不同穴位艾灸對腹瀉模型小鼠腹瀉指數及小腸AQP8、VIP及SP表達的影響

楊曉希，武小利，高 紡，吳生兵，周美啟

(1.安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫藥大學 新安醫學教育部重點實驗室，安徽 合肥 230038；3.安徽省中醫藥科學院亳州中醫藥研究所，安徽 亳州 236800)

腹瀉是指日排便超過3次且每日排便量大于200 g，糞便內含水量高于85%[1]。功能性腹瀉是腹瀉的一種，是較為常見的消化道疾病，其發病一般無器質性損害，多數原因可能與患者飲食習慣、生活起居以及個人體質因素相關，因此其發病率一直居高不下。目前，隨著艾灸在臨床上的廣泛使用，艾灸治療功能性腹瀉的療效也十分顯著，并逐漸得到大眾的認可[2-5]。因此，艾灸治療腹瀉也成為目前的研究熱點[6]。研究[7]表明，針灸治療功能性腸病是通過神經-免疫網絡調控途徑發揮作用，但艾灸干預功能性腹瀉是否通過調節血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、P物質(substance P，SP)和水通道蛋白8(aquaporin protein-8，AQP8)表達而實現的暫不得而知。本研究在前期研究[8]基礎上，觀察艾灸對腹瀉模型小鼠腹瀉指數及小腸組織VIP、SP、AQP8表達的影響，探討艾灸干預腹瀉的作用機制，為艾灸臨床應用提供參考。

1 材料

1.1 動物及分組 選取健康、清潔級昆明小鼠90只，雄性，體質量為20～30 g，由安徽省實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK(皖)2011-0002。獨立送風隔離籠具飼養，室內溫度控制在(22±1)℃的范圍內，相對濕度(55±5)%，自然光照，小鼠自取食水。室溫適應環境下飼養1周后，按照隨機數字表法，從90只小鼠中選取15只作為正常組，其余75只進行腹瀉模型的復制，將模型復制成功的小鼠隨機分為天樞組、大腸俞組、天樞大腸俞組和模型組，每組16只。模型復制不成功的以及實驗中死亡小鼠均未列入實驗分析對象。

1.2 藥品與試劑 番瀉葉：合肥百姓緣大藥房；中性甲醛、乙醇、二甲苯：上海化學試劑公司；AQP8、VIP、SP抗體及通用型二步法二抗、DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司；其余實驗所需試劑為國產分析純，由安徽中醫藥大學新安醫學教育部重點實驗室配制。

1.3 儀器與設備 TB718包埋機：湖北泰維；Leica2135切片機：德國萊卡；Olympus BX51顯微鏡：日本奧林巴斯)；JD801顯微圖像分析系統：南京捷達。

2 方法

2.1 模型制備與評定

2.1.1 番瀉葉煎劑的制作 參考高蕊等[9]的報道，取番瀉葉加水煮沸約10 min，雙層紗布過濾，濾液減壓濃縮成1 g/mL的番瀉葉煎劑，冰箱保存，用時水浴加溫至25 ℃。

2.1.2 模型復制 參照周干南等[10]報道的小鼠腹瀉模型的制備方法：實驗室飼養2 d的健康小鼠，每日灌服番瀉葉煎劑0.5 mL，連續3 d(每日9:00灌胃，11:00—16:00每隔1 h更換濾紙，記錄1次，共5次)。每日灌胃后將小鼠單獨分開放入墊有濾紙的鼠籠飼養，于模型復制前將小鼠禁食10 h，自由飲水。

2.1.3 模型復制成功標準 模型復制后5 h內，觀察有糞便不成形者或稀便且濾紙上有污跡者，即視為模型復制成功。

2.2 治療方法

2.2.1 腧穴定位 “天樞”“大腸俞”腧穴定位參照常用實驗動物針灸穴位的取穴標準[11]。

2.2.2 艾灸方法 天樞組取雙側天樞穴，大腸俞組取雙側大腸俞穴，天樞大腸俞組取同一側天樞、大腸俞(隔日交換對側)，固定，采用直徑為0.7 cm、長為10 cm的清艾條懸于相應穴位上方2 cm處，溫和灸20 min，每日1次，7 d為1個療程；正常組、模型組不予艾灸。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 腹瀉指數 模型復制結束后，把每只小鼠分別單獨放入鼠籠飼養，每只鼠籠內皆備有一層濾紙且每小時更換1次濾紙，并記錄5 h內小鼠排稀便的情況，計算腹瀉指數，并進行組間比較。腹瀉指數計算參考相關報道[12]：腹瀉指數=稀便率(每只小鼠所排稀糞數/總便數)×稀便級(以稀便污染濾紙形成污跡面積分級，分為4級。1級：污染直徑<1 cm；2級：1 cm≤污染直徑<2 cm；3級：2 cm≤污染直徑≤3 cm；4級：污染直徑>3 cm)，分開統計每一堆稀便的級數(稀便級=單只小鼠所有稀便級數總和/稀便總次數)；級數直徑的測量：呈圓形的糞便直接測量直徑，呈橢圓形的糞便直徑取其最長和近似圓直徑的平均值；區分干便與稀便標準：以濾紙上有無污跡為主；糞便次數的統計：以每粒或每堆(不能分清粒數者)為1次。

2.3.2 AQP8、VIP及SP免疫陽性細胞表達 小鼠腹瀉指數統計完成后，選取正常組、模型組及療效最好的艾灸組用于免疫組織化學檢測；各組分別取8只小鼠脫頸椎處死，開腹取出小腸，截取長1 cm小腸放入4%中性甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋、切片。參考試劑說明書進行對應染色。免疫組織化學染色后，胞膜、胞核或胞漿有棕黃色顆粒為陽性細胞。AQP8、VIP及SP免疫陽性細胞表達水平采用JD形態分析系統分別計算其吸光度值。

3 結果

3.1 各組小鼠腹瀉指數比較 與正常組比較，模型組腹瀉指數顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，天樞組、大腸俞組、天樞大腸俞組腹瀉指數均顯著降低(P<0.05)；與大腸俞組、天樞組比較，天樞大腸俞組腹瀉指數顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組小數腹瀉指數比較

注：與模型組比較，#P<0.05；與天樞大腸俞組比較，△P<0.05

3.2 各組小鼠AQP8、VIP及SP免疫陽性細胞表達水平比較 與正常組比較，模型組小腸組織AQP8免疫陽性細胞表達水平顯著減少(P<0.05)，VIP、SP免疫陽性細胞表達水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，天樞大腸俞組小腸組織AQP8免疫陽性細胞表達水平顯著增加(P<0.05)，VIP、SP免疫陽性細胞表達水平顯著減少(P<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組小鼠AQP8、VIP及SP表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

腹瀉是由于腸道對水分的吸收功能減弱或者分泌功能增強而導致大便糞質含水量增加所致的一種腸道疾病[13]，屬中醫學“泄瀉”范疇，其基本病機為脾病濕盛，脾胃運化功能失調，腸道功能失司[14]。

天樞穴屬胃經，亦為大腸之募穴，主治腹脹腸鳴、便秘、泄瀉等疾病[15]54。大腸俞為大腸之背俞穴，《千金方》云：“大腸俞主暴泄”，即大腸俞具有理氣通腑、調和胃腸的功效?，F代研究[16]發現，艾灸天樞穴可以降低腹瀉型腸易激綜合征小鼠的血清炎癥因子水平，可用于治療腹瀉。

圖1 各組小鼠AQP8、VIP及SP免疫陽性細胞表達(免疫組織化學染色法，10×40倍)

俞募配穴是指同一臟腑的背俞穴和募穴配合使用的一種配穴方法，也稱前后配穴法[15]34。天樞穴配大腸俞為常見的治療腸腑疾病的俞募配穴法。俞募配穴旨在發揮協同作用，達到更好的治療效果，體現了中醫學“從陰引陽，從陽引陰”的思想，因“氣在胸者，止之膺與背俞。氣在腹者，止之背俞……”(《靈樞·衛氣》)，即臟腑之氣與其俞、募穴密切相關，二者結合可發揮協同作用?，F代研究[17]認為，同時刺激天樞、大腸俞可以調理腸胃，改善腸道功能。

AQP8是一種分布于動植物組織器官中，在轉運跨細胞水、分泌吸收液體中起著重要作用的水通道蛋白[18]。水通道蛋白參與了消化道水分的分泌和吸收，AQP8表達異常則會引起腹瀉[19]。因此，通過檢測腹瀉模型小鼠小腸組織AQP8免疫細胞表達水平，可以反映艾灸干預腹瀉過程中對AQP的調節作用及其機制。VIP多存在于胃腸道黏膜的內分泌細胞、黏膜下的細微神經纖維以及腸肌神經叢等[20]。生理情況下，VIP具有胃腸激素作用和神經肽的雙重功能， 促進腸道水、電解質、胰液及腸液的分泌, 調節胃腸吸收，還具有抗炎作用[21]。SP在腸道中含量較豐富，可興奮平滑肌、舒張血管和促進腺體分泌等，參與感覺信息傳遞、胃腸活動、痛覺調制、心血管活動、神經內分泌等復雜的生理功能[22]。

本研究表明，艾灸不同腧穴可顯著降低腹瀉模型小鼠的腹瀉指數，且天樞大腸俞組效果最佳，說明天樞與大腸俞配伍治療腹瀉具有協同效應；免疫組織化學染色結果顯示，與模型組比較，天樞大腸俞組小腸組織AQP8免疫陽性細胞表達顯著增加(P<0.05)，VIP、SP免疫陽性細胞表達均顯著減少(P<0.05)，小腸組織AQP8表達上調可增強腸道水分吸收，改善糞質性狀，而VIP、SP的增加可刺激腸道蠕動，增加排便次數，對VIP、SP免疫陽性細胞表達的抑制可緩解胃腸道的不適，減輕腹瀉[23-24]。艾灸不同腧穴治療腹瀉的機制可能與上調AQP8表達或下調VIP、SP表達有關。