離體百合鱗莖發育及淀粉合成酶基因LohGBSSI的克隆與表達

閔芮涵，孫敏譯，吳 昀，李世琦，夏宜平

（浙江大學 農業與生物技術學院 園林研究所，浙江 杭州310058）

百合Lilium spp.是百合科Liliaceae百合屬Lilium多年生草本球根植物，被譽為 “球根花卉之王”，具重要觀賞及食藥用價值[1]。百合鱗莖發育是影響百合質量的關鍵過程，在百合生命周期中伴隨著源-庫關系的轉換[2]；采用離體手段開展百合小鱗莖發育生物學研究，具可控、高效、材料一致性強等優勢[3]。百合鱗莖的主要儲藏物質為淀粉，占干物質量的60%以上，包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，淀粉代謝被認為參與調控百合鱗莖發育[4]。淀粉合成酶（starch synthase,SS）是淀粉生物合成過程中的關鍵酶之一，主要有顆粒結合淀粉合成酶（granule-bound starch synthase,GBSS）和可溶性淀粉合成酶（soluble starch synthase,SSS）2種，分別參與直鏈和支鏈淀粉的合成。其中，GBSS能通過α-1,4-D-糖苷鍵將腺苷二磷酸葡萄糖中的葡萄糖殘基添加到葡聚糖的非還原端，延長葡聚糖的直鏈，是直鏈淀粉合成過程中的關鍵酶[5]；常見GBSSⅠ（30～70 kD）和 GBSSⅡ（70～100 kD）等 2 種同工酶。 目前， 已從擬南芥 Arabidopsis thaliana[6]、 馬鈴薯Solanum tuberosum[7]等植物中克隆得到GBSS基因，且發現GBSSI的缺失會造成直鏈淀粉的合成受阻，導致植物體內直鏈淀粉缺失[8]。前期研究發現：離體鱗莖促進型處理（低濃度多效唑，5×10-4mmol·L-1），GBSS酶活性顯著增強[9]。然而， 針對百合 GBSS基因的克隆及表達特性研究仍較匱乏[10]，制約了百合鱗莖發育機制的進一步深入探討。本研究以東方百合‘索邦’Lilium oriental‘Sorbonne’離體苗為材料，通過形態觀察和淀粉含量測定，判斷其庫-源關系轉換，準確劃分小鱗莖膨大過程發育時期；結合前期轉錄組測序數據，利用cDNA末端快速擴增技術（RACE）克隆‘索邦’顆粒結合淀粉合成酶基因（LohGBSS），并通過定量即時聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）技術分析該基因在不同組織及發育時期的表達模式，為研究LohGBSS在離體百合淀粉合成及鱗莖發育過程中的調控機制和百合淀粉品質育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為浙江大學園林研究所組培室的東方百合‘索邦’組培材料。無菌培養室光強為60 μmol·m-2·s-1， 溫度為（25±2） ℃。

1.2 研究方法

1.2.1 離體小鱗莖發育過程中的形態學觀測 根據本實驗室建立的鱗莖發育生物學研究體系獲得足量單芽[3]，并作一定改動（成球培養基為50 mL，試驗期可提供充足養分）。將芽轉入含MS（70 g·L-1蔗糖+8 g·L-1瓊脂）[11]的成球培養基中，轉入后0、15、25、35、45、55和75 d觀察并拍照，統計小鱗莖直徑和鮮質量，計算 0～15（P1）、15～25（P2）、25～35（P3）、 35～45（P4）、 45～55（P5）和 55～75 d（P6）的鱗莖膨大速率。

1.2.2 離體小鱗莖發育過程中淀粉質量分數的測定 對應形態學觀測時間點，隨機選取生長狀況良好的小鱗莖，切掉葉片和根部，將剩余部位切碎混勻后稱量0.3 g，液氮速凍30 min后轉入-80℃冰箱中保存，采用蒽酮法測定淀粉質量分數[1]，重復3次取平均值。計算P1、P2、P3、P4、P5和P6各期的淀粉累積率。

1.2.3 LohGBSS基因cDNA 5′和3′端序列的獲得 采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）提取‘索邦’鱗莖總RNA[1]，通過blastx數據庫對基因進行同源性比對，從前期轉錄組數據中[1]得到LohGBSS cDNA序列片段，采用Beacon Designer 7軟件設計3′端和5′端RACE端引物。使用Clontech SMARTerRACE 5′/3′試劑盒（Takara 公司）合成第 1 鏈 cDNA， 克隆得到 LohGBSS cDNA 5′和 3′端序列（參照試劑盒）。對RACE產物進行回收、加Poly尾、純化，連接至pGEM-T載體上，轉化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α的感受態細胞，篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.2.4 LohGBSS基因的qRT-PCR分析 利用實時熒光定量PCR技術對LohGBSS在不同組織（葉、莖段、鱗莖、根）及不同時期（0、15、45、60和75 d）的表達特性進行分析。根據LohGBSS的cDNA序列，設計特異引物，上游引物：5′-AGGAAGGATTCACTGGATT-3′，下游引物：5′-TTGGACATAGGAGCGATT-3′。 以GAPDH為內參基因， 上游引物： 5′-GAATGGCAAGCTAACTGGAATG-3′， 下游引物： 5′-CAGCCTTGATCTGATCGTAAGT-3′。利用CFX ConnectTM 熒光定量 PCR檢測系統（Bio-Rad公司）分析LohGBSS的表達特性。PCR反應條件為：95℃，2 min；95℃，5 s；60℃，30 s；39個循環。用比較Ct值法計算相對表達量。重復3次取平均值。

1.2.5 統計學分析 鱗莖膨大速率（g·株-1·d-1）=m鮮（1+n）-m鮮n/t， 淀粉積累率=[w淀粉（1+n）-w淀粉n]/w淀粉n， 其中：n=（1， 2， 3， 4， 5， 6）[1]， 即為相鄰取樣點， t為相鄰 2 次取樣間隔天數（d）。 運用 WPS Excel 2018 及SPSS 17.0軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 小鱗莖發育過程生長狀態

小鱗莖轉入成球培養基后，培養基提供主要養分，離體植株持續發育。15 d時即可明顯觀察到根的形成，根數及根長不斷增加；葉片在轉接后5～6 d抽出，葉面積擴大；培養至45 d，葉片出現黃化（圖1）。小鱗莖直徑在實驗期間快速增長，至75 d時達1.93 cm（表1），小鱗莖鮮質量具相似變化趨勢。以2次觀測間隔為階段， 計算鱗莖膨大速率可知： P2（15～25 d）時最高， 為 0.048 g·株-1·d-1（圖 2）。

表1 ‘索邦’離體小鱗莖發育形態指標Table 1 Developmental morphological indexes of‘Sorbonne’ bulblets

圖1 ‘索邦’離體小鱗莖發育情況Figure 1 Growth status of‘Sorbonne’ bulblets during different developmental stages

圖2 ‘索邦’小鱗莖膨大速率變化Figure 2 Swelling rate changes during different developmental stages of‘Sorbonne’ bulblet

2.2 小鱗莖淀粉質量分數變化

在小鱗莖發育期間，淀粉質量分數總體呈遞增規律，但在15～45 d時變化不大，甚至略有下降（圖3A）；鱗莖膨大與淀粉質量分數呈正相關，相關系數為0.90。淀粉積累速率在P1（0～15 d）階段最高，為9.29，表明在小鱗莖膨大初期，淀粉需快速積累以供鱗莖形態建成，P2（15～25 d）階段迅速降低，之后變化趨于平穩，但在P4（25～45 d）階段淀粉積累率出現負值，說明淀粉被消耗，可能用于地上部及鱗莖的庫源平衡，隨后又出現明顯積累（圖3B）。

圖3 ‘索邦’小鱗莖發育過程中淀粉質量分數及積累率Figure 3 Changes in starch content and starch accumulation rate during different developmental stages of‘Sorbonne’ bulblet

2.3 ‘索邦’LohGBSS基因cDNA全長序列分析

采用5′RACE技術擴增得到1條長度為283 bp（圖4A）的基因序列，采用3′RACE技術擴增得到1條長度為769 bp（圖4B）的基因序列。將所得的5′和3′端序列與LohGBSS cDNA中間序列拼接，得到全長為1 913 bp的LohGBSS cDNA序列，包含1個1 665 bp的開放閱讀框（ORF），共編碼554個氨基酸（圖5）。

圖 4 LohGBSS 5′和 3′端 RACE 產物Figure 4 RACE product of 5′（A）and 3′cDNA （B）of LohGBSS

2.4 LohGBSS基因序列分析

將百合LohGBSS與其他植物GBSS基因的氨基酸序列在MEGA 6軟件中進行比對分析，并用Neighbor-Joining算法構建系統進化樹，結果發現：百合LohGBSS和蘭州百合、玉米Zea mays等親緣關系較近（圖 6）。

將百合LohGBSS基因編碼的氨基酸序列在NCBI Blastn中比對，發現該序列與蘭州百合（AJG44453.1）的同源性最高，達92.00%，與海棗Phoenix dactylifera（XP_008775302.1）的同源性達69.00%，與大豆Glycine max（XP_003556431.1）的同源性達67.00%。用DNAMAN軟件將LohGBSS氨基酸序列與GenBank中其他植物的GBSS序列進行比對，發現與蘭州百合、馬鈴薯、玉米的GBSS氨基酸序列一致性分別達86.36%、61.80%、59.55%（圖7）。

通過ProtParam軟件（http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam）分析發現：LohGBSS基因編碼的多肽分子量約為60.89 kD，推測的等電點為6.08，帶負電荷的氨基酸殘基數（天冬氨酸和谷氨酸）為65個，帶正電荷的氨基酸殘基數（精氨酸和賴氨酸）為61個，總平均疏水性為-0.112，為親水性蛋白，不穩定系數為28.12，表明該蛋白是穩定的。通過TMHMM 2.0軟件對LohGBSS氨基酸序列的跨膜區進行分析，結果顯示：554個氨基酸全部位于膜外，表明該蛋白均不具有跨膜區，不是跨膜蛋白。利用SMART軟件對百合LohGBSS編碼的GBSS蛋白結構域進行分析（圖8A），發現其具有1個淀粉合成酶催化域（Glyco_transf_5）和2個糖基轉移酶結構域（Glyco_transf_1和Glyco_transf_1_4）。

利用SWISS-MODEL預測LohGBSS蛋白的三級結構（圖8B），結果顯示：其與同為單子葉植物的水稻Oryza sativa GBSSⅠ催化域晶體結構的一致性達69.29%，與大麥Hordeum vulgare GBSSI催化域結構的一致性達44.82%。推測該基因可能是百合GBSSI基因，將其命名為LohGBSSI。

2.5 LohGBSSI基因表達分析

對LohGBSSI在‘索邦’不同組織中的表達進行分析（圖9A），發現60 d時LohGBSSI在鱗莖中的表達量最高，在葉中的表達量高于莖段，在根中的表達量最低。差異顯著性分析發現：LohGBSSI在葉和鱗莖中的表達較莖段和根差異顯著，但兩者無顯著性差異，在莖段和根中的表達也無明顯差異。對鱗莖中LohGBSSI在‘索邦’不同發育時期的表達進行分析（圖9B），發現LohGBSSI在15 d時表達量最高，0～15 d增加幅度較大，其后開始減少，45 d之后變化較小，差異不顯著。

圖5 LohGBSS cDNA序列及其推測氨基酸序列Figure 5 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of LohGBSS in lily

圖6 植物GBSS基因氨基酸序列的聚類分析Figure 6 Phylogenetic analysis of GBSS from different plant species

圖7 百合GBSS與其他植物GBSS的同源性比較Figure 7 Comparison of GBSS in lily with that in other species

圖8 百合GBSS蛋白功能域分析和單體三級結構預測Figure 8 Functional domains analysis and predicted monomer 3D structure of GBSS in lily

圖9 百合LohGBSSI在不同組織及不同取樣時間的相對表達量Figure 9 Relative expression of LohGBSSI in different tissues and different time

3 討論與結論

培養基中添加的蔗糖可保證小鱗莖膨大所需養分[1]。前期研究發現，若僅在轉接初期添加碳源，可獲得的最大小鱗莖直徑及鮮質量分別為8.81 mm及256 mg；轉接75 d時，由于 “碳饑餓”的發生，鱗莖最終鮮質量僅為160 mg[4]。本研究發現：通過使用充足的培養基，最大鱗莖直徑可達1.93 cm，為前者的2.19倍，鮮質量可達2.02 g，為前者的7.89倍。表明加倍碳源可獲得2倍以上的鱗莖膨大效益。

離體條件，小鱗莖在發育過程中常是 “源-庫復合體”的狀態，會隨著發育過程不斷轉換，主要取決于培養基中的碳供應[2]。在小鱗莖膨大初期（0～15 d），能量物質主要來自于培養基，轉接芽快速響應并形成小鱗莖，此時初生小鱗莖僅擔任 “庫”的功能，集中體現在淀粉合成相關基因如LohGBSSI在15 d時高表達（圖9A），且此時淀粉質量分數亦有顯著積累（圖3A），表明淀粉積累為芽鱗片化（即小鱗莖形成）所必需。隨著葉片和根的不斷形成，在小鱗莖快速膨大期（15～55 d），葉片光合作用產生的同化物與培養基中的蔗糖共同供應小鱗莖及植株的生長發育，此時的小鱗莖既擔任 “庫”的功能，也與葉片之間形成雙向運輸，擔任 “源”的功能，是 “源-庫復合體”的狀態。具體而言，25～45 d淀粉積累率出現負值（圖3B），淀粉被消耗，地上部葉片數增加（圖1）；相應地，25～35 d時小鱗莖膨大速率跌至最低點（圖2B），可以推測此時同化物大多轉運至葉片，保證葉片的營養生長，小鱗莖主要擔負 “源”的功能。45 d后小鱗莖葉片面積幾乎無變化，小鱗莖內部淀粉含量又開始迅速積累（圖3），膨大速率加快。45 d小鱗莖內部LohGBSSI基因的相對表達量較15 d時顯著降低，但仍處于較高水平，這也與小鱗莖淀粉快速積累的結果相符（圖3）。因此，根據小鱗莖發育過程中淀粉積累速率及膨大速率，及其源-庫關系轉換，可將小鱗莖的膨大過程分為：0～15 d，小鱗莖膨大初期，此時主要為鱗莖形態建成；15～55 d，小鱗莖快速膨大期，以源-庫復合體的形式保證鱗莖膨大；55～75 d，小鱗莖膨大后期，鱗莖內含物的進一步充實。百合離體大球在移栽后存活率高，且生長更快[1]，應重點調控小鱗莖快速膨大期，關注其源-庫復合體的特殊狀態，這與吳沙沙[2]在‘索邦’地栽球的研究結果類似。

GBSSI主要負責植物直鏈淀粉的合成，過表達或抑制GBSSI基因的表達，會導致淀粉中直鏈淀粉的含量上升或降低[12]。關于GBSS的分子水平研究主要以水稻、小麥、馬鈴薯等作物的淀粉品質育種為主。有研究表明：GBSSI既影響大麥籽粒淀粉支鏈淀粉濃度，還和支鏈淀粉的鏈長有關[13]。在木薯Manihot esculenta中，CRISPR-Cas 9介導的直鏈淀粉生物合成相關的2個基因的靶向突變，即蛋白靶向淀粉（PTST1）或顆粒結合淀粉合成酶（GBSS），可以降低或消除根淀粉中的直鏈淀粉含量[14]。GBSS的活性對馬鈴薯中直鏈淀粉與支鏈淀粉比例、淀粉鏈長及結構特性有很大影響[15]。

本研究用整齊一致的‘索邦’離體材料克隆得到LohGBSS（GenBank登錄號：MF101407.1）。LohGBSS cDNA全長為1 913 bp，開放閱讀框長1 665 bp，編碼554個氨基酸，編碼的蛋白分子量約60.89 kD，與蘭州百合GBSSI的同源性較高，達92%，與其他物種GBSSI的同源性達65%～69%，故推測該基因可能是百合GBSSI基因，將其命名為LohGBSSI。LohGBSSI編碼的蛋白具有1個以ADP-葡萄糖為葡萄糖供體的淀粉合成酶催化域和2個將糖分從活躍供體轉移至特定受體的糖基轉移酶結構域。三級結構預測表明：其與水稻GBSSⅠ催化域晶體結構十分相似，表明該蛋白具有淀粉合成功能。

在木薯中，GBSSI基因在莖的表達量最高，在塊根發育過程中僅在形成期和成熟期表達[16]；在黃芪Astragalus membranaceus中，GBSSI基因在毛狀根及根中的表達量高于莖和葉[17]。而LohGBSSI在‘索邦’的葉、莖段、鱗莖和根中均有表達，雖在鱗莖中的表達量最高，但與葉片無顯著差異（圖9），推測其可能在百合鱗莖和葉的直鏈淀粉合成中起重要作用；同時，不同發育階段的表達譜表明：其在小鱗莖發育的整個階段均有表達，尤其在鱗莖形態建成中發揮作用。這與木薯中的研究一致[16]。

綜上所述，本研究在測定東方百合‘索邦’形態和生理指標的基礎上，發現離體百合鱗莖形成和發育過程中，鱗莖直徑及鮮質量不斷增加，淀粉質量分數總體呈現遞增趨勢，且根據鱗莖膨大速率及淀粉積累率，及其源-庫關系轉換，可將離體小鱗莖發育過程分為：小鱗莖膨大初期（0～15 d），小鱗莖快速膨大期（15～55 d）及小鱗莖膨大后期（55～75 d）；同時，淀粉在發育初期即需快速合成以保證鱗片化進程。進一步地，從鱗莖中克隆得到淀粉合成關鍵酶基因LohGBSSI的cDNA全長序列，得到其編碼氨基酸的理化性質和蛋白結構，通過序列比較和生物信息學軟件分析，推測該基因屬于GBSSI基因家族，LohGBSSI基因表達量與淀粉質量分數相關。通過實時熒光定量PCR法，分析LohGBSSI在‘索邦’不同組織的表達情況，發現LohGBSSI基因在鱗莖和葉中表達顯著高于莖段和根，表明直鏈淀粉合成的最主要部位為鱗莖；不同發育時期鱗莖內LohGBSSI的表達在15 d時最高，暗示鱗莖形成初期直鏈淀粉合成基因對于鱗莖形態建成具重要作用。本研究為后續解析淀粉合成關鍵酶基因GBSS在鱗莖發育中的功能奠定了基礎，也為百合進行淀粉相關基因修飾提供了依據。