microRNA-21靶向調控Wnt2基因對肝癌細胞HepG2增殖與遷移的影響

王澤鑫， 關利君， 李建明， 王志超， 薛夢若， 秦孝軍

內蒙古醫科大學附屬醫院 介入放射科， 呼和浩特 010050

肝癌為目前全球范圍內最為常見的惡性腫瘤之一，每年約有60萬人死于肝癌，近10年來，隨著現代診斷技術以及外科手術的不斷發展和進步，肝癌的臨床診斷和外科手術治療已經取得了長足的進步[1]。但肝癌發病較為隱匿，患者早期臨床癥狀無特異性，大部分患者臨床確診時已經處于疾病中晚期，失去了手術治療的機會，患者5年生存率較低[2-3]。研究[4]表明，microRNA-21(miR-21)與肝癌的發生發展、侵襲和轉移密切相關，但miR-21對肝癌的具體調控機制尚不明確。Wnt信號通路具有明顯的促癌作用，與多種惡性腫瘤的發生發展有關，而Wnt2是Wnt信號通路中一種重要的信號轉導因子，研究[5]證實，在惡性腫瘤細胞中Wnt2蛋白高表達，可促進腫瘤細胞的增殖。miR-21是否通過Wnt信號通路影響肝癌細胞的增殖和轉移，目前尚無相關報道。本研究擬探討miR-21靶向調控Wnt2基因對肝癌細胞HepG2增殖與遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 胚腎細胞株HEK293、肝癌細胞株HepG2以及正常肝細胞株LO2均購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)，青霉素-鏈霉素混合溶液(美國Hyclone公司)，澳洲胎牛血清(美國Thermo公司)，0.25%胰蛋白酶(美國Thermo公司)，miR-21抑制劑及其陰性對照(上海吉碼生物科技有限公司)，LipofectaminTM 2000(美國Invitrogen公司)，質粒提取試劑盒(美國Invitrogen公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，兔抗人Wnt2多克隆抗體(武漢中美科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，HRP標記二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，四甲基氮唑鹽(MTT，美國Sigma公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測細胞miR-21表達 使用Trizol提取HepG2細胞以及LO2細胞中總RNA，加入Trizol裂解后使用氯仿/異丙醇處理，收集白色RNA沉淀；75%乙醇洗滌，離心后棄取上清。晾干后采用DEPC水溶解，合成cDNA，并進行實時熒光定量PCR反應，反應條件：95 ℃變性30 s，(95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s)35個循環。以U6作為內參，采用2-△△Ct方法表示miR-21相對表達量。操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.3.2 細胞轉染 轉染前1天，將對數生長期的HepG2細胞接種于6孔板內(1×105/孔)，待細胞融合度達到60%～70%時，換為無血清的培養基，采用Lipofectamine脂質體法將miR-21抑制劑及陰性對照轉染至HepG2細胞，分別作為抑制劑組及對照組。轉染48 h后，采用熒光定量PCR檢測抑制劑組與對照組miR-21表達水平，miR-21檢測方法參照1.3.1，以評價轉染效果。

1.3.3 MTT法檢測細胞增殖 轉染48 h后消化細胞，接種至96孔板內進行細胞培養，培養24、48、72 h，每孔分別加入5 μg/μl MTT溶液，繼續培養4 h后加入DMSO，震蕩10 min，檢測酶標儀490 nm下各孔吸光值，設空白對照判斷各孔細胞增殖情況，每組實驗重復3次。

1.3.4 流式細胞技術檢測細胞凋亡 將HepG2細胞接種于6孔板內轉染，轉染48 h后，消化收集細胞，采用流式細胞技術檢測各組細胞凋亡情況，參照Annein V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒使用說明書進行操作，染色15 min后上機檢測各組細胞凋亡率，每組實驗重復3次。

1.3.5 Transwell實驗檢測細胞遷移能力 按照上述步驟轉染細胞48 h后，常規洗滌、消化，離心5 min(1000 r/min)，收集細胞后使用無血清培養基將細胞密度調整為1×106個/ml，取150 μl將其接種于Transwell小室的上室，然后使用含10%胎牛血清的培養基600 μl接種于下室內，培養12 h后，將上室內的細胞使用棉簽擦去，95%甲醇固定10 min，PBS洗滌，結晶紫染色30 min，置于倒置顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

1.3.6 Western Blot檢測蛋白表達 轉染48 h后向每孔細胞內加入200 μl蛋白裂解液，冰上裂解30 min后將其轉入EP管內，離心10 min(12 000 r/min)，取上清并使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。每組取等量的蛋白樣品→SDS-PAGE凝膠電泳→轉膜→5%脫脂奶粉室溫封閉→Wnt2一抗封閉過夜(4 ℃)→室溫下孵育二抗1 h→ECL化學發光法顯色→凝膠成像儀觀察，Wnt2蛋白相對表達量以目標條帶與內參GAPDH的光密度值表示。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因實驗 構建基因A 3′UTR的雙熒光報告質粒，分別在HepG2細胞及HEK293細胞中按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書進行雙熒光報告，使用miR-21抑制劑及其陰性對照轉染，以驗證miR-21與Wnt2基因的關系。各組相對熒光強度以螢火蟲熒光素酶強度/海腎熒光強度比值表示。

2 結果

2.1 轉染miR-21抑制劑對HepG2細胞miR-21表達的影響 HepG2細胞miR-21相對表達水平(1.978±0.035)明顯高于LO2細胞(1.586±0.022)，差異有統計學意義(t=16.424,P<0.05)。轉染miR-21抑制劑后，抑制劑組miR-21相對表達水平(0.857±0.017)較對照組顯著降低(1.684±0.039)，差異有統計學意義(t=33.669,P<0.05)。

2.2 轉染miR-21抑制劑對HepG2細胞增殖、遷移和凋亡的影響 抑制劑組HepG2細胞增殖能力較對照組顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

抑制劑組穿過Tranwell小室的細胞數(83.72±15.06)顯著低于對照組(147.85±20.64)，差異有統計學意義(t=4.347,P<0.05)。抑制劑組細胞凋亡率(25.67%±3.95%)明顯高于對照組(10.27%±2.14%)，差異有統計學意義(t=5.937,P<0.05)(圖1)。

表1 轉染miR-21抑制劑對HepG2細胞增殖的影響

圖1轉染miR-21抑制劑HepG2細胞凋亡情況

2.3 轉染miR-21抑制劑對HepG2細胞Wnt2表達的影響 抑制劑組HepG2細胞Wnt2相對表達水平(0.862±0.127)明顯低于對照組(1.306±0.218)，差異有統計學意義(t=3.048,P<0.05)(圖2)。

2.4 miR-21對Wnt2的靶向調控作用驗證 TargetScan軟件發現Wnt2可能是miR-21的潛在靶點，miR-21抑制劑可顯著抑制野生型Wnt2-3′ UTR質粒轉染細胞的熒光素酶活性(0.972±0.102 vs 0.612±0.092，t=4.219，P<0.001)，而對突變型Wnt2-3′ UTR質粒轉染細胞的熒光素酶活性并無明顯影響(0.982±0.093 vs 0.911±0.128，t=0.972，P>0.05)。

圖2 Wnt2蛋白表達的電泳圖

3 討論

microRNA是近年來發現的一類內源性小分子非編碼單鏈RNA，約18～25個核苷酸長度，具有高度保守性[6-7]。microRNA可通過Watson-Crick堿基互補匹配原則對靶mRNA進行降解或抑制翻譯來調控蛋白的表達情況[8]。學者[9-10]預測，人類基因中大約有1000個microRNA參與機體30%的蛋白編碼基因，在細胞生長、發育、分化以及繁殖等多個方面均發揮著重要作用。越來越多的研究[11-13]證實，miR-21作為一種新的原癌基因，在腫瘤的發生發展中扮演著重要角色。

miR-21位于17號染色體短臂FRA17B脆性區域上，研究證明miR-21在多種腫瘤中表達顯著升高，參與癌癥相關基因的表達。肝癌作為世界范圍內最為常見的惡性腫瘤之一，由于診斷和治療困難，患者總體預后較差[14]。研究[15]顯示，microRNA參與癌細胞免疫逃逸、腫瘤轉移以及腫瘤血管的生成過程。臨床研究[16]顯示，在肝癌組織中miR-21明顯升高，并與肝癌患者臨床病理特征具有密切聯系。本研究結果顯示，HepG2肝癌細胞miR-21相對表達水平明顯高于正常肝細胞；而轉染miR-21抑制劑后，抑制劑組HepG2細胞與對照組比較，miR-21相對表達水平明顯降低，表明miR-21在肝癌細胞中呈高表達狀態，與學者報道結果[17]相似。miR-21可能是肝癌促癌基因之一，其高表達與腫瘤發生、發展有關。本研究顯示，抑制劑組的HepG2細胞增殖、遷移能力明顯低于對照組，而細胞凋亡率則明顯高于對照組，表明miR-21表達受到抑制后，可有效抑制肝癌細胞的增殖和遷移，同時促進肝癌細胞的凋亡，進一步提示了miR-21與肝癌細胞增殖、遷移等惡性行為有關，與臨床報道結果[18]相一致。

Wnt是一種分泌性糖蛋白，相對分子質量約為40 000，在多種組織中均有表達，當細胞外界因素發生變化時，可導致Wnt過度激活，進而發生失調導致機體發育異常甚至形成腫瘤[19-20]。Wnt信號通路在肝癌、胃癌、結直腸癌以及胰腺癌等多種惡性腫瘤中均有一定的促進癌細胞增殖、生長以及轉移的作用[21]。Wnt2作為Wnt信號通路中的一種重要分子，研究[22]顯示，Wnt2的大量分泌可激活Wnt2-β連環蛋白信號通路，最終促進癌細胞生長，且Wnt2表達與惡性腫瘤侵襲潛能、腫瘤分期及臨床分級呈正相關關系。本研究結果顯示，抑制劑組HepG2細胞Wnt2相對表達水平明顯低于對照組，提示miR-21表達受到抑制后，細胞中Wnt2蛋白表達明顯降低，從而可抑制Wnt信號通路的過度激活。采用雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實，Wnt2是miR-21的潛在靶基因，并且miR-21對Wnt2表達存在顯著調控作用，表明在肝癌中miR-21可能扮演促癌的microRNA角色。miR-21在肝癌中異常高表達促進Wnt2蛋白的表達，導致Wnt信號通路的激活，促進腫瘤細胞增殖生長以及惡性侵襲的潛能；而抑制miR-21表達，有助于促進肝癌細胞的凋亡以及增殖抑制。miR-21有望成為肝癌治療的潛在靶點之一[23-24]。

綜上所述，抑制miR-21表達可有效抑制HepG2細胞增殖和遷移，促進HepG2細胞凋亡，并抑制Wnt信號通路的過度激活，可能成為肝癌治療的潛在靶基因之一，值得進一步深入研究分析。