅱ 200 μg/mL組斑馬魚體內TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達量均顯著升高（P<0.01），結果詳見表5。

4 討論

在前期研究中，筆者根據經濟合作與發展組織提案斑馬魚胚胎毒性試驗（OECD，2013）進行了斑馬魚胚胎的急性毒性評價[10]，結果顯示，在96 hpf時，100、200、400、600 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚胚胎的存活率分別為100%、94.8%、98.2%、100%;在72 hpf時，100、200、400、600 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚胚胎全部孵化（存活率為100%），但是600 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚胚胎出現了畸形、心包水腫。因此，本研究選用100、200、400 μg/mL這3個質量濃度作為本研究的實驗濃度。PTK787是一種酪氨酸激酶抑制劑，其能夠顯著抑制Kdr，從而引起血管損傷[11]。因此，本研究利用PTK787來構建血管損傷模型，模擬缺血區域的血管內皮損傷。

血管新生是指從原有的血管結構中生成新的血管，涉及內皮細胞增殖和遷移、基底膜降解、血管管腔形成等一系列復雜的生物學過程[12]。VEGF及VEGF受體（VEGFR）是血管生成的關鍵信號分子，兩者結合后能夠誘導內皮細胞一氧化氮合酶（eNOS）的釋放，從而引起血管舒張，使血管通透性增加，達到促血管新生的作用[13]。VEGF是一個家族，包括了VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子（PIGF）。VEGFR主要有3類，分別為Flt-l、Kdr和VEGFR-3。其中，Flt-l主要分布于血管內皮細胞、造血肝細胞、巨噬細胞等，Kdr分布于血管內皮細胞及淋巴內皮細胞，VEGFR-3主要分布于成人淋巴內皮表面[14]。其中，Flt-l和Kdr可調控VEGF/VEGFR系統，促進血管新生。另外VEGF-A是血管生成的主要調控因子，其可結合并激活2種酪氨酸激酶受體Flt-l和Kdr[15]。近年研究發現，Kdr-l亦和血管新生有關聯[16]。因此，本研究選用Flt-l、Kdr、Kdr-l和VEGF-A來研究TB-Ⅱ對VEGFR的調控能力。此外，已有研究報道，免疫系統在血管生成中具有重要的作用，促炎細胞因子（如IL-6、TNF-α等）已被報道具有促進血管生成的作用[17-18]。因此，本研究通過觀察TB-Ⅱ對斑馬魚體內IL-6和TNF-α mRNA表達的影響，從炎癥免疫角度闡釋TB-Ⅱ血管保護的機制，從而為TB-Ⅱ防治心血管疾病提供實驗依據。

從本研究結果可知，在正常轉基因斑馬魚中，一定濃度的TB-Ⅱ可顯著增加SIVs數和SIVs出芽數，表明TB-Ⅱ對正常斑馬魚有促血管生成作用。而在PTK787誘導的血管損傷模型斑馬魚中，100、200、400 μg/mL TB-Ⅱ均可不同程度地抑制PTK787對血管的損傷，增加SIVs數，這表明TB-Ⅱ對受損血管亦具有改善作用。在基因層面上，100、200、400 μg/mL的TB-Ⅱ均能夠不同程度地逆轉PTK787誘導的斑馬魚體內Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA表達量的下降，從而修復血管損傷，發揮血管改善作用。因此，筆者推斷TB-Ⅱ可通過上調VEGFR和促炎細胞因子，發揮其促血管新生以及修復受損血管的作用。

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（收稿日期：2019-11-20 修回日期：2020-01-19）

（編輯：林 靜）