十字花科作物根腫病對(duì)根際土壤微生物群落的影響

伍文憲,黃小琴,張 蕾,楊瀟湘,黎懷忠,劉 勇, *

1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 610066 2 成都市郫都區(qū)農(nóng)業(yè)和林業(yè)局,成都 611730

十字花科作物根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)侵染引起的一種毀滅性土傳病害[1],在世界范圍內(nèi)造成油菜和十字花科蔬菜嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,在我國(guó),根腫病的為害范圍已經(jīng)覆蓋了所有十字花科作物的主栽區(qū),危害程度逐年加重,根腫病已成為制約十字花科作物生產(chǎn)的主要病害之一[2- 3]。根腫病病原菌具生命力強(qiáng)(其休眠孢子在土壤中存活20年之久仍保持侵染能力)、侵染效率高(土壤中極低病原孢子濃度即可造成十字花科作物罹病)、傳播途徑多樣(可隨流水、農(nóng)事操作等傳播擴(kuò)散)等特點(diǎn),導(dǎo)致該病害菌源廣泛傳播、種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜、防治難度高[4- 5]。傳統(tǒng)的根腫病防治方法主要集中于化學(xué)防治、抗病品種選育以及栽培措施上,在減輕根腫病發(fā)生上取得了一定成效,但也存在諸多弊端,例如育成的抗病品種在根腫病流行區(qū)連續(xù)種植3年以上即有喪失抗性的風(fēng)險(xiǎn)[6- 8]。近年來(lái),人們寄希望土壤改良的農(nóng)業(yè)措施和生物防治方法以達(dá)到有效防控根腫病流行發(fā)生的目的,如通過(guò)調(diào)節(jié)土壤pH、增加土壤有機(jī)質(zhì)含量、施用恢復(fù)土壤微生物平衡的生防制劑來(lái)惡化根腫病原的生存環(huán)境,取得了不錯(cuò)的防病效果[9- 11],土壤微生態(tài)治理已然成為十字花科作物根腫病防治的主要途徑之一[12]。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,參與并推動(dòng)了生態(tài)環(huán)境中物質(zhì)和能量的流動(dòng)和轉(zhuǎn)移[13],其群落結(jié)構(gòu)組成與土壤健康狀況有密切聯(lián)系,是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[14]。土傳病害的爆發(fā)是土壤微生物特別是根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡的結(jié)果,病害的發(fā)生打破了植物-土壤-微生物相對(duì)穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng),深刻影響著土壤微生態(tài)(土壤理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)、土壤酶活等)環(huán)境[15]。近年來(lái),我國(guó)作物土傳病發(fā)病率不斷上升,對(duì)此,土傳病害發(fā)生與根際土壤微生物相應(yīng)地成為研究熱點(diǎn)之一[16- 17]。李金萍等[18]研究表明青稞根腐病顯著改變根際土壤微生物組成,碳、氮、磷等物質(zhì)代謝受到抑制,并且能量代謝發(fā)生紊亂。陸曉菊等[19]在研究三七根際土壤微生物區(qū)系遺傳多樣性中發(fā)現(xiàn),土傳病害的發(fā)生與土壤理化性質(zhì)和土壤微生物的種群結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢(shì)微生物的種群比例具有密切的關(guān)聯(lián)性。Shen等[20]研究顯示香蕉枯萎病的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和土壤有機(jī)質(zhì)含量緊密相關(guān)。目前,針對(duì)十字花科作物根腫病對(duì)寄主根際土壤微生物群落影響的研究尚無(wú)人報(bào)道,本研究以罹病大白菜和健康株根際土壤為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析2組樣本間的根際土壤細(xì)菌和真菌物種組成、群落結(jié)構(gòu)及多樣性,同時(shí)測(cè)定根腫病對(duì)根際土壤理化性質(zhì)影響,旨在分析根腫病、微生物群落以及土壤理化性質(zhì)三者間的相關(guān)性,通過(guò)研究根際土壤中微生物群落的結(jié)構(gòu)差異,探究土壤中制約根腫病發(fā)生的關(guān)鍵因素,為揭示根腫病發(fā)生的根際微生態(tài)機(jī)制以及研發(fā)根腫病綜合防控技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況、土壤采集和理化性質(zhì)測(cè)定

研究區(qū)位于成都平原腹心地帶的郫都區(qū)唐昌鎮(zhèn)柏木村,地理坐標(biāo)為30°54′56.61″N,103°48′32.43″ E,海拔(574±20) m,屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候,年平均氣溫16℃,無(wú)霜期大于340 d,降水集中于7—8月,年均降水量979.4 mm,平均相對(duì)濕度為82%,年日照率僅24%—32%,日照1014.0 h。土壤類型灰色潮土性水稻土,土地墾殖指數(shù)高,土壤采集樣地的周年種植模式為大白菜-黃瓜-大白菜。

于2018年11月19日在研究區(qū)的同一田塊進(jìn)行采樣,采用多點(diǎn)采樣法取樣,在試驗(yàn)田的未發(fā)病中心區(qū)域選取呈三角形的3個(gè)采樣點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)距離10 m,每個(gè)采樣點(diǎn)按5點(diǎn)取樣法將植株挖出,抖落根部附著的疏松土壤后,收集與根系結(jié)合緊密的土壤,混合均勻后合為一個(gè)土壤樣品,共計(jì)3個(gè)重復(fù)。健康大白菜根際土壤樣品采集與罹病植株根際土采樣方法一致,土樣裝密封袋低溫帶回實(shí)驗(yàn)室,過(guò)2 mm篩后立即保存在超低溫冰箱(-80 ℃)冷凍暫存。

土壤樣本的各項(xiàng)理化性質(zhì)測(cè)定由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所分析測(cè)試研究室完成,檢測(cè)方法均依據(jù)國(guó)家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。

1.2 土壤微生物總DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

根際土壤DNA采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit試劑盒(OMEGA公司,美國(guó))進(jìn)行提取,利用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司,美國(guó))分光光度儀檢測(cè)提取的DNA含量和純度。對(duì)細(xì)菌的16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用的引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)[21],利用引物ITS1- 1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3′)和ITS2- 2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC- 3′)對(duì)真菌rDNA ITS1區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[22]。PCR反應(yīng)體系為50 μL,包括稀釋后的模板基因組DNA,帶Barcode的特異引物,Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs公司,英國(guó))和高保真酶(Thermo Fisher公司,美國(guó))等。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè),根據(jù)產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,充分混勻后使用2%瓊脂糖膠電泳純化PCR 產(chǎn)物,剪切目標(biāo)條帶后使用GeneJET (Thermo Scientific公司,美國(guó))膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。將純化質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物用于DNA文庫(kù)構(gòu)建,委托北京諾和致源科技有限公司執(zhí)行建庫(kù)及測(cè)序工作。

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

下機(jī)的數(shù)據(jù)經(jīng)Cutadapt(V1.9.1, http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)過(guò)濾掉低質(zhì)量reads,隨后根據(jù)Barcode序列將reads拆分并截去引物序列和Barcode標(biāo)簽,得到原始數(shù)據(jù)(Raw reads),再通過(guò)去除嵌合體序列處理,最終得到有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)[23]。使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001,http://www.drive5.com/uparse/)將97%以上一致性的Clean Reads聚類為一個(gè)操作分類單元(OTU, Operational Taxonomic Unit)[24],使用Qiime軟件(Version 1.9.1)中的比對(duì)方法(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)與數(shù)據(jù)庫(kù)Unit(v7.2, https://unite.ut.ee/)對(duì)OTUs進(jìn)行物種注釋分析,并在各分類水平上統(tǒng)計(jì)樣本的群落組成[25-26]。OTUs間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系則通過(guò)MUSCLE(Version 3.8.31,http://www.drive5.com/muscle/)軟件進(jìn)行快速多序列比對(duì)[27]。最后得到的各樣品數(shù)據(jù),以樣品數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理。

通過(guò)Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算α-多樣性指數(shù),配對(duì)樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行理化性質(zhì)數(shù)據(jù)和樣本間的α-多樣性指數(shù)差異分析,利用R軟件(Version 2.15.3)繪制稀釋曲線,主坐標(biāo)分析(PCoA)圖用R軟件的WGCNA,stats和ggplot2軟件包繪制,對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行篩選的方差膨脹因子檢驗(yàn)(VIF, Variance inflation)使用的是vegan包中的vif.cca函數(shù),冗余分析(RDA, Redundancy Analysis)是通過(guò)vegan包中的rda函數(shù)進(jìn)行的排序分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 罹病與健康植株根際土壤理化性質(zhì)差異

對(duì)患根腫病的大白菜和健康株根際土壤進(jìn)行理化性質(zhì)測(cè)定,結(jié)果顯示兩個(gè)區(qū)組樣本間的有機(jī)質(zhì)、全氮、有效磷含量以及碳氮比無(wú)顯著性差異(P>0.05),患病植株根際土壤pH值,全磷、全鉀、堿解氮和速效鉀含量顯著低于健康根際土壤(P<0.05),而土壤交換性鈣含量顯著高于健康植株根際土壤(P<0.05)(表1)。

表1 發(fā)病植株和健康植株根際土壤理化性質(zhì)

Group 1代表患根腫病大白菜根際土壤樣本,Group 2表示健康植株根際土壤樣本,下同。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),同一列不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

2.2 根腫病對(duì)土壤細(xì)菌和真菌群落Alpha多樣性影響

對(duì)2區(qū)組共計(jì)6個(gè)土壤樣本高通量測(cè)序,結(jié)果顯示患根腫病的大白菜根際土壤共獲得細(xì)菌和真菌有效序列分別為80147和74510條,健康植株根際土壤則獲得的細(xì)菌和真菌的有效序列數(shù)分別為81784和80106條。從表2和表3中可知,無(wú)論細(xì)菌還是真菌,其測(cè)序覆蓋度均高達(dá)99%以上,說(shuō)明本試驗(yàn)測(cè)序深度接近飽和,土壤中的物種未被測(cè)出的概率低,測(cè)序結(jié)果能夠真實(shí)反映土壤中細(xì)菌和真菌情況。

表2 患根腫病和健康植株根際土壤細(xì)菌α-多樣性指數(shù)

表3 患根腫病與健康植株根際土壤真菌α-多樣性指數(shù)

分析罹病和健康植株根際土壤微生物α-多樣性發(fā)現(xiàn),患病植株根際土壤中檢測(cè)到細(xì)菌OTU數(shù)目為1174個(gè),檢測(cè)到真菌OTU數(shù)目為818個(gè),健康株系根際土壤中檢測(cè)到1343個(gè)細(xì)菌OTU和890個(gè)真菌OTU,2個(gè)區(qū)組間的細(xì)菌OTU數(shù)目存在極顯著差異(P<0.01)。Shannon指數(shù)可反映微生物的多樣性程度,而Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)表示土壤中微生物群落物種豐富度[28],從表2可知,患病根際土壤細(xì)菌Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)顯著低于健康株根際土壤(P<0.05),并且ACE指數(shù)極顯著低于健康株根際土壤(P<0.01)。從表3可知,2區(qū)組間的真菌OTU數(shù)目、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)等未達(dá)到顯著性差異。以上結(jié)果表明,患病植株根際土壤細(xì)菌數(shù)量下降極為明顯,且細(xì)菌群落多樣性程度和豐富度均顯著低于健康根際土壤,而根腫病沒(méi)有改變寄主根際土壤的真菌物種數(shù)和各項(xiàng)α-多樣性指數(shù)。

2.3 根際土壤微生物群落組成和結(jié)構(gòu)分析

圖1 門水平下的細(xì)菌群落組成Fig.1 Composition of bacterial community at phylum level*表示存在顯著性差異(P<0.05

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行物種注釋,結(jié)果顯示所測(cè)土壤樣本中的總計(jì)2517個(gè)細(xì)菌OTUs分屬于28門40綱91目168科326屬,主要細(xì)菌門(相對(duì)豐度≥1%)分別是變形菌門(Proteobacteria)61.13%,擬桿菌門(Bacteroidetes)13.43%,放線菌門(Actinobacteria)6.93%,酸桿菌門(Acidobacteria)5.10%,綠彎菌門(Chloroflexi)3.42%,未知細(xì)菌門(unidentified bacteria)2.71%,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)2.37%和厚壁菌門(Firmicutes)1.46%。主要細(xì)菌綱(相對(duì)豐度≥1%)分別是γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)49.38%,擬桿菌綱(Bacteroidia)13.46%,α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)11.65%,放線菌綱(Actinobacteria)5.35%,酸桿菌綱(Acidobacteria)4.73%,未知細(xì)菌綱(unidentified bacteria)2.88%,芽單胞菌綱(Gemmatimonadetes)2.36%以及纖線桿菌綱(Ktedonobacteria)2.20%,其余細(xì)菌門類所占比例均低于1%,共占7.98%。差異分析結(jié)果表明,患病植株根際土壤擬桿菌門相對(duì)豐度顯著高于健康植株根際土壤,但放線菌門相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)(圖1)。細(xì)菌綱分類水平上,患根腫病植株與健康株根際土壤在擬桿菌綱、放線菌綱、未知細(xì)菌綱和生養(yǎng)光細(xì)菌綱上有顯著差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 綱水平下土壤細(xì)菌群落組成Fig.2 Composition of bacterial community at class level

圖3 土壤真菌在門水平上的群落組成Fig.3 Rhizosphere soil fungal phylum community composition

而真菌的1708個(gè)OTU隸屬于14門41綱87目146科207屬,主要真菌門是子囊菌門(Ascomycota)40.97%,擔(dān)子菌門(Basidiomycota)9.50%,被孢霉門(Mortierellomycota)9.43%,壺菌門(Chytridiomycota)4.33%,其他門占比35.78%。T檢驗(yàn)結(jié)果表明,2區(qū)組在這4個(gè)真菌門水平上的相對(duì)豐度均存在著顯著性差異(P<0.05)(圖3)。真菌綱水平上,主要由散囊菌綱(Eurotiomycetes)、被孢霉綱(Mortierellomycetes)、錘舌菌綱(Leotiomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)、Rhizophlyctidomycetes綱、壺菌綱(Chytridiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)等優(yōu)勢(shì)菌綱組成,在患病植株根際土壤中,按豐富度由高到低的排列順序?yàn)椋罕绘呙咕V>糞殼菌綱>座囊菌綱>散囊菌>錘舌菌綱>銀耳綱>Rhizophlyctidomycetes綱>壺菌綱>傘菌綱,而在健康植株根據(jù)土壤中的豐度順序是：散囊菌綱>糞殼菌綱>銀耳綱>被孢霉綱>座囊菌綱>茶漬綱>傘菌綱>錘舌菌綱>壺菌綱> Rhizophlyctidomycetes綱,并且通過(guò)物種差異分析,發(fā)現(xiàn)患病和健康植株根際土壤中的被孢霉綱、錘舌菌綱、Rhizophlyctidomycetes綱和壺菌綱相對(duì)豐度存在顯著性差異(P<0.05),并且在散囊菌綱中的相對(duì)豐度差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)(圖4)。

主坐標(biāo)分析(PCoA)是通過(guò)一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取最主要的元素和結(jié)構(gòu),可直觀反映樣本間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。PCoA可基于Unweighted Unifrac 距離和Weighted Unifrac距離這兩種形式進(jìn)行分析,如果樣本間距離相近,說(shuō)明物種組成結(jié)構(gòu)相似。本研究采用基于Weighted Unifrac距離進(jìn)行PCoA分析,結(jié)果表明,無(wú)論是細(xì)菌還是真菌,患根腫病后的植株和健康植株根際土壤樣本間的距離相差較大,說(shuō)明根腫病改變了根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)(圖5)。

2.4 微生物群落與土壤理化因子相關(guān)性分析

采取矩陣檢驗(yàn)分析和經(jīng)方差膨脹因子(VIF)篩選后基于距離的冗余分析(db-RDA)環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)關(guān)系,其中環(huán)境因子為在2組根際土壤樣本間有顯著性差異的pH、全磷(TP)、全鉀(TK)、堿解氮(AN)、速效鉀(AK)和可交換性鈣(ECa),微生物群落數(shù)據(jù)為樣品中OTUs的相對(duì)豐度,從表4可知,全鉀、堿解氮、交換性鈣與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著相關(guān)性,而對(duì)根際土壤真菌群落而言,全鉀、速效鉀和交換性鈣是重要的影響因子。由于對(duì)微生物菌群產(chǎn)生影響的相關(guān)環(huán)境因子較多,并且環(huán)境因子存在嚴(yán)重的自相關(guān)性,因此在進(jìn)行環(huán)境因子與微生物群落結(jié)構(gòu)分析時(shí),有必要對(duì)環(huán)境因子進(jìn)行篩選,VIF檢驗(yàn)可以計(jì)算每一個(gè)環(huán)境因子的VIF值,當(dāng)值大于20時(shí)則被認(rèn)定為無(wú)用的環(huán)境因子,進(jìn)而達(dá)到過(guò)濾篩選環(huán)境因子的目的,本研究基于VIF的冗余分析結(jié)果如圖6所示,對(duì)于細(xì)菌群落而言,全磷、速效鉀和可交換性鈣解釋了84.69%的總特征值,并且這3個(gè)土壤化學(xué)因子對(duì)根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響,解釋了83.33%的總特征值,說(shuō)明全磷、速效鉀和可交換性鈣對(duì)根際土壤微生物有較大影響。進(jìn)一步分析表明,速效鉀和交換性鈣是影響根際土壤微生物群落改變的主要環(huán)境因子,且與速效鉀呈顯著性正相關(guān)(P<0.05),與可交換性鈣呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表4 土壤理化因子與細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

圖6 經(jīng)VIF篩選后的土壤理化因子與土壤微生物群落冗余分析Fig.6 Redundancy analysis on microbial communities by soil variables after screening by variance inflation factor test

3 討論

土壤理化性質(zhì)與植物土傳病害的發(fā)生有直接的聯(lián)系,例如鉀、鈣等元素直接關(guān)系到植物的抗病性,氮、磷、鉀的比例失調(diào)顯著增加病害的發(fā)生幾率,有機(jī)質(zhì)含量多少與土傳病害的病情指數(shù)呈顯著性負(fù)相關(guān)[20,29- 30]。因此,詳細(xì)了解土壤理化性質(zhì)對(duì)解釋根腫病的發(fā)生具有重要意義,本研究的土壤理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示,患病植株根際土壤的pH值及全磷、全鉀、堿解氮、速效鉀含量顯著低于對(duì)照。而pH的下降導(dǎo)致的土壤酸性環(huán)境利于根腫病孢子萌發(fā)、侵染和傳播,試驗(yàn)結(jié)果恰與前期研究相吻合,另外,患病植物根際土壤的全鉀和速效鉀含量顯著低于對(duì)照也從側(cè)面解釋了草木灰防控根腫病的有效性,草木灰的pH值高達(dá)12左右,主要成分為碳酸鉀,施用草木灰可增加土壤鉀含量以及提高pH以惡化根腫病病原菌生存環(huán)境,以此達(dá)到防控根腫病的目的。病株土樣中堿解氮含量下降與宋旭紅等[31]的研究結(jié)果一致,而堿解氮含量與土壤脲酶活性密切相關(guān),推測(cè)病株土壤中的脲酶活性降低影響了堿解氮的形成。通常來(lái)講,土壤中高含量可交換性鈣可一定程度減輕病害的危害,但有意思的是患根腫病大白菜根際土可交換性鈣濃度要比健康株根際土要明顯升高,其原因有可能是根腫病侵染寄主根部后,一方面阻止植物根系對(duì)Ca2+吸收,另一方面引起寄主Ca2+外溢,進(jìn)而增加了根際土壤可交換性鈣含量[32-34]。因此,提高土壤pH,增施鉀肥,調(diào)減氮肥,均衡施肥對(duì)于防控根腫病是必要的。

土壤微生物指標(biāo)是指示土壤健康的重要因子,土壤微生物群落多樣性對(duì)于土壤生態(tài)及作物健康至關(guān)重要[16],當(dāng)根際微生物特別是細(xì)菌區(qū)系結(jié)構(gòu)合理,多樣性程度越高,物種越豐富,作物抗病能力就越強(qiáng)[35],α-多樣性分析結(jié)果表明,無(wú)論是罹病還是健康的植株,其根際土壤中的細(xì)菌OTUs數(shù)都比真菌的要多,說(shuō)明根際土壤中細(xì)菌種群數(shù)量要高于真菌,這與李巖等[36]在研究根際土與非根際土中得出的土壤中微生物以細(xì)菌為主一致的結(jié)果相似。與此同時(shí),根腫病侵染寄主后,引起寄主根際土壤的細(xì)菌數(shù)量急劇下降,多樣性程度和豐富度也顯著低于健康植株根際土壤,有研究認(rèn)為土壤細(xì)菌的數(shù)量和多樣性的高低在一定程度上反映了土壤的健康狀況,細(xì)菌型土壤是土壤肥力提高的一個(gè)生物指標(biāo)[17, 37],本研究結(jié)果說(shuō)明根腫病占領(lǐng)根際生態(tài)位后,對(duì)根際土壤的細(xì)菌影響較大,導(dǎo)致土壤中細(xì)菌種群數(shù)量急劇減少,群落多樣性趨于單一,土壤有由“細(xì)菌型”向“真菌型”方向轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),影響到土壤生態(tài)系統(tǒng),從而使得土壤微生態(tài)發(fā)生變化。

微生物對(duì)土壤環(huán)境敏感,植物種類、耕作方式、土壤營(yíng)養(yǎng)狀況、氣候變化等等均會(huì)不同程度改變土壤群落結(jié)構(gòu)和微生物的組成[38-40],植物土傳病害發(fā)生后,根際土壤的微生物組成和優(yōu)勢(shì)微生物也會(huì)發(fā)生一定程度的改變,李雪萍等[18]研究表明青稞根腐病導(dǎo)致根際土壤的放線菌等其他有益細(xì)菌減少,Benizri等[41]研究桃樹根部病害對(duì)根際土壤微生物關(guān)系時(shí),發(fā)現(xiàn)桃樹根部發(fā)病與根際土壤拮抗細(xì)菌數(shù)量和種類降低有密切聯(lián)系。在本研究中,根腫病顯著改變了根際土壤微生物的群落結(jié)構(gòu),并且分析群落組成,發(fā)現(xiàn)無(wú)論是細(xì)菌還是真菌,其優(yōu)勢(shì)種群豐度存在較為明顯的變化,受根腫菌侵染的植株根際土壤放線菌的相對(duì)豐度顯著降低,生養(yǎng)光細(xì)菌等有益微生物數(shù)量亦明顯下降。另外,子囊菌門、被孢霉門、擔(dān)子菌門和壺菌門是根際土壤豐度最高的真菌類群,李巖等[36]對(duì)枸杞根際土壤真菌群落的研究發(fā)現(xiàn),子囊菌、擔(dān)子菌和被孢霉是根際土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群,高雪峰等[42]在短花針茅草原土壤微生物群落研究中發(fā)現(xiàn)子囊菌門、接合菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門是優(yōu)勢(shì)真菌類群,本研究與這些研究結(jié)果的真菌群落主要構(gòu)成類似。前人報(bào)道子囊菌門大多數(shù)為腐生菌,對(duì)降解土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分循環(huán)起著重要作用,是土壤中主要的真菌分解者[43],本試驗(yàn)結(jié)果顯示健康植株根際土壤子囊菌門豐度顯著高于患病根際土壤,說(shuō)明根腫菌可能對(duì)土壤的養(yǎng)分循環(huán)也起到了不同程度地干擾作用。除此之外,2個(gè)區(qū)組間多種真菌類群的相對(duì)豐度發(fā)生變化,意味著根腫病對(duì)土壤中優(yōu)勢(shì)真菌群落組成影響較大。

矩陣檢驗(yàn)分析表明,土壤理化因子對(duì)微生物群落變化密切相關(guān),土壤中全鉀、堿解氮和交換性鈣對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著,真菌群落結(jié)構(gòu)則與土壤全鉀、速效鉀和交換性鈣相關(guān)。經(jīng)VIF篩選后的冗余分析結(jié)果顯示,速效鉀和可交換性鈣是影響細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因子,并且健康植株根際土壤微生物對(duì)速效鉀表現(xiàn)出正相關(guān)性。后續(xù)我們通過(guò)方差分解分析(VPA, Variance partitioning canonical correspondence analysis)研究土壤各環(huán)境因子對(duì)微生物群落分布的解釋量,發(fā)現(xiàn)全鉀、速效鉀和可交換性鈣對(duì)根際土壤細(xì)菌群落分布差異貢獻(xiàn)度達(dá)68.43%,對(duì)真菌群落分布貢獻(xiàn)度為71.79%,說(shuō)明鉀和鈣兩種元素對(duì)根腫病發(fā)生和微生物群落變化起著重要作用。綜上,根腫病的發(fā)生與根際土壤微生態(tài)環(huán)境失衡顯著相關(guān),它改變了微生物結(jié)構(gòu),影響了微生物群落多樣性,特別是生防有益微生物豐富度,與此同時(shí),土壤理化因子與微生物群落結(jié)構(gòu)存在著緊密聯(lián)系。

4 結(jié)論

患根腫病植株根際土壤pH值和全磷、全鉀、堿解氮、速效鉀含量顯著低于健康植株根際土壤,交換性鈣含量顯著增加；根腫病引起寄主根際土壤細(xì)菌數(shù)量急劇減少,并且顯著降低了根際細(xì)菌的豐富度和多樣性程度,但真菌物種數(shù)、豐富度和多樣性程度在罹病和健康植株根際土壤間則無(wú)顯著性變化；根腫病改變了根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu),提高了擬桿菌、真菌壺菌、被孢霉、擔(dān)子菌等的相對(duì)豐度,降低了放線菌、生養(yǎng)光細(xì)菌等有益微生物的相對(duì)豐度；土壤微生物群落受多種土壤理化因子影響,其中速效鉀和交換性鈣是影響患根腫病和健康植株根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的主要因子。本研究可為優(yōu)化微生態(tài)調(diào)控措施,提升植物根際微生態(tài)抗性來(lái)防控根腫病提供理論依據(jù)。