基于IGF/MMP信號通路研究健脾利濕化瘀方有效拆方對前列腺癌細胞侵襲、遷移的影響*

孫彬栩，蔡啟亮，李小江，賈英杰

（1．天津中醫藥大學第一附屬醫院腫瘤科，天津 300381；2．天津醫科大學第二醫院，天津 300211）

前列腺癌是一類從不需要治療的非侵襲性、生長緩慢的疾病到需要治療的侵襲性、生長迅速的疾病。據2019年最新數據顯示，在美國，前列腺癌是常見的腫瘤疾病之一，也是美國男性腫瘤死亡的第二大原因；預計將有174 650例男性被診斷出患有前列腺癌，31 620例患者將死于這種疾病[1]，從1993年到2016年，美國的前列腺癌病死率下降了51%，這主要是由于早期發現和改進的治療[2]。在中國，前列腺癌的發病率雖遠遠低于歐美國家，但其發病呈快速上升趨勢[3]。中國大多數前列腺癌患者在初診時就已經出現轉移，目前晚期轉移性前列腺癌患者的一線治療方案仍然為內分泌治療，但經過中位時間為18～24個月的內分泌治療，幾乎所有患者都將進展為去勢抵抗性前列腺癌（CRPC）[4]，而其中86%的CRPC最終會轉變為轉移性CRPC。患者一旦進入CRPC階段，預后一般較差。因此，CRPC的診治一直是臨床與基礎研究的熱點與難點[5]。

目前，西醫學治療轉移性CRPC患者的方案包括：雄激素合成抑制劑-醋酸阿比特龍聯合低劑量醋酸潑尼松、抗雄激素藥-恩雜魯胺、多西他賽等[4]。國際多中心隨機雙盲試驗（COU-AA-302）結果也顯示阿比特龍作為一線藥物可顯著延長未化療轉移性CRPC患者的中位生存期，延緩患者的疾病進展，改善患者的生活質量，且具有良好的安全性[6]。但是醋酸阿比特龍的使用也為患者帶來了巨大的經濟負擔[7]，另外，亦有研究數據顯示阿比特龍和恩雜魯胺具有交叉耐藥性[8]。另外，現在患者關注的不僅僅是延長腫瘤患者的生命期，更為關心的是腫瘤對患者自身疼痛和生活質量的影響。因此，如何利用中醫學的治療特色為CRPC患者制定最佳的治療方案，成為當下治療的研究重點。

賈英杰教授[9]分析前列腺癌中醫證候相關文獻得出，前列腺癌的病變臟腑主要責之腎與膀胱，并涉及肝、脾、肺。基于多年臨床經驗[10]，總結出前列腺癌病機為脾虛濕困、氣虛毒瘀，將治療前列腺癌的臨床驗方進行加減化裁，創立健脾利濕化瘀方，基礎方由黃芪、大黃、姜黃、王不留行等中藥組成。此外，在實驗研究中均證實健脾利濕化瘀方及其各拆方組對人前列腺癌PC-3細胞荷瘤小鼠具有抑瘤作用[11]，并能抑制人前列腺癌C4-2細胞雄激素非依賴性生長作用[12]，為健脾利濕化瘀方的機制研究方面提供依據。多種實體腫瘤細胞均可分泌多種蛋白酶，如基質金屬蛋白酶（MMP）類，在組織重塑中發揮重要作用，并與形態發生、血管生成等多種生理過程相關；這些酶類可有效降解細胞外基質，從而有助于腫瘤轉移[13]。為進一步明確該復方的作用機制[14]，在前期動物實驗的基礎上，運用各拆方組含藥血清進行前列腺癌DU-145、PC-3細胞的增殖與遷移影響研究，并選出細胞增殖率最佳的拆方組進行基于胰島素樣生長因子（IGF）/MMP信號通路的分子機制研究，以更好地證實復方的部分作用機制。

1 材料與儀器

1.1 實驗細胞株 實驗所應用的PC-3、DU-145、CAF細胞株購自ATCC公司，批號CRL-1435，由南開大學生命科學院分子研究所長期凍存。

1.2 試劑與藥品 健脾利濕化瘀方各拆方組含藥血清[11]由天津中醫藥大學第一附屬醫院中醫腫瘤研究所凍存。其中，健脾扶正組藥物由黃芪、刺五加、補骨脂組成，化瘀散結組藥物由姜黃、大黃、王不留行組成，清熱解毒組藥物由白英、蛇六谷、車前草組成。

青霉素、鏈霉素、胎牛血清、L-谷氨酰胺、DMEM培養基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、四甲基噻唑藍（MTT）試劑盒（Chemicon，美國）等。

1.3 主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、倒置熒光顯微鏡（美國BIGCO公司）及細胞培養皿（上海晶睿生物科技有限公司）等。

2 方法

2.1 細胞培養 人前列腺癌細胞株PC-3、DU-145、CAF常規培養于含10%胎牛血清培養液中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下培養。待細胞長滿瓶底85%～90%，棄去已用培養液，以0．25%胰蛋白酶消化，隔2～3 d分瓶傳代、培養。

2.2 MTT法檢測細胞生長抑制和最適藥物濃度 將各組細胞制成單細胞懸液，按5 000/孔分別接種于96孔培養板，每孔200 μL，24 h后除去培養液，分別將健脾扶正組、化瘀散結組、清熱解毒組含藥血清用培養基稀釋10、50、100倍加入96孔板中，每孔200 μL，37℃，5%CO2培養；24 h 后加入八肽膽囊收縮素（CCK-8）溶液 20 μL，繼續孵育 4 h 后，測量各孔450 nm處的光密度值。每組設6個復孔，取各組值的均數表示細胞的增殖情況。

2.3 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 在Matrigel Invasion Chamber上室和下室各加入500 μL預熱的無血清高糖DMEM培養液，置于37℃，5%CO2培養箱中水化2 h；吸棄上下室中的無血清培養基，常規制備無血清1%雙抗DMEM單細胞懸液，調整細胞密度為 2×104/mL。

DU-145細胞和PC-3細胞各分兩組：對照組和藥物組。對照組每孔上室中加入500 μL正常DMEM細胞懸液，藥物組每孔上室中加入500 μL化瘀散結組含藥血清培養基稀釋液，下室中加入750μL完全高糖DMEM培養基，每種細胞設3個復孔，置于37℃，5%CO2培養箱培養24 h。固定、結晶染色，倒置顯微鏡下計數、拍照。

2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 細胞消化成單細胞懸液，接入6孔板，數量以貼壁后鋪滿板底為宜；細胞鋪滿板底后用200 μL槍頭制造細胞劃痕；PBS漂洗；加入化瘀散結組含藥血清培養基稀釋液繼續培養24 h，倒置顯微鏡下拍照記錄，計算劃痕愈合率。

2.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-Time PCR）檢測前列腺癌細胞樣本中目的基因表達量的變化 化瘀散結藥物含藥血清設正常劑量組、低劑量組（稀釋100倍）、中劑量組（稀釋50倍）、高劑量組（稀釋10倍），每組3個樣本量。引物設計：SDF-1-F、SDF-1-R、IGF-1-F、IGF-1-R、MMPS-F、MMPS-R、FN-F、FN-R、Actin-F、Actin-R。用超純RNA提取試劑（TaKaRa Code D9108B）提取經化瘀散結組含藥血清培養基稀釋液處理的CAF細胞樣本中總RNA，RNA質量檢測、電泳、消化；用反轉錄試劑盒（TaKaRa code DRRO47A）進行反轉錄。用ABI 7500型熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析。

2.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測相關蛋白表達 取化瘀散結藥物組（含藥血清培養基稀釋液）處理前列腺活化間質細24 h，收集、破碎細胞，提取總蛋白，測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠，蛋白樣品變性、電泳，凝膠轉膜及檢測。將一抗用封閉液稀釋（IGF-1抗體稀釋度均為1∶500，內參抗體稀釋度為1∶1 000）。將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應過夜；二抗室溫反應1 h，曝光及洗片。測定各個條帶和內參（β-肌動蛋白）的灰度值，并計算比值。

2.7 統計學分析 使用SPSS 23．0統計軟件處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），以 P＜0．05表示有統計學差異。

3 結果

3.1 MTT法檢測細胞生長抑制和最適藥物濃度 含藥血清設置不同濃度（濃度分別為10、20、100mg/mL），經過作用DU-145、PC-3細胞24 h后，與健脾扶正組、清熱解毒組相比，化瘀散結組抑制率高（P＜0．01），差異具有統計學意義，且呈一定的劑量依賴性抑制作用。見表 1、2及圖 1、2。

表1 不同濃度藥物對DU-145細胞抑瘤率比較（±s）Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on DU-145 cells（±s）%

表1 不同濃度藥物對DU-145細胞抑瘤率比較（±s）Tab.1 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on DU-145 cells（±s）%

注：與健脾扶正組比較，*P＜0．01；與清熱解毒組比較，#P＜0．01。

組別 濃度10 mg/mL 20 mg/mL 100 mg/mL健脾扶正組化瘀散結組清熱解毒組n 6 6 6 0．20±0．08 4．10±1．02 53．40±2．01 19．80±1．36 39．90±1．84 91．40±2．57*#5．00±1．32 7．40±1．01 19．90±1．43

表2 不同濃度藥物對PC-3細胞抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on PC-3 cells（±s）%

表2 不同濃度藥物對PC-3細胞抑瘤率比較（±s）Tab.2 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on PC-3 cells（±s）%

注：與健脾扶正組比較，*P＜0．01；與清熱解毒組比較，#P＜0．01。

組別 n 濃度1 0 m g/m L 2 0 m g/m L 1 0 0 m g/m L健脾扶正組 6化瘀散結組 6清熱解毒組 6-1 1．9 0±0．9 4 -1 2．1 0±1．0 1 7 7．4 0±2．6 7 1 8．8 0±1．0 2 5 8．9 0±1．8 4 8 7．3 0±2．4 2*#1．3 0±0．5 3 6．1 0±1．0 6 3 1．0 0±1．7 3

圖1 不同濃度藥物對DU-145細胞的抑瘤率（n=6）Fig.1 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on DU-145 cells（n=6）

圖2 不同濃度藥物對PC-3細胞的抑瘤率（n=6）Fig.2 Comparison of tumor inhibition rates of the different concentrations of drugs on PC-3 cells（n=6）

研究結果顯示，健脾利濕化瘀方的各有效拆方組中，化瘀散結組藥物的抑瘤率最高，為進一步細化復方的研究機制，從化瘀散結組藥物入手進一步深化研究其可能的分子機制。

3.2 Transwell實驗評估細胞的侵襲能力 與空白對照組相比，化瘀散結組含藥血清作用后的各組DU-145和PC-3細胞實驗組漏入下室細胞數分別為（7．33±2．51）個和（3．67±0．58）個，顯著少于對照組（22．00±2．65）個和（22．67±7．77）個，差異均具有統計學意義（P＜0．05）。提示化瘀散結藥物能抑制 PC-3、DU-145細胞的侵襲能力。見表3-6和圖3-4。

表3 DU-145細胞各組之間侵襲細胞數結果Tab.3 Result of invading cells’number of DU-145 cells of each group 個

表4 DU-145細胞各組之間侵襲細胞數比較（±s）Tab.4 Comparison of invading cells’number of DU-145 cells of each group（±s） 個

表4 DU-145細胞各組之間侵襲細胞數比較（±s）Tab.4 Comparison of invading cells’number of DU-145 cells of each group（±s） 個

注：與對照組比較，*P＜0．01。

組別 n 侵襲細胞數對照組 3 22．00±2．65化瘀散結藥物含藥血清組 3 7．33±2．51*

表5 PC-3細胞各組之間侵襲細胞數結果Tab.5 Result of invading cells’number of PC-3 cells of each group 個

表6 PC-3細胞各組之間侵襲細胞數比較（±s）Tab.6 Comparison of invading cells’number of PC-3 cells of each group（±s） 個

表6 PC-3細胞各組之間侵襲細胞數比較（±s）Tab.6 Comparison of invading cells’number of PC-3 cells of each group（±s） 個

注：與對照組比較，*P＜0．01。

組別 n 侵襲細胞數對照組 3 22．67±7．77化瘀散結藥物含藥血清組 3 3．67±0．58*

圖3 DU-145細胞各組之間侵襲細胞情況Fig.3 Situation of invading cells of DU-145 cells of each group

3.3 劃痕實驗評估細胞的遷移能力 與陰性對照組相比，化瘀散結藥物作用后的DU-145、PC-3細胞實驗組的細胞遷移能力受到抑制，差異均有統計學意義（P＜0．05）。實驗結果顯示化瘀散結藥物含藥血清組能顯著抑制DU-145、PC-3細胞的遷移能力。見表7-10、圖5-6。

表8 DU-145細胞遷移距離比較（±s）Tab.8 Comparison of migration distance of DU-145 cells（±s） μm

注：與對照組比較，*P＜0．01。

組別 n 遷移距離對照組 2 759．75±40．88化瘀散結藥物含藥血清組 2 453．34±42．74*

表9 兩組PC-3細胞遷移距離Tab.9 Migration distance of PC-3 cells of the two groups μm

表10 PC-3細胞遷移距離比較（±s）Tab.10 Comparison of migration distance of PC-3 cells of each group（±s） μm

表10 PC-3細胞遷移距離比較（±s）Tab.10 Comparison of migration distance of PC-3 cells of each group（±s） μm

注：與對照組比較，*P＜0．01。

組別 n 遷移距離對照組 2 525．40± 6．58化瘀散結藥物含藥血清組 2 330．12±13．15*

圖5 兩組DU-145細胞不同孔劃痕圖Fig.5 Illustration the different scratches of DU-145 cells of two group

圖6 兩組PC-3細胞不同孔劃痕圖Fig.6 Illustration the different scratches of PC-3 cells of two group

3.4 Real-Time PCR檢測前列腺癌細胞樣本中目的基因表達量的變化 研究結果顯示不同劑量組的前列腺活化間質細胞系CAF中的SDF-1基因在低劑量組中表達較低，隨濃度增加其表達量亦逐漸增加。見圖7、表11。

3.5 Western Bolt法檢測CAF細胞基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、MMP、纖維粘連蛋白（FN）蛋白表達的影響 研究結果顯示經化瘀散結藥物作用CAF細胞后，SDF-1、IGF、MMP蛋白表達與陰性對照組相比顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0．05）。見圖 8。

4 討論

近20年來，中醫藥治療前列腺癌已經引起了廣泛的重視，臨床研究也在不斷地進行[15]。中醫藥在增效減毒、提高生活質量、延長生存時間等方面的獨特優勢，使得在CRPC治療中占據了非常重要的位置[16]。

圖8 化瘀散結組藥物對SDF-1、IGF、MMP、FN蛋白表達的影響Fig.8 Effect of protein expression in SDF-1，IGF，MMP and FN by the drugs of Huayu Sanjie group

中醫藥注重辨證論治，謹守病機，抓住病理產物，對腫瘤的治療主要從扶正固本、培補正氣、化瘀解毒、祛痰散結、攻補兼施、虛實兼顧等方面入手[17]。賈英杰教授提出本元虛衰是癌病之根，邪濁（濁毒、瘀濁）內生，久蘊不解，發為腫塊，膠結難化，克伐臟腑經絡，阻礙氣機升降，影響氣血運行，形成濁邪瘀塞局部為腫瘤之核心病機。賈教授基于多年臨床經驗，總結出前列腺癌病機為脾虛濁困、氣虛毒瘀，瘀、毒與濁邪膠著和合，發為濁毒、瘀濁，共同致病。因此，“濁”是形成前列腺癌的核心病機要素。“黜濁”辨治的核心總不離脾胃，脾胃位居中州，納運相合，升降相因，互為舟楫，治濁需重視脾胃升降功能，燮理中焦，斡旋氣機，兼顧肝腎，使得升降有序，化生精微，充養五臟，使濁邪得化，即“治脾胃者即可以安五臟”[18]。

在健脾利濕化瘀方治療脾虛瘀濁互結證晚期CRPC患者取得較好臨床療效的基礎上，本團隊通過動物實驗研究證實復方及其各拆方組均具有一定的抑瘤作用。為進一步從細胞和分子通路上對復方的作用機制進行明確，本研究首先分析健脾扶正組、化瘀散結組、清熱解毒組對前列腺癌PC-3和DU-145細胞的增殖抑制率，并篩選出抑瘤最佳的化瘀散結組，從拆方對前列腺癌PC-3和DU-145細胞的侵襲和遷移研究進一步證實大黃、姜黃、王不留行的抑瘤作用。并通過研究證實大黃、姜黃、王不留行藥物對前列腺癌CAF細胞系IGF/MMP通路相關的IGF-1、MMP、FN、SDF-1基因的相對表達量影響均有所不同。其中，IGF-1是一種促有絲分裂劑，在腫瘤的發生發展中發揮著作用，國內外學者越來越關注其與前列腺癌的關系；IGF-1表達的升高，與前列腺癌的細胞增殖相關，而在本研究中化瘀散結藥物具有降低IGF-1表達的作用，并呈劑量相關性。MMP家族在腫瘤的血管新生、腫瘤細胞的侵襲和轉移灶的形成等過程中扮演著重要的角色。研究結果顯示化瘀散結組藥物含藥血清作用后的前列腺間質細胞分泌的SDF-1、IGF、MMP與上皮細胞增殖存活相關的活性因子表達情況下降。本研究探討了復方健脾利濕化瘀方整體臨床療效的作用機制，從一個方面進行闡述，也為進一步的深入研究提供基礎。