常壓蒸制法炮制草烏的質量研究

王芳靜，楊紫瑩，金傳山，張 偉，唐傳華，于 杰

(1.安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽省萬生中藥飲片有限公司，安徽 阜陽 236112；3.安徽省中藥飲片炮制加工工程研究中心，安徽 阜陽 236112)

制草烏為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)干燥塊根的炮制加工品，具有祛風除濕、溫經止痛等功效[1]。通過加水、加熱等炮制工藝處理后，可使生草烏中極毒的雙酯型生物堿轉化成相應的單酯型生物堿，并可進一步水解后，轉化成親水性氨基醇類烏頭原堿，毒性大大降低，而療效仍存[2-4]。制草烏的炮制方法眾多，如煮制、蒸制、黑豆制、甘草制、訶子制[5]，目前多采用《中華人民共和國藥典》收載的常壓水煮法。然而研究發現，經過長時間的浸泡、水煮后，不僅會造成草烏中雙酯型生物堿水解過多以及總生物堿流失嚴重[6-7]，影響其臨床使用的藥效，且生產過程中產生過多的煮制廢水，若不經減毒處理直接排入環境中，不僅對環境中動植物產生危害，最終可能也會危害人類健康。在產業化實際生產中，常壓蒸制法較《中華人民共和國藥典》水煮法有操作簡單、省時、節能、減少水污染及能較大限度地保留有效成分等優勢而同時存在，但是由于常壓蒸制法相關炮制資料較少，對其主要影響因素缺乏系統的考察，評價指標單一等，制草烏飲片質量參差不齊，嚴重影響到臨床用藥的安全性。本試驗擬采用L9(33)正交試驗法對常壓蒸制生產制草烏的主要影響因素進行考察，并且與2015年版《中華人民共和國藥典》制草烏項下水煮法生產的制草烏進行比較，以草烏中雙酯型生物堿、單酯型生物堿的含量及炮制品的外觀評分為指標優選制草烏常壓蒸制工藝，以期建立一個“減毒存效”、工藝可操作性強的炮制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Fisher UltiMate 3000高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；400A多功能粉碎機：浙江省永康市紅太陽機電有限公司；AUW120D百萬分之一精密天平：日本島津；FR224CN電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司；VP-1旋片式真空泵：浙江省臺州正空泵業有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州潤華電器有限公司；德國IKA RV 3旋轉蒸發器：河南省鞏義市予華儀器有限責任公司；JK-300DVB三頻數控超聲波清洗器：安徽省合肥金尼克機械制造有限公司；BGZ-140博迅電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 試藥 烏頭堿對照品(批號900100-170731，純度≥98.0%)、次烏頭堿對照品(批號900101-161213，純度≥98.0%)、新烏頭堿對照品(批號900102-161215，純度≥97.8%)、苯甲酰烏頭原堿對照品(批號900103-181002，純度≥98.0%)、苯甲酰次烏頭原堿對照品(批號900105-180331，純度≥96.0%)、苯甲酰新烏頭原堿對照品(批號900104-180528，純度≥95.3%)：均購自江蘇省永健醫藥科技有限公司；乙腈、四氫呋喃為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。生草烏(產地四川，批號 Y180622)由安徽省萬生中藥飲片有限公司提供，經安徽中醫藥大學藥學院劉守金教授鑒定為毛茛科植物北烏頭(AconitumkusnezoffiiReichb.)的干燥塊根。

2 方法與結果

2.1 6種烏頭類生物堿含量測定 按照文獻[1,8]方法測定生物堿含量。

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取烏頭堿5.29 mg、次烏頭堿5.29 mg、新烏頭堿5.28 mg、苯甲酰烏頭原堿5.41 mg、苯甲酰次烏頭原堿5.20 mg、苯甲酰新烏頭原堿5.57 mg，分別加至5 mL容量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得對照品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ貯備液。分別從上述對照品貯備溶液中精密吸取0.35、0.15、0.50、0.25、1.00、0.80 mL至10 mL容量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定質量，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25 ℃以下)30 min，放冷，再稱定質量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液使溶解，轉移至5 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱為Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-四氫呋喃(25∶15)為流動相A，以0.1 mol/L醋酸銨溶液(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動相B；梯度洗脫(0～48 min，15%～26% A；48～48.1 min，26%～35% A；48.1～58 min，35% A；58～65 min，35%～15% A)；檢測波長為235 nm，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為5 μL。取“2.1.1”項下混合對照品溶液和“2.1.2”項下供試品溶液，按此色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。各成分分離度均大于1.5；理論板數按苯甲酰新烏頭原堿計算大于8 000；信噪比大于10；拖尾因子T為0.95～1.05；采用外標法，對照品溶液連續進樣5針，其峰面積測量值相對標準偏差均小于2.0%。色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.生草烏；C.《中華人民共和國藥典》水煮法制草烏；D.常壓蒸制法制草烏；

1.苯甲酰新烏頭原堿；2.苯甲酰烏頭原堿；3.苯甲酰次烏頭原堿；4.新烏頭堿；5.次烏頭堿；6.烏頭堿

圖1 草烏的高效液相色譜圖

2.1.4 標準曲線的制備 精密稱取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿對照品適量，加入異丙醇-三氯甲烷(1∶1)混合溶液定容，搖勻，得對照品儲備液。精密吸取上述對照品儲備液適量，逐級稀釋至對應濃度，精密吸取混合對照品溶液5 μL，按上述色譜條件測定，以6種生物堿對照品的峰面積(A)為縱坐標，濃度(ρ)為橫坐標，制作標準曲線。烏頭堿的標準曲線：A=180.07ρ+0.541 5(r=0.999 9)；線性范圍：13.2～211.6 μg。次烏頭堿的標準曲線：A=125.03ρ+1.205 3(r=0.999 6)；線性范圍：26.5～423.2 μg。新烏頭堿的標準曲線：A=86.925ρ+5.584 8(r=0.999 8);線性范圍：149.4～2 390.0 μg。苯甲酰烏頭原堿的標準曲線：A=112.16ρ-0.018 6(r=0.999 5)；線性范圍：1.3～20 μg。苯甲酰次烏頭原堿的標準曲線：A=131.14ρ-0.013 6(r=0.999 5)；線性范圍：1.8～28.9 μg。苯甲酰新烏頭原堿的標準曲線：A=87.27ρ+0.227(r=0.999 8)；線性范圍：11.1～178.2 μg。

2.2 常壓蒸制法工藝的研究

2.2.1 炮制工藝的優選 考察3個試驗因素，分別為浸泡時間(3、4、5 d對應的水平分別為1、2、3)、蒸制時間(6、7、8 h對應的水平分別為1、2、3)、干燥溫度(50、60、70 ℃對應的水平分別為1、2、3)。取大小均勻的生草烏樣品9份，每份500 g，按照L9(33)正交表(見表1)的順序進行炮制，取出晾涼，切薄片，置于鼓風干燥箱中干燥，即得。

表1 L9(33)正交表

2.2.2 綜合評分值的確定 本試驗對各指標進行“隸屬度”計算，對于欲達到最大值的指標(如單酯型生物堿含量和外觀評分)，其指標隸屬度=(指標值-指標最小值)/(指標最大值-指標最小值)；對于限量指標(如雙酯型生物堿含量)，其指標隸屬度=(指標最大值-指標值)/(指標最大值-指標最小值)。可見，指標最大值的隸屬度為1，而限量指標的隸屬度為0，所以0≤指標隸屬度≤1[9-10]。為確保草烏的安全性和有效性并存，既要提高單酯型生物堿的含量，也要避免雙酯型生物堿的全部流失、水解，同時需考慮到飲片外觀性狀。因此試驗設計其炮制品的權重為總單酯型生物堿占45%，總雙酯型生物堿占35%，外觀評分占20%。綜合評分=總單酯型生物堿含量的隸屬度×45%+總雙酯型生物堿總含量的隸屬度×35%+炮制品外觀評分的隸屬度×20%，滿分為1.00。

本試驗對制草烏飲片的外觀評分進行規定，滿分為5分。其中色澤分為“黑褐色”(5分)、“淡黑褐色”(3分)、“灰褐色”(1分)；質地分為“質地實，質脆”(5分)、“質地實，較為脆”(3分)、“質較軟”(1分)；氣味分為“氣微，微有麻舌感”(5分)、“氣微，有麻舌感”(3分)、“氣微，麻舌感強烈”(1分)。正交試驗綜合評分結果見表2，極差分析結果見表3。

表3 正交試驗結果的極差分析

2.2.3 試驗結果分析 采用一般線性模型分析3個試驗因素對綜合評分的主效應，方差分析結果(見表4)顯示，影響制草烏常壓蒸制因素的主次順序為蒸制時間、干燥溫度、浸泡時間，其中蒸制時間對綜合評分的主效應有統計學意義(P<0.05)。通過綜合分析確定制草烏常壓蒸制的最佳工藝：生草烏用常溫(25 ℃)水浸泡4 d后，隔水蒸制8 h，取出晾涼，切薄片，置于70 ℃鼓風干燥箱中干燥。

表4 試驗因素對綜合評分影響的方差分析結果

2.2.4 最佳工藝驗證 為進一步驗證結論的準確性，均勻稱取生草烏3份，每份500 g，按正交試驗得出的最佳工藝方法進行炮制試驗，對炮制品中雙酯型、單酯型生物堿進行測定，含量測定方法同前，結果見表5。結果顯示，制草烏常壓蒸制品的雙酯型生物堿包括烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的總含量為0.004 9%～0.006 8%，單酯型烏頭堿包括苯甲酰烏頭堿、苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰次烏頭堿的總含量為0.044 8%～0.056 7%，符合2015版《中華人民共和國藥典》規定的制草烏標準。

表5 常壓蒸制工藝驗證結果(n=3)

注：樣品A為生草烏；B1～B3為3批常壓蒸制的制草烏，烏頭堿成分均未測出，外觀評分均為13。

3 討論

本實驗考察了不同進樣容積對高效液相色譜峰的影響，結果發現進樣容積為6～10 μL時，色譜峰前延嚴重；進樣容積為5 μL時，主要色譜峰的分離度和峰型均達到最佳，基線也較平穩，噪音干擾較少。草烏經合理炮制后由于雙酯型烏頭堿類成分的分解破壞而使其毒性降低，鎮痛、抗炎作用仍然很明顯，但若炮制太過，水解全無，則藥效降低，所以應適當保留雙酯型生物堿更為合理[8，11-12]。本實驗選擇以“減毒存效”為目標，以單酯型生物堿占評分的45%，雙酯型生物堿占評分的35%，外觀性狀占評分的20%的綜合質量評價方法，對常壓蒸制法的制草烏進行質量評價。

2015年版《中華人民共和國藥典》制草烏項下對其6種生物堿的含量規定為雙酯型生物堿含量不高于0.040%，單酯型生物堿含量為0.020%～0.070%。本次實驗結果表明，生草烏雙酯型生物堿含量為0.358 8%，單酯型生物堿含量為0.029 1%；《中華人民共和國藥典》水煮法制草烏雙酯型生物堿含量為0.002 2%，單酯型生物堿含量為0.036 2%；常壓蒸制法制草烏雙酯型生物堿含量為0.004 9%～0.006 8%，單酯型生物堿含量為0.044 8%～0.056 7%，均符合《中華人民共和國藥典》的限量要求。與生草烏相比，草烏經過加水、加熱處理后，極毒的雙酯型生物堿明顯水解減少，單酯型生物堿明顯增加；與《中華人民共和國藥典》水煮法制草烏相比，常壓蒸制法制草烏的單、雙酯型生物堿總量均高于《中華人民共和國藥典》水煮法，這表明常壓蒸制法可以在達到減毒的同時能夠較大限度地保留草烏中有效成分。

目前草烏的軟化方式主要為清水浸泡法，由于四季溫差較大，致使草烏藥材“浸泡至內無干心”所需的時間不固定，一般為2～7 d，且浸泡時間過長或水溫過高極易出現霉變現象。制草烏的《中華人民共和國藥典》水煮法沒有具體的工藝參數，主要依靠傳統炮制經驗控制炮制程度，實驗室前期以《中華人民共和國藥典》的方法為基礎研究并確定了常壓煮制法的工藝，即在常溫下(25 ℃)浸泡5 d，常壓下加水煮6 h，取出晾涼，切薄片，置于50 ℃鼓風干燥箱中干燥，即得。本試驗優選出草烏常壓蒸制工藝，僅需在常溫(25 ℃)下浸泡4 d，隔水蒸制8 h，置于70 ℃鼓風干燥箱中干燥，即得。與《中華人民共和國藥典》水煮法比較，本試驗優選出的常壓蒸制工藝大大縮短了工時，減少了煮制廢水的產生，并且避免了草烏浸泡時間過長或水溫過高導致發霉現象及生物堿的大量流失，減毒效果好，有效成分含量高，是一種較理想且可適用于產業化大生產的炮制方法。實驗驗證結果也表明，該制草烏炮制工藝的重復性較好，具有一定的可行性。