高效液相微柱色譜在檢測體液中二甲雙胍的應用

李金祥， 周雨晴， 楊 悅

(遼寧師范大學化學化工學院，遼寧 大連 116029)

引 言

二甲雙胍近年作為治療胰島素分泌缺陷和胰島素體內生物作用效率低的2型糖尿病的常用口服藥，其作用機理在于能夠多方面作用，協同降糖。例如，對于肝臟，二甲雙胍能夠抑制糖異生；對于肌肉、脂肪組織，改善肌肉糖原合成，降低游離脂肪酸濃度，提升胰島素活性，提高葡萄糖吸收和利用率；激活腺苷酸活化蛋白激酶活性，提高肌肉、肝臟等的能量代謝；還可以作用于腸道，減少對葡萄糖的吸收，從而共同達到降糖的作用。然而，盡管二甲雙胍毒性相對較低，但服用不當藥物累積過多仍會引起副作用，如，食欲不振、惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道反應；乏力、疲倦；乳酸中毒；貧血等。為了防止用藥頻繁導致體內積累過多二甲雙胍而危及健康，確保人體內二甲雙胍的血藥濃度維持在一定安全范圍內，快速檢測體液中的二甲雙胍濃度對于臨床用藥治療以及藥物代謝動力學研究具有重要意義。

二甲雙胍為白色無特殊味結晶，易溶于水，可溶于甲醇，pKa=12.4，堿性較強，極性大。以往有很多檢測片劑、體液體系中二甲雙胍含量的方法，如高效液相色譜法、紫外分光光度法、離子色譜-直接電導法、薄層色譜法、離子選擇電極法等。目前較為常用的方法是高效液相色譜法。Himal等[1]用C18反相柱對處理后的人體血液中的二甲雙胍進行了離子對分離，后用紫外檢測器檢測。Neda等[2]基于檸檬酸鹽封端的金納米顆粒設計了一種簡便的比色和分光光度傳感探針，以測定人血清中的二甲雙胍含量；Park S等[3]用分光光度法測定服用吉格列汀和二甲雙胍緩釋固定劑量組合片劑后血液中的二肽基肽酶4的活性，使用串聯質譜法測定吉格列汀和二甲雙胍的濃度；Florentin等[4]在雙相體系中用對硝基苯甲酰氯對二甲雙胍進行衍生化反應，濃縮萃取后經等度洗脫，在HPLC-DAD檢測人體血漿中二甲雙胍的含量；楊歡杰等[5]使用Capcell PAK SCX UG80正相色譜柱對人體血漿和尿液中的二甲雙胍含量完成測定；佟若菲等[6]用Lichrospher ODS色譜柱對服用復方二甲雙胍格列吡嗪片的健康人群的尿液中二甲雙胍含量進行測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器與試劑見第32頁表1、表2。

1.2 色譜柱的制備

分別將內徑為150 μm的石英毛細管和粒徑為10 nm～20 nm的硅膠顆粒進行表面雙鍵預活化處理。分別配制A、B、C 3種溶液，其中，A為V(水)∶V(甲醇)∶V(環己醇)=1∶2∶2的三元致孔劑，B為用A配制的SPMA質量分數為12%的單體溶液，C為用A配制含2.5% AIBN的引發劑溶液。A、B、C均用N2除氧，并超聲振蕩均勻。稱取10.00 mg預處理的納米硅膠顆粒，加入27.5 μL B溶液和7.5 μL A溶液，混合液上層吹N21 min并超聲混勻，加入5 μL C溶液，上層吹N21 min并超聲混勻，迅速將反應液注入預處理后的毛細管中，兩端密封。放入60 ℃水浴中反應6 h，取出后用大于50倍柱體積的甲醇沖洗整體柱，制得有機與無機雜化強陽離子交換整體柱。

表1 實驗儀器

表2 試劑和材料

1.3 樣品處理

1.3.1 血液樣品處理

準確移取500 μL血漿，精密加入一定量的鹽酸二甲雙胍標準品至質量濃度為4 μg/L，加入15 μL 30%的高氯酸，超聲波振蕩2 min，6 000 r/min速度下離心5 min，取上層液，再加入15 μL 30%的高氯酸，超聲波振蕩2 min，6 000 r/min速度下離心5 min，轉移上層清液，加入100 μL二氯甲烷，超聲波振蕩3 min，6 000 r/min速度下離心5 min。準確吸取上層清液過濾后作為MET血液待測樣品備用[7]。

1.3.2 尿液樣品處理

向1.5 mL離心管中準確加入尿液100 μL，精密加入一定量鹽酸二甲雙胍標準品至質量濃度為4 μg/L，加入流動相0.9 mL，振蕩1 min混勻，16 000 r/min下離心3 min。用0.45 μm孔徑濾膜過濾后為MET尿液待測樣品備用[6]。

2 結果與討論

2.1 二甲雙胍血液分離

磺酸跟(SO3-)離子在pH值小于3時都可以維持帶有負電荷的狀態，所以用離子交換原理分離血漿基體中的鹽酸二甲雙胍主要考慮鹽酸二甲雙胍在基體中的電荷狀態即可。鹽酸二甲雙胍pKa=12.4，所以在pH<12.4的時候會質子化帶有正電荷，與固定相帶有的磺酸跟產生靜電作用，從而實現分離。但流動相pH值不同會使鹽酸二甲雙胍質子化程度不同，所以分別在pH為7.5、6.5、5.0時，考察pH對鹽酸二甲雙胍在血樣基體中的分離的影響。實驗條件為：紫外檢測波長237 nm；有效柱長2.5 cm；流動相：30 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液；流速：0.3 μL·min-1。由圖1可知，隨著流動相pH值的變小，鹽酸二甲雙胍的保留時間逐漸變大。

圖1 流動相pH值對血液中鹽酸二甲雙胍保留時間的影響

當樣品進入色譜柱后，樣品離子便與流動相離子相互競爭固定相表面的電荷位置，并因競爭力的差異使樣品組分得到分離。增加流動相的離子濃度，增強了離子的競爭性結合能力從而使得樣品的解吸強度增大。以H3PO4-NaH2PO4為緩沖溶液并向其中加入NaCl增大競爭離子Na+的濃度，考察競爭離子濃度對血液中鹽酸二甲雙胍的分離的影響。實驗條件為：紫外檢測波長237 nm；有效柱長2.5 cm；流動相：30 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液，30%ACN，pH=5.0；流速：0.3 μL·min-1。由圖2可知，隨著溶液中Na+濃度增大，鹽酸二甲雙胍的保留時間逐漸變小，最后能夠在14.675 min時出峰，在較短的時間內完成分離。

圖2 流動相Na+濃度對血液中鹽酸二甲雙胍保留時間的影響

紫外檢測波長237 nm；有效柱長2.5 cm；流動相中加入NaCl使得[Na+]=130 mmol·L-，30%ACN，pH=5.0；流速：0.3 μL·min-1時，空白血漿、鹽酸二甲雙胍對照品、加入鹽酸二甲雙胍的空白血漿經強陽離子交換液相微柱的色譜圖如圖3。鹽酸二甲雙胍的保留時間為14.675 min，血漿中的內源性物質不干擾鹽酸二甲雙胍的檢測。

圖3 鹽酸二甲雙胍血漿色譜分析圖

2.2 二甲雙胍尿液分離

流動相的pH值影響待測物的質子化程度，影響與固定相上帶有相反電荷的基團之間靜電作用大小，同時也會影響目標物解吸能力，從而影響待測物的分離。所以，改變流動相的pH值，會對鹽酸二甲雙胍在尿液體系的分離有影響。由圖4可知，逐漸減小流動相pH值，尿液基體以及鹽酸二甲雙胍的保留時間都有所增大。實驗條件為：紫外檢測波長237 nm；有效柱長2.0 cm；流動相：30 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液；流速：0.3 μL·min-1。

圖4 流動相pH值對尿液中鹽酸二甲雙胍保留時間的影響

流動相中的競爭離子會與待測物離子競爭固定相上的交換位點，競爭離子的濃度，會影響待測物的保留時間。向30 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液加入NaCl以增大競爭離子Na+的濃度，考察競爭離子濃度對尿液中鹽酸二甲雙胍的分離的影響。實驗條件為：紫外檢測波長237 nm；有效柱長2.0 cm；流動相：30 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=4.0；流速：0.3 μL·min-1。由圖5可知，隨著溶液中的Na+濃度增大，鹽酸二甲雙胍的保留時間逐漸變小，在較短的時間內完成分離。

圖5 流動相Na+濃度對尿液中鹽酸二甲雙胍保留時間的影響

紫外檢測波長237 nm；有效柱長2.0 cm；30 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液加入NaCl使得[Na+]=140 mmol·L-1，pH=4.0；流速：0.3 μL·min-1時，空白尿液、鹽酸二甲雙胍對照品、加入鹽酸二甲雙胍的空白尿液經強陽離子交換液相微柱的色譜圖如圖6。鹽酸二甲雙胍的保留時間為14.663 3 min，尿液中的內源性物質不干擾鹽酸二甲雙胍的檢測。

圖6 鹽酸二甲雙胍尿液色譜分析圖

3 結論

利用表面預活化的無機納米硅膠顆粒作為交聯劑，帶有SO3-基團的3-磺酸丙基甲基丙烯酸鉀鹽作為有機功能單體，在內徑150 μm毛細管里面通過原位聚合反應得到有機無機雜化強陽離子交換整體柱，并用這種整體柱完成了對血漿和尿液兩種基體中鹽酸二甲雙胍的分離。實驗證明，分離條件經過優化后，能夠在較短時間內從血、尿兩種基體中將鹽酸二甲雙胍完全分離。