艾灸對去卵巢骨質疏松癥大鼠骨髓間充質干細胞Wnt/β-catenin信號通路的影響

姚長風，劉自兵，唐 巍，張 燕，劉存斌，汪宗寶，李斯亮

(安徽中醫藥大學針灸推拿學院，安徽 合肥 230012)

骨代謝性疾病是臨床常見疾病，其中以骨質疏松癥的危害性最大。在我國中老年人群中，骨質疏松癥女性患者多見。艾灸等中醫藥療法是目前臨床治療骨質疏松癥的較好方法[1-2]，且不良反應不明顯，因而日益受到人們的重視。既往研究[3-4]發現，艾灸關元、三陰交可以有效提高去卵巢大鼠的骨密度，提高血清中雌二醇含量，亦可以有效提高女性患者血清中雌二醇含量，但其內在機制尚未明確。不少學者指出，骨改建的失衡是骨質疏松癥發生的根本原因，作為成骨細胞前體細胞的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)在改建過程中具有重要作用。有學者認為，Wnt/β-catenin信號通路是BMMSCs分化為成骨細胞過程中的重要信號通路。因而本研究在既往研究的基礎上，以經典的去卵巢大鼠骨質疏松癥模型為研究對象，利用現代細胞分子生物學技術，觀察艾灸三陰交、關元穴對去卵巢大鼠BMMSCs中Wnt/β-catenin信號通路的影響，探究艾灸影響骨代謝的內在機制。

1 材料

1.1 實驗動物 6月齡SPF級SD雌性大鼠60只，體質量(310±10)g，由安徽醫科大學實驗動物中心[生產許可證號：SCXK(皖)2011-0002]提供。

1.2 主要試劑及儀器 MTT(BS0328)：北京綠生源科技有限公司；骨鈣素(bone glaprotein,BGP)、酶聯免疫吸附試驗試劑盒(20160110、20160108)：上海源葉生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀(PIKOREAL 96)、逆轉錄試劑盒(00287813)：Thermo；β-連環蛋白(β-catenin)(GR177612-31)：Abcam；TCF-4(7)：CST；一抗Wnt3a(150604)、Dkk1(AF02158945)：Bioss。

2 方法

2.1 動物模型復制、分組和干預 采用隨機數字表法將60只大鼠隨機分為正常組(20只)和去卵巢組(40只)。在切除大鼠卵巢第13周時，從正常組和去卵巢組各取10只，按照文獻[3]方法鑒定骨質疏松癥模型。將去卵巢組再隨機分成正常組、模型組、雌二醇組和艾灸組，每組10只。實驗過程中對動物的處置符合2006年國家科技部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》的規定。

艾灸組大鼠取三陰交、關元穴(參照《實驗針灸學》中“大鼠常見穴位圖譜”[5]進行穴位定位)，以0.75 cm×30 cm艾條在距穴位皮膚1 cm處進行溫和灸，每穴灸15 min，每日1次。雌二醇組給予17β-雌二醇100 μg/(kg·d)灌胃，每日1次。模型組和正常組給予2 mL 9.0 g/L氯化鈉注射液灌胃，每日1次。6次為1個療程，療程間休息1 d，共12個療程。

2.2 標本采集 對去卵巢的各組大鼠分別干預12周后處死，在無菌操作下分離股骨和脛骨，剔凈周圍軟組織，剪除兩端骨組織，暴露骨髓腔，用2 mL射器，從一端緩慢注入含10%胎牛血清、100 U/mL青-鏈霉素的高糖ɑ-MEM細胞培養基，將沖出的骨髓細胞，用含10%胎牛血清的ɑ-MEM培養基置入37 ℃、5% CO2培養箱中培養，2 d換液1次，待用。

2.3 MTT法檢測大鼠BMMSCs的活性 取F2代細胞，制成每孔1×103個的細胞懸液，接種到96孔板，設5組，每組3個復孔，每孔細胞懸液200 μL，置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱內孵育，每間隔4 d取1組，每孔加入MTT(2 mg/mL)20 μL，37 ℃孵育，4 h后吸棄孔內培養液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(分析純)，移至酶聯免疫檢測儀上振蕩10 min，用分光光度計在492 nm波長處測定每孔的光密度(optical density, OD)，以OD值為縱坐標，以時間為橫坐標繪制生長曲線，培養第4、8、12、16天時，分別檢測各組大鼠BMMSCs的相對增長率，以相對增長率反映BMMSCs的活性。

2.4 酶聯免疫吸附法檢測大鼠BMMSCs中BGP含量 ①收集細胞上清液后，3 000 r/min離心10 min，去除顆粒和聚合物。②設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加入不同濃度的標準品50 μL。③樣本孔先加入待測樣本血清10 μL，再加入樣本稀釋液40 μL，空白孔不加血清，僅加入稀釋液50 μL。④除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。⑤棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗板5次。⑥每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。⑦每孔加入終止液50 μL，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的OD值。測定各組大鼠BMMSCs中BGP含量。

2.5 實時熒光定量PCR法測定Wnt3a、低密度脂蛋白受體相關蛋白-5(low density lipoprotein receptor associated protein-5，LRP-5)、LRP-6、Dkk1、β-catenin和T細胞因子(T-cell factor, TCF) mRNA相對表達水平 將每組F2代BMMSCs移至六孔板內，每孔1×105個，用2 mL含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的ɑ-MEM培養細胞。3 d后，孔內細胞濃度達80%時，吸盡培養液，PBS洗2次，采用一步法抽提mRNA，檢驗其質量和完整性。逆轉錄后，采用實時熒光定量PCR法測定Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin和TCF mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。引物由Invitrogen公司合成，每組每個樣品設立6個復孔，取均值，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

表1 Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA的引物序列

2.6 Western blot法測定Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白的表達水平 按“2.5”項下方法培養BMMSCs，加入100 μL蛋白裂解液[V(PMSF)∶V(RIPA)=1∶100]，冰上靜止20 min，收集裂解的細胞，12 000 r/min離心15 min，收集上清后，采用Western blot法測定Wnt3a、Dkk1、β-catenin和TCF蛋白的表達水平。

3 結果

3.1 不同時點4組大鼠BMMSCs活性比較 隨著培養時間延長，除了模型組外，其他3組大鼠BMMSCs相對增長率顯著升高，各時點差異均有統計學意義(P<0.05)。在培養第4、8、12、16天，模型組大鼠BMMSCs相對增長率均顯著低于正常組(P<0.05)，雌二醇組大鼠BMMSCs相對增長率均顯著高于模型組和艾灸組(P<0.05)；在培養第12、16天，艾灸組大鼠BMMSCs相對增長率顯著高于模型組(P<0.05)。見圖1。

注：與正常組比較，*P#P△PaPbPcP

3.2 4組大鼠BMMSCs中BGP含量比較 模型組大鼠BMMSCs中BGP含量顯著低于正常組(P<0.05)，雌二醇組和艾灸組大鼠BMMSCs中BGP含量顯著高于模型組(P<0.05)。見圖2。

注：與正常組比較，*P#P<0.05

3.3 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平均顯著下調(P<0.05)，Dkk1 mRNA相對表達水平顯著上調(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平均顯著上調(P<0.05)，Dkk1 mRNA相對表達水平顯著下調(P<0.05)；與雌二醇組比較，艾灸組Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平均顯著下調(P<0.05)，Dkk1 mRNA相對表達水平顯著上調(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、Dkk1、β-catenin、TCF mRNA相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與雌二醇組比較，△P<0.05

3.4 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相對表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠BMMSCs中Wnt3a、β-catenin、TCF蛋白的相對表達水平顯著下調，Dkk1蛋白的相對表達水平顯著上調，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，艾灸組和雌二醇組Wnt3a、β-catenin、TCF蛋白的相對表達水平顯著上調，Dkk1蛋白的相對表達水平顯著下調，差異均有統計學意義(P<0.05)；與雌二醇組比較，艾灸組Wnt3a、β-catenin蛋白的相對表達水平顯著下調(P<0.05)，TCF蛋白的相對表達水平下調(P>0.05)，Dkk1蛋白的相對表達水平顯著上調(P<0.05)。見圖3、表3。

4 討論

近年來的研究表明，BMMSCs在骨折愈合、骨質疏松癥的治療中發揮了重要的作用[6-7]。黃建華等[8]認為腎中所藏的先天之精主要相應于機體的胚胎干細胞及其他存在于各種人體組織器官中的成體干細胞，通常情況下，這些體內的干細胞是處于正常休眠的狀態，當受到外界刺激時，可激活、分化成機體各組織器官內在環境中所需要的細胞[9-10]。本次研究發現，艾灸三陰交、關元穴可增強BMMSCs的活性，使BGP水平升高。我們的既往研究也發現，針灸此兩穴可調節雌激素水平，增強骨密度[4,11]。

圖3 Western blot法檢測的4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相對表達水平

表3 4組大鼠BMMSCs中Wnt3a、Dkk1、β-catenin、TCF蛋白相對表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與雌二醇組比較，△P<0.05

結合本研究結果，說明骨密度的增加可能與針灸后BMMSCs的成骨分化作用增加有關。本研究選用的艾灸穴為關元、三陰交，均居治療骨質疏松癥常用穴位的前10位[12]，分屬任脈和脾經，具有健脾益氣、調肝補腎作用[13]和強身健體、補腎壯陽、調理沖任、理氣和血作用[14]。更有研究者證實艾灸可提高骨密度[15]。因艾灸時可“以之艾火，透諸經而除百病”(《本草從新》)，與中醫藥的其他治療方法一樣，其可通過艾灸特定的經穴，達到一定的臨床效應。

艾灸關元、三陰交穴提高骨密度的內在機制可能與其干預大鼠BMMSCs的Wnt/β-catenin信號通路有關。Wnt/β-catenin通路是Wnt信號轉導通路中的一條經典通路，也是與骨代謝關系密切的一個重要信號通路。當其激活時，Wnt3與跨膜蛋白LRP-5/6以及卷曲蛋白受體結合，抑制糖原合成酶激酶-3β磷酸化β-catenin，使β-catenin在細胞內蓄積。本研究發現，艾灸組相較于模型組，其大鼠BMMSCs中Wnt3a、LRP-5、LRP-6、β-catenin mRNA的表達均上調，且Wnt3a、β-catenin蛋白的表達水平亦升高。結果提示通過艾灸關元、三陰交穴可能激活BMMSCs的Wnt/β-catenin信號通路，阻止GSK3β對β-catenin的降解，使胞質內β-catenin蓄積，轉入細胞核內，與TCF/淋巴樣增強子1結合，調節靶基因的轉錄[16],從而促使BMMSCs向成骨細胞分化加強[17]。本研究也證實，在此信號激活轉導過程中細胞核內TCF mRNA及其蛋白的表達均明顯上調。

Wnt/β-catenin信號轉導通路中還有一些重要的負向調節因子[18]。Dkk1是常見的3個負向調節因子之一，是一種分泌性糖蛋白，研究發現Dkk1能與LRP5/6、跨膜受體Kremen 1/2結合形成三聚體，誘導細胞內吞，減少LRP5/6在細胞膜上的表達，從而阻斷Wnt信號繼續向胞內傳遞[19]。有學者認為，Dkk1在骨形成過程中起著重要作用，是骨質疏松、骨修復的治療靶點[20]。本研究發現，艾灸關元穴、三陰交穴后，相較于模型組，雌二醇組和艾灸組大鼠BMMSCs的Dkk1 mRNA和蛋白表達皆下調。因此，我們推測在該信號通路轉導過程中，艾灸關元、三陰交穴可能抑制了Dkk1 mRNA及其蛋白的表達，促使Wnt更易于與LRP5/6蛋白結合，從而激活Wnt信號通路，增強BMMSCs的成骨分化功能，有助于骨形成。許多研究也表明，阻斷Dkk1的功能有利于骨形成和防止系統性骨量丟失[21]。

本研究結果提示，艾灸關元、三陰交可以增強大鼠BMMSCs的活性，提高BGP水平，激活Wnt/β-catenin信號轉導通路，抑制通路中負向調節因子Dkk1的表達，從而使BMMSCs的成骨分化功能增強，恢復骨代謝平衡。本研究揭示了艾灸防治骨質疏松癥的內在機制，有助于尋找新的、有效的，能夠代替激素治療骨質疏松癥的方法。下一步將觀察艾灸頻次、艾灸量和艾灸時間對骨質疏松癥的影響，進一步探究艾灸激活Wnt/β-catenin信號轉導通路中“決定性”的信號靶點。