黃地安消膠囊對糖尿病認(rèn)知功能障礙大鼠神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究

宣瑋婷，蔡 標(biāo)，葉 婷，高華武，方朝暉，葉 樹，3，王 艷，汪 瀚

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所，安徽 合肥 230012；4.安徽省中藥復(fù)方重點實驗室，安徽 合肥 230012)

糖尿病認(rèn)知功能障礙(diabetic cognitive dysfunction，DCD)是2型糖尿病(type 2 diabetes melllitus，T2DM)一種嚴(yán)重的并發(fā)癥，慢性高血糖和高脂血癥是引起DCD的主要誘因[1-3]。慢性高血糖可觸發(fā)神經(jīng)損傷和內(nèi)皮功能障礙，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的發(fā)生[4-7]。慢性高血糖癥可促進(jìn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積，增加神經(jīng)細(xì)胞的敏感性，從而對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生Aβ神經(jīng)毒性[8]。Aβ沉積是癡呆發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致其他病理改變的起始環(huán)節(jié)[9]。因此，改善高血糖及清除Aβ沉積，能有效治療糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙。此外，高血糖刺激會加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步加重T2DM患者神經(jīng)細(xì)胞損傷，使突觸結(jié)構(gòu)和功能受損，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)記憶能力[10-11]。

黃地安消膠囊由黃連、生地黃、麥冬、葛根、枇杷葉、三七組成，具有清熱解毒、益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)之效，同時具有降低血糖、血脂和腦保護(hù)作用[12]。然而，黃地安消膠囊治療DCD的作用機(jī)制還不明確。本實驗采用腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)聯(lián)合雙側(cè)海馬注射Aβ25-35建立DCD大鼠模型[13]，期間給予不同劑量黃地安消膠囊，觀察黃地安消膠囊對DCD海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響，以凋亡信號Bax/Bcl-2為靶點探究其機(jī)制，為臨床治療DCD提供新方法。

1 材料

1.1 實驗動物 健康SPF級9周齡雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量為220～250 g，購自浙江省實驗動物中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2014-0001]，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實驗獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 實驗藥物 黃地安消膠囊(批號20150921)：由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供；多奈哌齊(批號1604044)：衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司；二甲雙胍(批號AAZ5285)：美國Merck Serono公司。

1.3 試劑與儀器 Aβ25-35、STZ：美國Sigma公司；Bcl-2、Bax兔抗大鼠抗體：Bioworld公司；Trizol試劑：美國Ambion公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國Thermo scientific公司；SYBR染料：日本TOYOBO公司；腦立體定位儀：美國Stoelting公司；RM2016病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；GA3型血糖儀及試紙：中國三諾生物傳感股份有限公司；042B R12088電泳儀：美國Bio-Rad公司；K3型酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher Scientific公司；FCM凝膠成像儀：美國 Protein Simple公司；7500 Real-time PCR儀：美國Applied Biosystems公司；Eclipse E100光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司。

2 方法

2.1 動物分組 將大鼠隨機(jī)分為7組：正常組、模型組、黃地安消高劑量組(12 g/kg，相當(dāng)于臨床等效量8倍)、黃地安消中劑量組(6 g/kg，相當(dāng)于臨床等效量4倍)、黃地安消低劑量組(3 g/kg，相當(dāng)于臨床等效量2倍)、二甲雙胍組(540 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效量3倍)、多奈哌齊組(1.4 mg/kg，相當(dāng)于臨床等效量3倍)，每組10只。

2.2 大鼠模型復(fù)制[13]除正常組外，其余6組大鼠予高脂飼料(飼料配方：70%常規(guī)飼料，10%豬油，5%蛋黃粉，0.5%膽固醇，10%蔗糖)喂養(yǎng)，喂養(yǎng)周期為4周。各組大鼠于第4周末進(jìn)行模型復(fù)制，在模型復(fù)制前1天17：00開始禁食不禁水，第2天9：00一次性腹腔注射STZ溶液(35 mg/kg)，STZ腹腔注射后72 h即檢測空腹血糖，高于11.1 mmol/L進(jìn)入下一步實驗。經(jīng)10%水合氯醛(380 mg/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在腦立體定位儀上，用微量注射泵分別將10 μL(5 μg)Aβ25-35緩慢注入雙側(cè)海馬(以前囟為原點，向后4.4 mm、旁開2.2 mm為穿刺點，自腦表面進(jìn)針3.0 mm)。以學(xué)習(xí)記憶減退、神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷及海馬CA1區(qū)Aβ沉積增多為模型復(fù)制成功的標(biāo)志。各組注射Aβ25-35前1周開始灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)28 d。正常組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，不予任何處理。

2.3 Morris水迷宮法檢測大鼠逃避潛伏期 給藥第23天開始進(jìn)行訓(xùn)練，前4天常規(guī)訓(xùn)練，每日1次，分別從水迷宮的4個象限將大鼠背對隱藏在水面下的平臺放入水中，記錄大鼠90 s尋找到水下平臺所需時間，為逃避潛伏期。若大鼠找不到平臺，將其引至平臺，記錄逃避潛伏期為90 s。第5天，測試大鼠從第3象限找到平臺的時間，為最終數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)的采集和處理由Morris水迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

2.4 檢測空腹血糖變化 分別于模型復(fù)制前、模型復(fù)制后及給藥后，各組大鼠尾靜脈無菌操作后用采血針取血，用血糖儀測定各組大鼠禁食12 h的空腹血糖。

2.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷情況 將固定的腦組織包埋，切片厚度為5 μm，行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷情況并拍照。

2.6 免疫熒光法檢測大鼠海馬中Aβ沉積 “2.3”“2.4”“2.5”實驗結(jié)果表明，黃地安消中劑量組具有最好的藥效，故進(jìn)行機(jī)制探討時選擇黃地安消中劑量組進(jìn)行后續(xù)的實驗。PBS沖洗3次，每次5 min；加入BSA孵育30 min；加入Aβ抗體孵育24 h；洗滌后，加入二抗孵育50 min；PBS洗滌后，加入DAPI孵育50 min；沖洗并蓋上抗熒光淬滅劑封片；采用熒光顯微鏡采集圖像，用IPP 6.0軟件進(jìn)行計算。

2.7 Western blot法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平 經(jīng)提取海馬組織總蛋白，分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗Bcl-2、Bax，加入二抗IgG，加入ECL試劑，曝光并拍照，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析灰度值。β-actin作為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次。

2.8 熒光定量PCR法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax mRNA的含量 采用Trizol法提取海馬總mRNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用7500 Real-time PCR儀檢測，反應(yīng)條件包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)，每個樣本重復(fù)3個孔。本研究所用的引物序列：

Bax：上游5′- CCAGGACGCATCCACCAAG AAG-3′，下游5′- GCTGCCACACGGAAGAAGAC C-3′；

Bcl-2：上游5′-ACGGTGGTGGAGGAACTCT TCAG-3′，下游5′-GTGCAGATGCCGGTTCAG GTAC-3′；

β-actin：上游5′-TTGATTTGGCTGGTAGA A-3′，下游5′-ATGGCAGAAGATTGAGAA-3′。 采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 與正常組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，黃地安消高、中劑量組，二甲雙胍及多奈哌齊組逃避潛伏期均減少(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 各組大鼠空腹血糖水平比較 模型復(fù)制前各組大鼠空腹血糖比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型復(fù)制后，與正常組比較，模型組大鼠空腹血糖明顯升高(P<0.05)；給藥28 d后，與模型組比較，黃地安消高、中劑量組，二甲雙胍組及多奈哌齊組大鼠空腹血糖水平均降低(P<0.05)。見圖1。

注：A.正常組；B.模型組；C.黃地安消高劑量組；D.黃地安消中劑量組；E.黃地安消低劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；與正常組比較，*P#P<0.05

3.3 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷情況比較 正常組細(xì)胞排列緊密，神經(jīng)細(xì)胞和細(xì)胞核形態(tài)完整。模型組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞間隙變大，數(shù)量減少，多見體積縮小、胞核固縮伴有破裂的死亡的神經(jīng)細(xì)胞。黃地安消中劑量組、二甲雙胍組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列較緊密，染色均勻，神經(jīng)細(xì)胞損傷較少。黃地安消高、低劑量組大鼠海馬有部分神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷，多奈哌齊組大鼠海馬可見部分損傷的神經(jīng)細(xì)胞。見圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.黃地安消高劑量組;D.黃地安消中劑量組;E.黃地安消低劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;箭頭所示處為海馬神經(jīng)細(xì)胞

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞組織學(xué)變化(HE染色，10×40倍)

3.4 各組大鼠海馬Aβ沉積情況 正常組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ沉積較少，模型組大鼠海馬CA1區(qū)發(fā)現(xiàn)大量Aβ沉積，而黃地安消膠囊中劑量組、二甲雙胍和多奈哌齊組大鼠海馬CA1區(qū)Aβ沉積較少。見圖3。

3.5 各組大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組Bax蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，黃地安消中劑量組、二甲雙胍組、多奈哌齊組Bax蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。見圖4。

3.6 各組大鼠海馬組織中Bax、Bcl-2 mRNA含量比較 與正常組比較，模型組海馬組織中Bax mRNA含量明顯增加(P<0.05)，Bcl-2 mRNA含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，黃地安消中劑量組、二甲雙胍組、多奈哌齊組Bax mRNA含量均明顯降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA含量均明顯升高(P<0.05)。見圖5。

4 討論

認(rèn)知功能下降和T2DM關(guān)系密切。研究[14-15]表明，糖尿病影響神經(jīng)系統(tǒng)。高血糖被認(rèn)為是糖尿病患者認(rèn)知能力下降的一個決定性原因，因此，控制血糖對改善糖尿病引起的認(rèn)知功能障礙是很有必要的[4]。此外，有研究[16]證實，海馬細(xì)胞凋亡是引起海馬神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，海馬萎縮，繼而引起認(rèn)知功能障礙的重要原因之一。因此，高血糖引起的Aβ沉積導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙是本實驗重點研究對象。本實驗采用腹腔注射STZ溶液聯(lián)合Aβ25-35雙側(cè)海馬注射進(jìn)行模型復(fù)制后，模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，空腹血糖水平升高，海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷，Aβ沉積增加，表明本實驗成功復(fù)制DCD動物模型。

注:A.正常組;B.模型組;D.黃地安消中劑量組;F.二甲雙胍組;G.多奈哌齊組;箭頭所示處為Aβ沉積處

圖3 各組大鼠海馬Aβ沉積情況(DAPI染色， 10×40倍)

注：A.正常組；B.模型組；D.黃地安消中劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；與正常組比較，*P#P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；D.黃地安消中劑量組；F.二甲雙胍組；G.多奈哌齊組；與正常組比較，*P#P<0.05

黃地安消膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，以黃連清熱燥濕、瀉火解毒，清解肺胃之燥熱；生地黃清熱生津、滋陰養(yǎng)血，養(yǎng)心、腎之陰；葛根解肌退熱、生津止渴，清退肺胃之熱；麥冬養(yǎng)陰潤肺、益胃生津、清心除煩；枇杷葉清降肺胃之氣；三七化瘀止血；全方共奏清熱解毒、養(yǎng)陰生津、活血通絡(luò)之功效。黃地安消膠囊能夠改善胰島素抵抗，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，降低血糖。本研究顯示，黃地安消膠囊可明顯改善DCD動物模型學(xué)習(xí)記憶能力，減少海馬神經(jīng)損傷，降低空腹血糖，減少Aβ沉積。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在T2DM的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，其啟動的凋亡途徑是近幾年來新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡途徑[17]。Bcl-2和Bax為Bcl-2家族的兩個成員，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡過程。其中Bax是一種促凋亡蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)Bcl-2表達(dá)較多時，與Bax形成異源二聚體，減緩細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bax表達(dá)增多時，形成大量Bax同源二聚體，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[18-19]。本實驗結(jié)果表明，模型組大鼠Bax蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯降低。經(jīng)黃地安消膠囊治療后，模型組Bax蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量及mRNA含量均明顯升高。

本次研究結(jié)果表明，黃地安消膠囊可通過降低血糖，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及清除Aβ沉積來改善認(rèn)知功能障礙，調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號通路可能是其潛在的作用機(jī)制。