HBV介導的肝星狀細胞和天然免疫細胞的相互作用

楊苗苗， 鄔志惠， 涂正坤

吉林大學第一醫院 轉化醫學研究院， 長春 130021

HBV感染是一個關乎全世界人類健康的公共衛生問題。HBV感染肝細胞后不直接造成肝細胞損傷，但誘導肝臟內固有免疫和適應性免疫應答，從而引起肝臟炎癥和損傷[1]。持續的HBV感染最終導致各種肝臟疾病，包括肝硬化、肝癌以及肝衰竭[2]。

肝星狀細胞(HSC)作為肝纖維化形成的主要效應細胞，占所有肝實質細胞的5%左右[3]。位于肝竇間隙的HSC，與肝細胞及肝臟非實質細胞存在密切關系。在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的研究[4]中發現，活化的HSC誘導肝脂肪病變并且促進炎性分子的產生。在穩定的生理條件下，HSC通過分泌趨化因子誘導外周單核細胞向肝臟的募集維持肝臟巨噬細胞的水平，同時將單核細胞印上Kupffer細胞的記號，形成肝組織特異性的巨噬細胞[5]。患者肝臟中HSC與自然殺傷細胞(NK細胞)的接觸更加頻繁，免疫組織化學結果顯示HSC周圍的NK細胞數量明顯增加。因此，探究HBV作用下HSC與肝內細胞之間的相互作用對明確HBV引起的肝臟疾病的發病機制具有重要指導作用。

肝臟內單核/巨噬細胞通過其強大的吞噬能力、細胞表面高密度的模式識別受體以及釋放的細胞因子調節肝臟的天然免疫，抵御病原體的侵害維持肝臟環境穩定。在肝損傷后單核/巨噬細胞通過降解細胞外基質和釋放抗炎細胞因子緩解炎癥和纖維化。隨著不斷深入的研究發現單核/巨噬細胞的極化和功能可以被病原體以及肝內細胞調節，其中HSC對單核/巨噬細胞的調節至關重要[6]。

NK細胞是機體抵抗病毒感染和腫瘤的主要天然免疫成分[7]，在抑制肝纖維化方面發揮著重要作用，主要通過殺傷活化的HSC發揮抗纖維化功能[8]。但是對于病原體及肝內細胞對NK細胞的調節作用研究相對較少。事實證明，HBV感染導致肝內NK細胞的功能障礙，活化的HSC可抑制NK細胞的活力。

本文探討了HBV誘導免疫應答和肝臟炎癥對肝纖維化的作用。在HBV作用的條件下，強調HSC、單核/巨細胞和NK細胞的免疫調節作用，從不同的角度闡述肝內非實質細胞對HBV相關的疾病的影響。

1 HBV誘導的肝臟炎癥及其對肝纖維化的影響

1.1 HBV與肝臟炎癥 HBV感染后引起的異常的免疫應答導致肝臟炎癥的形成，但是，對于HBV感染誘導的肝臟炎癥的確切機制尚不完全清楚。大量證據[9]表明，由內源性損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)觸發的HBV非特異性免疫應答是引發肝臟炎癥的主要原因。HBV感染后導致天然免疫細胞的浸潤和活化，導致凋亡或壞死肝細胞中DAMPs的積累，而DAMPs是最有效的炎癥信號。內源性DAMPs被認為具有特定的免疫原性，可以作用于單核/巨噬細胞表面的Toll樣受體(TLR)2和TLR4，促進Caspase-1激活釋放IL-1β，也可與樹突狀細胞細胞的TLR9作用募集MyD88，隨后激活NF-κB和AP-1，從而傳遞炎癥信號。HBV感染后肝臟中NK細胞的數量增加了近20倍，主要通過產生IFNγ發揮作用，激活NKT細胞導致快速的肝臟炎癥反應。HBV感染后導致中性粒細胞的浸潤并且通過釋放細胞毒素和活性氧(ROS)影響肝臟炎癥，肝細胞的壞死也可引起嚴重的中性粒細胞炎癥導致肝損傷加重[10]。

1.2 肝纖維化的啟動 關于肝纖維化發病機制的一般理論認為，纖維化是由炎癥引起的，慢性炎癥激活HSC分化為肌成纖維細胞樣細胞，產生細胞外基質，同時天然免疫系統在調節纖維化過程中也起關鍵作用，但對于HBV相關的肝纖維化機制尚未完全闡明。HBV引起肝臟炎癥后，大量的炎性因子刺激免疫細胞表達血小板生長因子、結締組織生長因子，TGFβ以及IL-13，誘導HSC活化[11]。研究[12]顯示，肝損傷后肝細胞通過釋放可溶性細胞因子啟動HSC的活化，而壞死的肝細胞釋放的DAMPs引發的炎癥通過直接或間接的方式啟動纖維化的發生。早期研究[13]表明HSC能夠吞噬肝細胞的凋亡小體，誘導HSC中還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的激活，從而激活HSC。因此，HSC的激活離不開肝內細胞及其產生的細胞因子的作用。

2 單核/巨噬細胞與HSC的相互作用

2.1 HBV誘導抑制性單核/巨噬細胞 單核/巨噬細胞是一種異質性的天然免疫細群，主要分為兩大類，即“促炎性”的M1和“免疫調節性”的M2樣巨噬細胞。M1型細胞的主要功能是清除細菌、抗病毒以及釋放炎性細胞因子(TNF、IL-1、IL-12、ROS)；M2型細胞促進組織纖維化、組織重塑、創傷愈合及分泌免疫調節介質(IL-10、TGFβ、IL-4)[14]。

臨床資料[15]顯示，HBV誘導的肝臟疾病與M2樣巨噬細胞高水平浸潤有關。在慢性HBV感染者體內發現M2樣巨噬細胞積累，在急性HBV誘發的肝衰竭患者中，肝臟中M2樣巨噬細胞形成加速肝纖維化的發生。筆者在人源化小鼠HBV感染模型中已經證實，HBV誘導的肝臟疾病和肝臟免疫損傷與M2樣巨噬細胞的產生有關，HBV誘導M2樣巨噬細胞表現為CD14highCD68highCD16lowCD163highCD206highIL-1RAhigh。同時，HBV誘導的M2樣巨噬細胞是強效的免疫抑制細胞，表達高水平的IL-10、共抑制分子(B7-H4)，下調IL-12、TNFα和共刺激分子(CD86)。進一步的體外實驗[16]表明，HBsAg和HBV通過TLR/MyD88/NF-κB信號通路誘導單核細胞程序性死亡受體-配體1(PD-L1)、人類白細胞抗原(HLA)-E及免疫調節因子表達。由此推測，HBV誘導的抑制性單核/巨噬細胞對HBV的持續感染以及肝纖維化的發生可能具有重要作用。

2.2 單核/巨噬細胞激活HSC 單核/巨噬細胞在慢性肝臟疾病的發病機制中起著重要作用，被認為是調節肝纖維化的潛在靶點。體外實驗[17]顯示，HBV感染期間單核/巨噬細胞產生大量的細胞因子和趨化因子，包括TNFα，IL-1β，TGFβ，單核細胞趨化蛋白1(MCP1)和趨化因子(CCL5)等，而單核/巨噬細胞分泌的CCL5通過NF-κB/ERK信號轉導途徑可誘導HSC活化，導致HSC炎癥分子[NOD樣受體蛋白3(NLRP3)、IL-1β、IL-6]和促纖維化基因的表達[18]。此外，HBV感染后優先刺激肝臟巨噬細胞產生促纖維化/抗炎性細胞因子TGFβ，而不是促炎性細胞因子IL-6，IL-1和TNFα[19]。眾所周知，TGFβ是激活肝臟HSC最有效的分子，TGFβ通過與HSC表面的TGFβ受體結合，誘導胞質內Smad2/Smad3復合物磷酸化，再與Smad4結合形成核轉錄調節分子，啟動HSC促纖維化基因(α-SMA、Collagen Ⅰ、MMPs、TGFβ)的表達，導致膠原蛋白等細胞外基質向胞外釋放引起肝纖維化的發生[17]。

2.3 HSC調節單核/巨噬細胞 HBV誘導單核細胞激活HSC后，活化的HSC反過來調節單核/巨噬細胞的分化及功能?；罨腍SC誘導外周單核細胞以及肝內單核細胞分化成為可分泌IL-10和TGFβ的具有免疫調節作用的單核細胞[20]?；罨腍SC促進骨髓來源的免疫抑制性細胞(myeloid immunosuppressive cell，MDSC)的積累，尤其是單核來源的MDSC?；罨腍SC通過COX2-PGE2-EP4信號傳導促進MDSC分化，用COX2抑制劑抑制PEG2的產生可顯著減少MDSC的積累，而且活化的HSC誘導的MDSC通過誘導型一氧化氮合酶、精氨酸酶1和IL-4Rα發揮免疫抑制作用[21]。研究[22]報道，活化的HSC通過CD44依賴的方式誘導外周血單核細胞分化為CD14+HLA-DRlowMDSC， MDSC以精氨酸酶依賴性方式抑制T淋巴細胞增殖。除此之外，活化的HSC產生許多可溶性因子，如粒細胞-單核細胞集落生長因子(GM-CSF)、單核細胞集落生長因子(M-CSF)、血管內皮生長因子(VEGF)和C3都參與MDSC分化。

隨著研究的不斷探索，進一步證實了活化的HSC免疫調節作用，將單核細胞與活化的HSC共培養發現，活化的HSC可以上調單核細胞表面CD15和CCL2受體(CCR2)的表達，其中CCR2與免疫抑制性的M2表型有關[23]，上調免疫抑制細胞因子(IL-10、TGFβ1)的表達，下調炎癥細胞因子(TNFα、IL-1β)的產生[24]。這些研究結果顯示活化的HSC對單核細胞具有重新編程能力。

3 NK細胞與HSC的相互作用

3.1 HBV感染導致NK細胞功能障礙 NK細胞作為肝臟內一類重要的固有免疫細胞，約占肝臟內淋巴細胞的30%[25]。眾所周知，外周血中NK細胞主要分為兩群，其中超過95%的是CD56dimCD16+NK細胞，其含有大量的細胞毒性顆?？汕宄w內感染、衰老以及受損的細胞；而CD56brightCD16-NK細胞僅占5%左右，其細胞毒作用小，主要以分泌細胞因子為主，具有免疫調節功能[26-27]。

臨床數據[28]顯示，HBV慢性感染者血清中的外泌體內含有HBV核酸和蛋白，NK細胞將含有HBV的外泌體攝入后，導致NK細胞IFNγ的產生、細胞毒作用、細胞增殖和存活等能力下降。與健康對照相比，慢性HBV患者體內的NK細胞數量以及細胞因子的表達顯著降低[29]。同時，HBV感染后體內高水平的IL-10是導致NK細胞功能缺陷的主要原因，阻斷IL-10或使用抗病毒治療藥物可恢復NK細胞的殺傷活力和IFNγ的產生[30]。HBV相關的免疫微環境抑制了NK細胞表面模式識別受體的表達，導致NF-κB和P38絲裂原活化蛋白激酶途徑被抑制，使NK細胞在清除HBV感染的肝細胞過程中出現功能障礙[31]。筆者實驗[32]結果證明，HBV調節的單核細胞與NK細胞表達的程序性死亡受體(PD-1)、CD94通過受體-配體結合的方式相互作用，誘導NK細胞表達IL-10產生免疫抑制效應。因此，在HBV感染期間NK細胞呈現功能失活的狀態，喪失對病毒感染的肝細胞以及衰老細胞的清除作用，促進了肝臟疾病的發展。

3.2 NK細胞殺傷HSC 自2006年首次提出NK細胞對激活的HSC具有細胞毒作用以來，人們對NK細胞與HSC相互作用的機制進行了廣泛的研究[32]。早期HBV感染，NK細胞通過各種不同的作用機制誘導活化的HSC凋亡從而控制纖維化的發生。首先必須明確，HBV不能直接作用于NK細胞誘導細胞的激活，而是在HBV作用的免疫微環境中借助其他細胞因子(IL-18、TNFα)誘導NK細胞的激活。激活的NK細胞通過TRAIL殺傷活化的HSC被認為是NK細胞發揮抗纖維化作用的有效作用機制之一。同時，筆者[33]實驗室研究發現IL-18和poly I∶C 協同作用激活NK細胞的P38/PI3K /AKT信號通路，誘導NK細胞IFNγ和TNF相關的凋亡誘導配體的表達增加，活化的NK細胞以TRAIL依賴的脫顆粒方式分泌穿孔素和顆粒酶B靶向殺傷活化的HSC[34]。但是，與早期HBV相關的肝纖維化患者相比，晚期患者NK細胞的激活受體表達、細胞因子和穿孔素的產生發生了明顯變化，其中NK細胞的數量、NKp46的表達、穿孔素和IFNγ的產生明顯降低，這些結果提示晚期患者肝內NK細胞對活化的HSC殺傷作用降低，抗纖維化功能減弱[35]。

3.3 HSC調節NK細胞功能 迄今為止，對NK細胞的免疫特性以及肝纖維化過程中HSC對NK細胞調節的研究較少，特別是在慢性HBV感染相關的肝纖維化患者中。事實上，慢性肝損傷期間TGFβ通過下調NKG2D(CD314)和2B4(CD244)的表達抑制NK細胞的抗纖維化活性。在晚期肝纖維化中活化的HSC通過上調TGFβ的表達抑制NK細胞的脫顆粒作用以及IFNγ的產生，從而破壞NK細胞對HSC的殺傷作用[36]。HSC活化期間，視黃醇被代謝成維甲酸，維甲酸通過誘導HSC的細胞因子抑制信號1產生，抑制NK細胞的活力和IFNγ的產生[37]。近年來研究[38]發現，活化的HSC以內吞的方式將功能受損的NK細胞吞入細胞內，在HSC細胞內溶酶體及各種水解酶作用下進行消化，減少NK細胞的數量并且阻礙NK細胞的功能。因此，HBV感染期間，活化的HSC通過調節NK細胞的功能促進肝纖維化進展。

4 小結

HBV感染引起肝臟免疫應答是由肝細胞、HSC、單核/巨噬細胞及NK細胞共同參與的反應，它們在肝臟中通過雙向調節維持肝臟的免疫穩態，控制纖維化的發生和修復。如圖1所示，HBV感染后形成的炎癥微環境，不僅引起免疫細胞的激活，而且激活HSC導致肝臟纖維化。NK細胞在肝臟中除了調控HBV感染，也可殺傷活化的HSC控制纖維化的發展。HSC誘導單核細胞分化為具有免疫抑制作用的調節細胞，誘導NK細胞功能障礙。綜上所述，HBV感染引起的肝纖維化不是某種細胞單獨作用的結果，而是多種細胞共同作用的結果，了解各個細胞之間的相互作用才能更好地預防和治療肝纖維化。

注：ECM，細胞外基質；PDGF，血小板衍生生長因子；COX2，環氧合酶2；GrzmB，顆粒酶B。

圖1HBV相關的肝細胞、單核/巨噬細胞、NK細胞和HSC之間的相互作用示意圖