化痰祛濕活血方對非酒精性脂肪性肝炎大鼠模型ADPN/PI3K/AKT通路關(guān)鍵蛋白的影響

張麗慧， 張劍波， 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指無過量飲酒史、以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪儲積為特征的病理綜合征[1]，疾病譜包括非酒精性肝脂肪變、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝細(xì)胞癌(HCC)[2]。肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)特別是甘油三酯(TG)沉積是形成NASH的前提[3]。化痰祛濕活血方是全國第五批名老中醫(yī)指導(dǎo)老師趙文霞教授治療NASH的經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用26年，效果顯著[4-5]。前期體內(nèi)、外實驗均顯示化痰祛濕活血方可通過升高脂聯(lián)素(adiponectin, ADPN)及AdipoR2 mRNA水平，減少肝細(xì)胞內(nèi)脂肪蓄積，減輕肝臟炎性，表明化痰祛濕活血方在降脂保肝、改善脂質(zhì)蓄積等方面的療效與其激活A(yù)DPN相關(guān)[6]，但具體機制尚不明確。本研究觀察化痰祛濕活血方對ADPN相關(guān)信號通路PI3K/Akt/NF-κB蛋白的影響，探討此信號通路與NASH相關(guān)炎癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，進而探究其防治NASH的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD雄性大鼠72只，SPF級，體質(zhì)量(150±10)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物合格證號：11400700116588；許可證號：SXYK(豫)2015-0005。本研究方案經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)審批(批號：DWLL15010018)，符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

1.1.2 藥物 化痰祛濕活血方顆粒劑：澤瀉，批號：15120135；丹參，批號：15060138；海藻，批號：15070027；郁金，批號：15060128；決明子，批號：15090036；山楂，批號：15060020；柴胡，批號：15070208；水飛薊，批號：15070223；由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿膠囊：賽諾菲(北京)制藥有限公司，批號：5JD070。高脂飼料：普通飼料(84%)、豬油(10%)、蛋黃粉(5%)、膽固醇(1%)。飼料由河南省實驗動物中心加工而成。

1.1.3 試劑 Anti-Adiponectin抗體(CST公司，貨號：2789S)；Anti-ADIPOR2抗體(ProteinTech公司，貨號：14361-1-AP)；Anti-PI3Kinase p85抗體(ABCAM公司，貨號：ab180967)；Anti-AKT1/2抗體(ABCAM公司，貨號：ab188099)；Anti-AKT1 (phospho T308)抗體(ABCAM公司，貨號：ab66134)；Anti-NF-κB p65抗體(ABCAM公司，貨號：ab16502)；Anti-NF-κB p65 (phospho S536)抗體(ABCAM公司，貨號：ab86299)；β-Actin 抗體(ProteinTech公司，貨號：20536-1-AP)；GAPDH抗體(ProteinTech公司，貨號：10494-1-AP)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Fisher公司，貨號：23227)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 BS-0220生化分析儀(深圳邁瑞)，電泳儀(BIO-RAD，美國)，凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD，美國)。

1.2 方法

1.2.1 NASH大鼠模型制備 參考文獻[7]并結(jié)合前期實驗結(jié)果，選定制備NASH大鼠模型制備方法：高脂飼料，喂養(yǎng)9周。

1.2.2 動物分組與用藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠按體質(zhì)量分層隨機分為空白組、模型組、多烯組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，共6組，每組12只。空白組給予普通飼料，其余各組給予高脂飼料，喂養(yǎng)9周。同時模型組給予生理鹽水1 ml·100 g-1·d-1灌胃，其余治療組分別給予多烯磷脂酰膽堿膠囊混懸液0.028 5 g·100 g-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量的10倍)灌胃，化痰祛濕活血方5.04 g·100 g-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量的20倍)灌胃，化痰祛濕活血方2.52 g·100 g-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量的10倍)灌胃，化痰祛濕活血方1.26 g·100 g-1·d-1(相當(dāng)于成人劑量的5倍)灌胃。模型組大鼠因相互撕咬死亡1只，化痰祛濕活血方高、中、低劑量組大鼠分別因灌胃不當(dāng)死亡1只，中劑量組大鼠相互撕咬死亡1只，多烯組灌胃不當(dāng)死亡1只。第10周實驗結(jié)束后，處死大鼠，采集大鼠血液、肝組織。血液離心后留取上清，立即行生化學(xué)檢測。新鮮肝組織低溫轉(zhuǎn)送本院病理科行冰凍切片，備做油紅O染色，剩余肝組織用錫紙包裹，液氮快速冷凍后，放至-80 ℃冰箱，備做蛋白檢測。

1.2.3 肝組織油紅O染色 新鮮肝組織用OTC包埋劑包埋，甲醛鈣固定，60%異丙醇清洗，油紅次液(油紅原液與雙蒸水比例為3∶2，定性濾紙過濾掉沉渣，現(xiàn)配現(xiàn)用)染色，60%異丙醇洗浮色，蒸餾水洗，蘇木精染核，蒸餾水洗，晾干，封片，觀察，攝片。

1.2.4 血清生化指標(biāo)變化 采用邁瑞B(yǎng)S-220全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST、ALP、GGT、TC、TG水平。

1.2.5 肝組織蛋白檢測(Western-Blot法) BCA法測定蛋白含量。取蛋白30 μg經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜，而后用封閉液室溫?fù)u床封閉1 h，經(jīng)過3次洗膜，用一抗室溫?fù)u床孵育10 min，4 ℃冰箱過夜。分別加入二抗，生化培養(yǎng)箱37 ℃，30 min孵育，再經(jīng)過3次洗膜，每次5 min。取ECL化學(xué)發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)成像拍照分析。同時以β-actin/GAPDH作為內(nèi)參，檢測ADPN、AdipoR2、PI3K、Akt、pAkt、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表達情況。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織油紅O染色 空白組肝細(xì)胞胞漿、胞核呈藍色，未見明顯橘紅色脂滴。模型組肝細(xì)胞胞漿中可見多個大小不等的橘紅色脂滴，呈彌漫性分布，驗證造模成功。各用藥組肝細(xì)胞脂滴縮小并減少，染色變淺，其中中藥高劑量組僅有少量細(xì)小紅色脂滴呈散在性分布，與空白組最為接近(圖1)。

2.2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 與空白組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TG、TC水平均顯著增高(P值均<0.05)；與模型組比較，所有治療組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TG、TC水平均顯著降低(P值均<0.05)；與多烯組比較，高劑量組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、TG、TC水平均顯著降低(P值均<0.05)(表1)。

注：a，空白組；b，模型組；c，多烯組；d，高劑量組；e，中劑量組；f，低劑量組。

2.3 各組肝組織ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表達情況 與空白組比較，模型組大鼠肝組織中ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表達均明顯降低(P值均<0.05)；與模型組比較，各治療組ADPN、AdipoR2蛋白表達均明顯升高(P值均<0.05)，高、中、低劑量組PI3K蛋白表達亦明顯升高(P值均<0.05)；與多烯組比較，高劑量組ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表達均顯著增加(P值均<0.05)(圖2，表2)。

圖2 各組大鼠肝組織ADPN、AdipoR2、PI3K蛋白表達電泳圖

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與多烯組比較，3)P<0.05。

2.4 各組肝組織Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達情況 與空白組比較，模型組大鼠肝組織Akt、p-Akt蛋白表達均明顯降低(P值均<0.05)，NF-κB、p-NF-κB蛋白表達均明顯升高(P值均<0.05)；與模型組比較，各治療組大鼠肝組織p-Akt蛋白表達均明顯升高(P值均<0.05)，NF-κB、p-NF-κB蛋白表達均明顯降低(P值均<0.05)；與多烯組比較，高劑量組p-Akt蛋白表達明顯升高，NF-κB、p-NF-κB蛋白表達均明顯降低(P值均<0.05)(圖3，表3)。

圖3 各組大鼠肝組織Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB蛋白表達電泳圖

3 討論

“二次打擊”學(xué)說是目前公認(rèn)的NASH發(fā)病機制，脂質(zhì)過氧化損傷，微粒體、線粒體功能受抑制，肝細(xì)胞凋亡、星狀細(xì)胞激活，誘發(fā)NASH和肝纖維化[8-9]。

研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，ADPN能夠改善胰島素抵抗，增加脂肪氧化分解血清游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)，降低FFA水平、抑制炎癥因子的產(chǎn)生，進而阻斷NASH的形成與進展。但ADPN與其受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)作用，其受體主要有 AdipoR1和AdipoR2兩種，AdipoR2主要存在于肝臟[12]。ADPN與其受體結(jié)合后，發(fā)揮多種生物學(xué)作用，如抗肥胖、抗炎、抗動脈粥樣硬化等，減少體脂肪，改善胰島素抵抗[13]。其下游 PI3K-Akt 信號通路通過對下游分子的活性調(diào)節(jié)調(diào)控糖異生及脂肪酸合成，而傳導(dǎo)通路的阻滯是外周組織胰島素抵抗發(fā)生的基本機制之一。特異性激活PI3K-Akt 信號通路是包括糖尿病等胰島素抵抗相關(guān)的多種疾病的潛在干預(yù)靶點[14]。磷酸化激活的Akt，可進一步磷酸化NF-κB、Caspase-9、GSK- 3、FoxOs及mTOR等蛋白，介導(dǎo)胰島素抵抗及細(xì)胞增殖、周期調(diào)節(jié)等[15]。NF-κB 調(diào)節(jié)多種靶基因的表達，可高效誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子(如IL-6、TGFβ1、TNFα)、趨化因子(如IL-8、補體C3)、急性期反應(yīng)蛋白(如C反應(yīng)蛋白、β-微球蛋白)、黏附分子、免疫識別受體的表達。同時對參與炎癥反應(yīng)放大與延續(xù)的相關(guān)酶(一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶-2等)的基因表達有重要的調(diào)控作用[16]。

NASH主要因飲食不節(jié)、過度肥胖、久坐少動、精神緊張等病因?qū)е赂问栊故殻⑦\化失權(quán)，水濕內(nèi)停，痰濁內(nèi)生，氣滯血瘀[17]。脾虛失運是導(dǎo)致NASH的起始原因，隨著病程進展，土虛木乘，肝脾失調(diào)，痰濕內(nèi)生，惡性循環(huán)[18]。總病機為痰濕蘊結(jié)、氣血阻滯，久則閉阻肝絡(luò)誘發(fā)本病。本研究以化痰祛濕活血為治則，方中以澤瀉利水滲濕、行氣消瘀為君藥，丹參活血化瘀、涼血安神，郁金活血止痛、行氣解郁，海藻化痰利濕、軟堅消痰，共為臣藥，決明子清肝明目，山楂消積散瘀，水飛薊清熱解毒，共為佐藥，柴胡疏肝理氣，引藥入肝經(jīng)為使藥。全方共奏化痰祛濕活血之功效。經(jīng)臨床及實驗研究證實其有良好治療NASH作用。

表2 各組大鼠肝組織蛋白ADPN、AdipoR2、PI3K相對表達水平比較

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與多烯組比較，3)P<0.05。

表3 各組大鼠肝組織蛋白Akt、p-Akt、NF-κB、p-NF-κB相對表達水平比較

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與多烯組比較，3)P<0.05。

本實驗結(jié)果顯示，NASH大鼠肝組織AdipoR2、PI3K、pAkt蛋白表達降低，炎癥激活因子NF-κB、p-NF-κB蛋白表達升高，化痰祛濕活血方可能通過上調(diào)ADPN，上調(diào)PI3K、Akt，進而抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活而達到治療NASH的作用，有效改善血清肝功能及血脂水平。且化痰祛濕活血方高劑量組優(yōu)于中、低劑量組，說明化痰祛濕活血方可能存在劑量依賴效應(yīng)。目前尚無NASH特異性治療藥物，該研究有助于中藥在NASH中的擴大應(yīng)用，為臨床治療NASH提供理論依據(jù)。