急性胰腺炎患者血小板微粒水平變化及其對中性粒細胞胞外捕獲網形成的作用

祁琴琴， 楊 彬， 李會會， 鮑峻峻， 李鴻曄， 王兵兵， 梅 俏

安徽醫科大學第一附屬醫院 消化內科， 合肥 230022

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)臨床上多表現為輕型[1]，但有20%～30%的AP患者可發展成重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) ，SAP病死率高達30%[2]。胰腺炎發病機制尚未完全闡明[3-4]，中性粒細胞激活胰蛋白酶引起胰腺組織損傷[5-6]，在AP發病過程中發揮關鍵作用。研究[7]表明，血小板在中性粒細胞促進胰腺損傷的過程中具有重要影響。血小板可以誘導胰腺內皮細胞表達P-選擇素，促進中性粒細胞活化并介導血小板依賴的胰腺組織浸潤。同時，血小板通過表面表達的Toll樣受體(TLR)4，可結合中性粒細胞釋放中性粒細胞胞外捕獲網(neutrophil extracellular traps，NETs)[8-9]，加重胰腺組織損傷。

胰腺炎患者發病過程存在血小板數量增加或減少的現象[10-11]，血小板活化脫顆粒，釋放活性物質，加重胰腺炎癥損傷過程[12]。血小板活化過程中可形成大量血小板微粒(platelet microparticles，PMPs)[13-14]，PMPs功能與活化的血小板相似，含有血小板膜組分及大量損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)，如高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein, HMGB1)、P-選擇素和GPⅡb(CD41)等，促進炎癥細胞的募集和黏附，釋放蛋白水解酶及氧自由基等損傷胰腺實質細胞[15-16]。PMPs在急性心肌梗塞、類風濕關節炎、慢性腎臟病等患者中水平均明顯升高[17-19]，表明PMPs與機體炎癥反應調節密切相關。但在胰腺炎過程中PMPs水平的改變尚不清楚。因此，本文通過檢測胰腺炎過程中PMPs水平的改變，以及PMPs刺激中性粒細胞釋放NETs的能力，探討PMPs參與AP病理生理過程的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2018年9月-2019年8月本院收治的AP患者55例，其中輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)26例，中重癥急性胰腺炎(moderately severe acute pancreatitis，MSAP)17例，重癥急性胰腺炎(SAP)12例，AP診斷標準參考亞特蘭大分類新標準共識[20]。另選取15例健康體檢查為對照組。本研究經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準(批號：PJ2018-12-17)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 PMPs分離 收集患者入院后(24 h內)次日晨血5 ml于檸檬酸鈉抗凝管中，以1000 r/min離心10 min獲取富血小板血漿，再將其以3500 r/min離心15 min，獲取貧血小板血漿(PPP)，-80 ℃保存。

1.3 PMPs檢測 將PPP冰上解凍，抽取50 μl PPP，加入5 μl CD61-PE充分混合孵育20 min，加入5 μl AnnexinV- FITC和400 μl Bindbuffer孵育20 min，再加入40 μl Flow-CountTM熒光計數微球充分混合，采用流式細胞儀檢測PMPs。使用5 μl兔抗人PE-IgG1及5 μl FITC-IgG1作為對照。CD61-PE 及 AnnexinV- FITC雙陽性為PMPs，根據熒光計數微球計算PMPs水平。

1.4 NETs形成能力的檢測

1.4.1 ELISA檢測髓過氧化物酶(MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)和組蛋白H3 留取健康體檢者晨血4 ml于EDTA抗凝管中，按照外周中性粒細胞分離試劑盒操作。在細胞培養板中置入圓形玻片，加入500 μl細胞懸浮液。分為兩組，一組加入250 μl AP患者的PMPs，另一組加入等量生理鹽水作為對照組。于37℃，5%CO2中培養6 h，滴管吸取上清液700 μl于EP管中， 1500 r/min離心5 min，再次取上清液。采用 ELISA方法檢測上清液中MPO、NE、組蛋白H3的水平。

1.4.2 激光共聚焦顯微鏡下觀察NETs 取出上述細胞培養板底的圓形玻片，細胞面向下放置于載玻片，滴加多聚甲醛溶液(4% PFA)固定10 min，PBS洗滌3次， 0.05% Triton×300 μl室溫下破膜1min，用1%BSA封閉1 h。兔抗人CD61抗體(一抗)濕盒中4 ℃孵育過夜，PBS洗滌 5 次。加山羊抗兔IgG-H&L(二抗)37℃避光孵育 1 h，PBS緩沖液洗滌 5 次。再使用Alexa Fluor555標記組蛋白H3和DAPI在室溫下避光孵育 15 min進行免疫熒光染色，PBS 洗滌 3 次，封片，暗盒放置。激光共聚焦顯微鏡觀察NETs分布情況。

2 結果

2.1 一般資料 MAP組男22例，女4例，年齡(42.58±14.31)歲；MSAP組男12例，女5例，年齡(50.88±17.97)歲；SAP組男8例，女4例，年齡(48.25±18.12)歲；對照組15例，男11例，女4例，年齡(47.21±16.54)歲，各組性別、年齡差異均無統計學意義(P值均>0.05)。55例AP患者中膽源性17例，高脂血癥型21例，自身免疫型1例，混合型6例，其他10例。

2.2 AP患者中PMPs水平比較 與對照組相比[172.00(148.25～204.25)個/μl]，MAP、MSAP、SAP組PMPs水平明顯升高[179.50(145.00～308.750)個/μl、1117.50(483.00～2488.25)個/μl、1848.00(1216.50～2562.00)個/μl，H值分別為4.348、23.186、19.292，P值均<0.05]。與 MAP 組、 MSAP 組比較，SAP組PMPs水平明顯升高(H值分別為29.068、4.709，P值均<0.05)(圖1)。

2.3 AP患者中PMPs水平與臨床特征的相關性 AP患者的PMPs水平與APACHEⅡ評分、BISAP評分、Ranson評分均呈正相關，且差異均有統計學意義(r值分別0.636、0.508、0.430，P值均<0.001)。

注：a，對照組； b，MAP組； c，MSAP組； d，SAP組。

2.4 AP患者中PMPs促進NETs形成能力的檢測 與對照組對比，AP組中MPO、NE和組蛋白H3水平均明顯增加(P值均<0.001)(表1)。

激光共聚焦顯微鏡觀察可見AP組中性粒細胞釋放NETs形成，對照組未發現明顯NETs形成(圖2)。

表1 AP組和對照組MPO、NE、組蛋白H3水平比較

3 討論

由于AP常伴發全身炎癥反應和多器官功能障礙，SAP病死率明顯升高。研究[21]表明，活化的血小板分泌多種炎癥細胞因子和趨化因子，募集中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞至靶器官，加重器官炎癥過程，因此，血小板活化在胰腺局部炎癥和遠端器官衰竭中具有重要影響。Rahman等[22]研究表明血小板CD40L可介導膿毒癥引起中性粒細胞活化且募集于肺組織，引起肺水腫。Wetterholm等[23]發現在AP中血小板衍生的趨化因子CXCL4刺激中性粒細胞積聚，消耗血小板可以降低CXCL4水平，減少中性粒細胞募集、IL-6分泌和胰腺組織損傷。

注： a-b，AP組，圖a(×20)中可見中性粒細胞細胞破壞釋放NETs，如白色箭頭所示；圖b(×63，油鏡)中白色箭頭所指為NETs；c-d，對照組，未見NETs。

圖2激光共聚焦顯微鏡下AP組和對照組中NETs的形成

PMPs釋放是血小板活化過程的重要標志[24]， PMPs具有與活化血小板相似的功能，含有血小板膜組分及大量DAMPs如HMGB1、P-選擇素和GPⅡb(CD41)等，促進炎癥細胞的募集并黏附于靶器官[25]。PMPs增高與許多炎癥免疫性疾病相關。Boilard等[18]研究發現類風濕性關節炎患者血清中 PMPs 增加，關節腔滑膜液中PMPs水平高于血清中 PMPs水平，但在骨關節炎患者關節腔滑膜液中未檢測到PMPs，提示血小板可能通過炎癥關節的血管進入關節腔，膠原活化血小板釋放 PMPs。Nadaud等[26]發現肺動脈高壓患者中PMPs水平增多， PMPs促凝能力大于活化的血小板，增加血栓形成的風險。本研究發現AP患者中PMPs水平升高，且SAP組PMPs水平明顯高于MSAP、MAP組， PMPs與ARECHEⅡ、BISAP、Ranson評分呈正相關，表明PMPs參與AP進展過程，可作為AP疾病嚴重程度評估的指標。

研究[27]表明，胰腺組織局部可檢測出NETs的組分MPO、NE、組蛋白、DNA 等。Brinkmann等[28]發現中性粒細胞胞外NETs是以 DNA為骨架，鑲嵌MPO、NE、組蛋白等蛋白質。NETs參與清除外源性病原體，同時參與體內無菌性炎癥過程如自身免疫性疾病等[29-31]。Merza等[32]發現通過牛磺膽酸鹽引起的的小鼠胰腺炎中，可檢測到胰腺組織中NETs形成。Bilyy等[33]發現在嚴重壞死的胰腺組織中， NE和瓜氨酸化組蛋白H3均陽性。Leppkes等[34]觀察到中性粒細胞可能在炎癥條件下進入胰管并形成NETs，造成胰管內阻塞，促進AP發生。在急性肺損傷小鼠模型中發現，活化的血小板能夠刺激中性粒細胞釋放 NETs，抑制血小板活化可以減少 NETs 的釋放和組織損傷[35]。本研究發現來源于AP患者的PMPs，在體外與健康人中性粒細胞共同培養后可觀察到NETs形成，同時發現AP組中MPO、NE和組蛋白H3較對照組水平增高，可能在AP患者中導致胰管阻塞，進一步加重胰腺炎癥過程。Murthy等[27]研究表明，AP患者血中NETs形成的標志物與對照相比顯著升高，重癥AP較輕度AP升高明顯，與本研究結果相符。

綜上所述，AP中血小板活化生成PMPs，刺激中性粒細胞釋放NETs阻塞胰管，加重AP嚴重程度，表明PMPs可作為AP疾病嚴重程度評估的指標，降低 PMPs形成NETs能力可能有助于抑制胰腺的炎癥損傷過程。