食源二肽基肽酶IV抑制劑的研究進(jìn)展

趙 蕊，姚鑫淼，周 野，管立軍，張英蕾，李哲濱，沈卉芳，崔怡娟，盧淑雯*

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

糖尿病是一種危害性很大的代謝類(lèi)疾病，其特征是由于體內(nèi)無(wú)法分泌胰島素（I型糖尿病）或出現(xiàn)胰島素抗性（II型糖尿病）而造成血糖調(diào)節(jié)異常。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)在2015年估測(cè)，世界范圍內(nèi)約有8.8%的成人（20～79 歲）患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2050年，世界人口的10.4%將罹患糖尿病[1]。II型糖尿病是發(fā)病率最高的糖尿病類(lèi)型，約占發(fā)病人數(shù)的91%[1]。治療II型糖尿病需要提高體內(nèi)胰島素的水平，直接注射胰島素或通過(guò)藥劑提高胰島素的分泌、改善胰島素敏感性、延緩腸道對(duì)碳水化合物的吸收和/或提高對(duì)葡萄糖的排除等方式都可以達(dá)到有效治療II型糖尿病的目的[2]。DPP-IV抑制劑是一種胰島素分泌促進(jìn)劑，通過(guò)抑制DPP-IV對(duì)腸促胰島素胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖抑制多肽的降解，從而提高餐后胰島素的水平[3]。然而，人工合成的DPP-IV抑制劑常會(huì)引發(fā)比較嚴(yán)重的副反應(yīng)，如頭疼、腹瀉、尿路感染、上呼吸道感染、蕁麻疹等，還會(huì)增加腎臟的負(fù)擔(dān)[4]。

有研究報(bào)道攝食特定的食物或食物成分與糖尿病發(fā)病率之間存在一定的相關(guān)性[5-6]，膳食可對(duì)II型糖尿病的防治起到重要的作用，機(jī)制之一就是食物組分具備抑制DPP-IV的能力。食物蛋白經(jīng)過(guò)胃腸道消化、體外酶解或特定的食品加工可釋放出肽片段，研究證實(shí)某些肽片段具有抑制DPP-IV的功能。與傳統(tǒng)的藥物相比，由食源蛋白制備的DPP-IV抑制劑的毒性和副作用都很小[7]。膳食組分可能用作功能食品的配料以輔助調(diào)節(jié)血糖，這一發(fā)現(xiàn)在學(xué)術(shù)界備受關(guān)注，食源DPP-IV抑制肽的制備和鑒定成為研究熱點(diǎn)。

本綜述首先探討食源DPP-IV抑制肽的獲得方式、研究流程、分子描述和抑制機(jī)制；然后評(píng)定生物信息學(xué)方法在DPP-IV抑制肽領(lǐng)域的應(yīng)用及其局限性；最后，針對(duì)DPP-IV抑制肽最終要應(yīng)用于人體所需要的進(jìn)一步研究提出展望。

1 DPP-IV抑制肽的獲得方式

酶解、發(fā)酵和特定的食品加工都可以產(chǎn)生DPP-IV抑制肽。盡管有報(bào)道稱完整的蛋白經(jīng)消化道消化后可能有DPP-IV抑制肽生成[8]，但由于食物組分的復(fù)雜性使蛋白在消化過(guò)程中不能按照最優(yōu)方式釋放出DPP-IV抑制肽，且消化得到的DPP-IV抑制肽可能在胃腸道條件下不穩(wěn)定或無(wú)法穿越消化道屏障，導(dǎo)致其生物可利用性低[9]。因此，有必要針對(duì)性地水解食物蛋白制備DPP-IV抑制肽，以便于其更好地在體內(nèi)發(fā)揮作用。酶解是制備DPP-IV抑制肽的最常用方法，目前大多數(shù)DPP-IV抑制肽都是用特定的蛋白酶水解食物蛋白制備而成的[10]。與其他的方法相比，酶解有環(huán)保、高效、可控的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)控制酶解的條件，可以使DPP-IV抑制肽的制備達(dá)到最優(yōu)效果。

此外，微生物發(fā)酵或特定的食品加工也可以獲得DPP-IV抑制肽。發(fā)酵制品納豆具有明顯的DPP-IV抑制活性，納豆中分離到的Lys-Leu有很強(qiáng)的抑制DPP-IV活性的潛能（半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值達(dá)（41.40±2.68）μg/mL）[11]。某些乳桿菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌出抑制DPP-IV活性的物質(zhì)，將分泌性上清液經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理后，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示某些蛋白發(fā)生降解，其DPP-IV抑制能力也顯著增強(qiáng)，說(shuō)明乳桿菌分泌的DPP-IV抑制組分是肽[12]。西班牙干腌火腿在制作過(guò)程中沒(méi)有使用蛋白酶，但在其水溶性提取物中也檢測(cè)到DPP-IV抑制活性，IC50值達(dá)0.69 mg/mL，這可能是內(nèi)源蛋白酶作用的結(jié)果[13]。

2 DPP-IV抑制肽研究的常規(guī)流程

有關(guān)DPP-IV抑制肽的研究一般按照以下流程進(jìn)行[9-10]：1）選擇合適的蛋白底物和酶；2）對(duì)蛋白進(jìn)行酶解；3）體外活性分析；4）富集/分離；5）DPP-IV抑制肽的鑒定；6）用合成的肽驗(yàn)證其DPP-IV抑制效能；7）闡述其抑制機(jī)制；8）細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。

2.1 食物蛋白水解物的制備

多種食物都可以作為制備DPP-IV抑制肽的原料來(lái)源。乳是研究最為廣泛的蛋白質(zhì)來(lái)源，體外研究表明，牛乳酪蛋白、牛乳乳清蛋白、牦牛乳、駱駝乳等經(jīng)酶解后的水解物具有抑制DPP-IV的活性[1,3,9,15-16]。魚(yú)和哺乳動(dòng)物皮膚中的明膠富含脯氨酸（Pro），其水解物有DPP-IV抑制活性[17-19]。此外，豆類(lèi)、藜麥、燕麥、莧菜、麻等植物也是很好的制備DPP-IV抑制肽的蛋白質(zhì)來(lái)源[20-23]。

多種蛋白酶都可用來(lái)從膳食蛋白中制備DPP-IV抑制肽，包括動(dòng)物來(lái)源（如胃蛋白酶、胰蛋白酶）、植物來(lái)源（如木瓜蛋白酶）及微生物來(lái)源的酶（如堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味酶、嗜熱菌蛋白酶）。選擇蛋白酶時(shí)需要考慮到酶的主要活性或文獻(xiàn)中關(guān)于該酶釋放出特定生物活性肽潛能的報(bào)道。通常情況下，使用一種蛋白酶即可有效地釋放出DPP-IV抑制肽，然而單一種類(lèi)蛋白酶的水解程度通常比較低。由于肽的生物活性依賴于肽的大小、氨基酸組成，因此水解度與水解物的功能性密切相關(guān)[24]。使用雙酶解會(huì)一定程度上提高水解度，但要避免過(guò)度水解導(dǎo)致釋放出不具備生物活性的肽[7]。在確定水解底物和蛋白酶后，需要考慮影響酶解的條件（pH值、溫度、時(shí)間、酶的添加量、蛋白底物的含量等），應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 體外評(píng)估生物活性

體外評(píng)估DPP-IV抑制活性的方法主要有兩種，一是熒光法，其原理是DPP-IV從多肽的N端裂解釋放出有熒光性的X-Pro二肽，利用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定加入/不加入樣品體系的吸光度（λex＝360 nm/λem＝460 nm），可以計(jì)算出水解物對(duì)DPP-IV的抑制程度；另一種方法的原理是DPP-IV水解生色底物Gly-Pro-pNA，在405 nm波長(zhǎng)處可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。同樣，通過(guò)比較加入受試樣品之后體系吸光度的變化，計(jì)算出水解物對(duì)DPP-IV的抑制程度。DPP-IV抑制肽抑制活性如表1所示。

表1 有體外DPP-IV抑制活性的食源蛋白水解物的IC50Table 1 Half maximal inhibitory concentration (IC50) of food proteinderived hydrolysates with DPP-IV inhibitory activity

然而某些實(shí)驗(yàn)條件可以影響到體外抑制活性的測(cè)定結(jié)果，如試劑的濃度——包括酶、底物、水解物的濃度等，都會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)影響。此外，試劑的純度、來(lái)源、反應(yīng)體系pH值以及溫度也對(duì)結(jié)果有影響[10]。因此不同實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定的DPP-IV抑制活性之間缺少可比性，此外，表征抑制潛能的IC50值也依賴于測(cè)定條件。據(jù)報(bào)道，當(dāng)反應(yīng)體系中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶從155 U/L增加至221.15 U/L時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照物甲巰丙脯酸的表觀IC50值從9.10 nmol/L升至39.40 nmol/L，用乳清蛋白水解物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)也得到相似的結(jié)果[10]。因此有必要將測(cè)定方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以便于不同研究結(jié)果之間進(jìn)行比較。

2.3 生物活性肽的分離

蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后，反應(yīng)體系中含有大量不同長(zhǎng)度、不同序列的肽及游離氨基酸，對(duì)水解物進(jìn)行分離可以減少體系組成的復(fù)雜性，便于后續(xù)肽的鑒定。依據(jù)不同肽在分子質(zhì)量、疏水性或電荷上的差異，可以對(duì)蛋白水解物進(jìn)行分級(jí)分離，比如超濾、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）等。分級(jí)分離的過(guò)程可對(duì)有效成分進(jìn)行富集，除去活性低的組分，同時(shí)降低復(fù)雜體系中由于肽-肽之間疏水/靜電相互作用對(duì)整體活性的不利影響[10,31]。

2.4 肽的鑒定

測(cè)定分級(jí)分離獲得的各個(gè)組分的DPP-IV抑制活性，選取抑制活性最高的組分進(jìn)行肽的鑒定。一般采用前端分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)合的方法，如HPLC-質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）、HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight，MALDI-TOF）MS、帶有電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）的四極桿-飛行時(shí)間（quadrupole time-of-flight，QTOF）-MS[9,32]。大多數(shù)MS對(duì)含5 個(gè)氨基酸以上的肽可進(jìn)行精確鑒定，但對(duì)含2～4 個(gè)氨基酸的小肽的鑒定卻精度不足[10]。要精確測(cè)定分離鑒定肽的DPP-IV抑制能力，需要按照肽的氨基酸序列進(jìn)行人工合成，并利用體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估其生物學(xué)特性。表2列舉了部分已得到鑒定的肽的DPP-IV抑制潛能。這些DPP-IV抑制肽由2～11 個(gè)氨基酸組成，值得注意的是，氨基酸位點(diǎn)較多的肽在通過(guò)消化道時(shí)有被降解的可能[28]。雖然這些DPP-IV抑制肽的DPP-IV抑制能力明顯高于未經(jīng)富集/純化的水解物，但相比于化學(xué)合成的DPP-IV抑制劑明顯要差許多，如西他列汀的IC50值僅為0.000 036 mg/mL（約為88 nmol/L）[16]。

表2 已鑒定的DPP-IV抑制肽序列的抑制潛能Table 2 Inhibitory potential of identififi ed DPP-IV inhibitory peptides

2.5 體內(nèi)研究

肽在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝、分泌等過(guò)程可能導(dǎo)致其在人體內(nèi)的生物利用性及穩(wěn)定性差，因此生物活性肽的體外分析結(jié)果與體內(nèi)活性之間的相關(guān)性存有爭(zhēng)論[40]。此外，體外分析中使用的酶濃度可能與體內(nèi)不符，這對(duì)評(píng)定肽的生物活性也有影響[39]。因此，在食源肽正式用于人體之前有必要進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證其在人體內(nèi)的作用效果。

很多研究都報(bào)道了DPP-IV抑制肽在體外實(shí)驗(yàn)條件下的抑制效能（IC50），有些研究進(jìn)一步通過(guò)模擬消化來(lái)考察DPP-IV抑制肽通過(guò)消化道的穩(wěn)定性[20-22,38]。相比之下，只有少數(shù)關(guān)乎DPP-IV抑制肽在動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的效果（表3）。典型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)采用糖尿病模型鼠，即在實(shí)驗(yàn)鼠服用受試蛋白水解物以后，進(jìn)行葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)或測(cè)定鼠血漿中的DPP-IV活性。研究結(jié)果表明，在體外具有DPP-IV抑制活性的食源肽有助于調(diào)節(jié)血液葡萄糖水平，在某些條件下這些動(dòng)物中DPP-IV活性更低。然而，有關(guān)DPP-IV抑制肽在人體中的作用鮮有相關(guān)報(bào)道。

3 具有體外DPP-IV抑制活性的食源組分的細(xì)胞及體內(nèi)研究Table 3 Cellular and in vivo studies of food-derived constituents with in vitro DPP-IV inhibitory activity

3 DPP-IV抑制肽的結(jié)構(gòu)特征及抑制機(jī)制

針對(duì)DPP-IV抑制肽進(jìn)行的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的研究表明，特定的氨基酸序列是決定DPP-IV抑制活性大小的首要因素。而肽的不同生化特性，包括鏈長(zhǎng)、等電點(diǎn)、疏水性、凈電荷與其DPP-IV抑制活性相關(guān)性不顯著[46]。IC50小于100 μmol/L的DPP-IV抑制二肽通常在其N(xiāo)端有Trp/Thr/Met，在C端有Ala/Leu/His。盡管N端位點(diǎn)似乎對(duì)二肽抑制DPP-IV能力影響最大，但C端氨基酸對(duì)其潛能也有影響，這可能由于兩個(gè)位點(diǎn)都參與到肽與酶的相互作用[33]。三肽的情況有所不同，在第1、2、3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸通常分別是Ile/Gln/Leu/Ser/Val、Pro和Gln/Ala/Ile/Leu/Gly/Met/Phe。含有4 個(gè)以上氨基酸的肽通常在第1、2、3個(gè)氨基酸位置是Leu/Gly/Ile、Pro/Leu/Lys和Ala/Val/Gly/Pro，在C端是Pro/Leu/Arg[1,33,47-48]。DPP-IV抑制肽通常具有高比例的疏水性氨基酸，這些疏水性氨基酸可能會(huì)加強(qiáng)與DPP-IV活性位點(diǎn)的相互作用[1]。實(shí)際上在DPP-IV的S1亞基有疏水口袋，在肽對(duì)DPP-IV抑制上起到關(guān)鍵作用[1]。

體外動(dòng)力學(xué)分析及分子對(duì)接模型用來(lái)研究肽與DPP-IV之間的相互作用。DPP-IV抑制肽對(duì)DPP-IV的抑制方式包括競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性及混合型，因此，DPP-IV抑制肽可能在酶的活性位點(diǎn)和/或催化中心以外發(fā)揮其性能[49]。大多數(shù)第一個(gè)氨基酸位點(diǎn)是Pro的食源DPP-IV抑制肽是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性方式作用的。已知DPP-IV優(yōu)先作用于倒數(shù)第二個(gè)氨基酸位點(diǎn)是Pro的底物或其他小的不帶電荷的氨基酸，如Ser和Ala。DiprotinA是DPP-IV的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，但實(shí)際上是轉(zhuǎn)換率很低的DPP-IV底物，因而有研究人員推測(cè)，第一個(gè)氨基酸位點(diǎn)是Pro的食源肽，其可能與DPP-IV底物有相似的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。另一方面，大多數(shù)N端含有Trp的肽表現(xiàn)出非競(jìng)爭(zhēng)性或反競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。Trp-Arg-Xaa三肽文庫(kù)的計(jì)算機(jī)模型 表明N端Trp側(cè)鏈與酶疏水性S2口袋內(nèi)部的Phe357位點(diǎn)相互作用。相似地，含有Trp的二肽Trp-Val結(jié)合到酶活性位點(diǎn)附近的次級(jí)位點(diǎn)上。值得注意的是，對(duì)特定序列的肽的抑制模式，不同的研究團(tuán)隊(duì)給出的結(jié)果存在分歧，這可能由于酶動(dòng)力學(xué)分析中實(shí)驗(yàn)條件的不同，如底物和酶的類(lèi)型及數(shù)據(jù)的分析方法不同，如線性與非線性回歸模型[49]。

4 生物信息學(xué)在DPP-IV抑制肽研究中的應(yīng)用

以常規(guī)的方法研發(fā)DPP-IV抑制肽是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程，隨著越來(lái)越多的蛋白質(zhì)及生物活性肽的序列已經(jīng)鑒定，肽組學(xué)及蛋白質(zhì)組的工具不斷完善，以計(jì)算機(jī)為工具的生物信息學(xué)被更為廣泛地用于評(píng)估蛋白質(zhì)中生物活性肽的釋放[7,9,50]。

4.1 酶解情況的預(yù)測(cè)——肽剪切

NCBI、UniProt和BIOPEP[7,9]等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)提供了不同蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可以用來(lái)分析前體蛋白質(zhì)的氨基酸組成。在確定好蛋白底物和水解酶以后，利用ExPASy Cutter[7]和BIOPEP[9]等在線平臺(tái)的肽剪切工具，可以根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列及特異蛋白酶的裂解特異性在理論上預(yù)測(cè)出釋放的肽的組成及出現(xiàn)頻率[51]，并將預(yù)測(cè)的結(jié)果與文獻(xiàn)上報(bào)道的序列或?qū)ｉT(mén)的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。如BIOPEP給出了48 種、總數(shù)達(dá)3 712 個(gè)生物活性肽（2019年1月評(píng)估）。許多肽序列可能沒(méi)有相關(guān)活性的報(bào)道，但可以利用Peptide Ranker賦予其功能并對(duì)肽的生物活性按從0（最不可能）到1（最可能）進(jìn)行評(píng)分[7]。此外，還可以根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)或已鑒定DPP-IV抑制肽的序列，計(jì)算出DPP-IV抑制肽在特定蛋白質(zhì)中的存在頻率，再結(jié)合已知DPP-IV抑制肽的抑制潛能（半最大效應(yīng)濃度和/或IC50）[10]及蛋白質(zhì)的氨基酸位點(diǎn)數(shù)或分子量，就可以從理論上預(yù)測(cè)出蛋白質(zhì)經(jīng)水解后釋放DPP-IV抑制肽的情況[8]。

應(yīng)用肽剪切工具時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)[7,9]：1）肽剪切工具只考慮到酶的主要酶切位點(diǎn)，然而大多數(shù)商品化的酶都是不純的，在主要活性以外還混有其他酶活性；2）肽剪切工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)水解的一個(gè)前提假設(shè)就是酶能夠以相同的幾率斷開(kāi)所有的酶切位點(diǎn)，并最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)完全消化掉，然而實(shí)際上，肽鍵的選擇性會(huì)受到諸多因素的影響；3）在加工、儲(chǔ)存期間仍然可能發(fā)生轉(zhuǎn)錄后修飾，而這在計(jì)算機(jī)消化中不會(huì)做考慮；4）蛋白的預(yù)處理對(duì)產(chǎn)生的水解物組成也有影響；5）對(duì)于氨基酸序列未知的蛋白質(zhì)和/或裂解特異性未知的酶無(wú)法使用計(jì)算機(jī)消化工具。

綜上，肽剪切工具能夠以低廉、有效的方式在理論上進(jìn)行預(yù)測(cè)，但其結(jié)果必須用實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

4.2 計(jì)算機(jī)虛擬篩選——分子對(duì)接

分子對(duì)接通過(guò)研究肽與酶的活性位點(diǎn)之間的特異性相互作用（即氫鍵、靜電和疏水相互作用），預(yù)測(cè)出肽與受體的結(jié)合模式及其親和力[39,52]。該技術(shù)既可以用作對(duì)高效能新型生物活性肽進(jìn)行虛擬篩選的工具，也可以很好地闡述目標(biāo)肽與酶的相互作用[53]。

與DPP-IV活性位點(diǎn)結(jié)合的抑制劑屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與DPP-IV的結(jié)合涉及蛋白質(zhì)的一些疏水性亞位點(diǎn)。S1亞位點(diǎn)有一個(gè)狹長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)，可與小的疏水性組分結(jié)合。S2亞位點(diǎn)比S1大，通過(guò)形成鹽鍵與抑制劑相結(jié)合，可以容納更大的組分[54]。有關(guān)DPP-IV競(jìng)爭(zhēng)性抑制肽的相關(guān)報(bào)道很多，小球藻經(jīng)酶解產(chǎn)生兩種有DPPIV抑制活性的三肽（VPW和IPR），與DPP-IV進(jìn)行對(duì)接的結(jié)果表明VPW和IRP通過(guò)氫鍵、范德華力和疏水相互作用與DPP-IV結(jié)合，且VPW與DPP-IV的S1口袋能夠很好地匹配、相互作用更為牢靠[39]。菜豆經(jīng)發(fā)芽48 h、再用堿性蛋白酶水解1 h產(chǎn)生的一種DPP-IV抑制肽，分子對(duì)接表明其與DPP-IV活性位點(diǎn)的S1、S2和S3口袋相互作用，且結(jié)合的穩(wěn)定性要強(qiáng)于已發(fā)表的豌豆肽與DPP-IV的結(jié)合結(jié)果[21]。此外，也有肽與DPP-IV活性位點(diǎn)以外的位點(diǎn)相結(jié)合的報(bào)道。結(jié)合到DPP-IV活性位點(diǎn)以外的分子通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性、混合型或反競(jìng)爭(zhēng)性的模式發(fā)揮抑制作用[1]。由莧蛋白制備的較大的肽（12 個(gè)以上的氨基酸位點(diǎn)）的分子對(duì)接研究表明，這些肽通過(guò)防止形成DPP-IV二聚體的活性形式起作用[53]。

盡管分子對(duì)接為闡述DPP-IV抑制肽的作用機(jī)制起到重要作用，但其應(yīng)用范圍也有明顯的局限性[9,53]：1）分子對(duì)接只適于競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的分析，因?yàn)榉肿訉?duì)接的假設(shè)之一就是肽結(jié)合到酶或受體的活性位點(diǎn)，因此，在酶活性位點(diǎn)以外的地方與酶結(jié)合的肽就無(wú)法用分子對(duì)接的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)；2）有些肽雖然是酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，但與酶結(jié)合后可以發(fā)生降解，因此不適宜使用分子對(duì)接；3）分子對(duì)接沒(méi)有考慮到肽的不穩(wěn)定性，這對(duì)于廣泛地使用分子對(duì)接作為預(yù)測(cè)工具來(lái)說(shuō)是一個(gè)限制。

4.3 結(jié)構(gòu)-功能分析——定量構(gòu)效關(guān)系

定量構(gòu)效關(guān)系（quantative structual activity relationship，QSAR）建模就是通過(guò)數(shù)學(xué)模型表征分子的生理活性與其理化或結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量關(guān)系，然后將這些定量關(guān)系與分子的相應(yīng)特性做出關(guān)聯(lián)。近來(lái)，QSAR建模也用于DPP-IV抑制肽的研究。一項(xiàng)針對(duì)乳源DPP-IV抑制肽的QSAR分析中，研究者將不同實(shí)驗(yàn)條件下獲得的IC50數(shù)據(jù)及并非是競(jìng)爭(zhēng)性的DPP-IV抑制劑納入到QSAR模型中，然后利用該模型對(duì)人體在攝食乳及乳制品后消化道內(nèi)存在的肽的DPP-IV抑制潛質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)[35]。結(jié)果表明DPP-IV抑制肽N端氨基酸的疏水性與肽DPP-IV抑制潛能呈正相關(guān)，這與早期的結(jié)構(gòu)研究結(jié)果一致。盡管這種QSAR模型無(wú)法精確預(yù)測(cè)出DPP-IV抑制肽的IC50，然而用QSAR模型計(jì)算出的指數(shù)通常能夠根據(jù)DPP-IV抑制潛能對(duì)其分級(jí)。這項(xiàng)QSAR研究的目的不是要設(shè)計(jì)出DPP-IV抑制活性更強(qiáng)的肽，而是證實(shí)了QSAR可以作為一種工具預(yù)判出人體在攝食某種食物后消化道內(nèi)存在肽的DPP-IV抑制潛能。驗(yàn)證性研究鑒定出與人體攝食乳制品后消化道內(nèi)存在的、體外DPP-IV抑制潛能較高的DPP-IV抑制肽，如Leu-Pro-Val-Pro-Gln其DPP-IV的IC50值達(dá)到（43.8±8.8）μmol/L[50]。將來(lái)把更多數(shù)量、更大多樣性（長(zhǎng)度及氨基酸組成）的肽的數(shù)據(jù)納入到模型中，將有助于改進(jìn)QSAR模型對(duì)DPP-IV抑制肽的預(yù)測(cè)能力[1,50]。

利用Q S A R預(yù)測(cè)肽的生物活性也存在一些局限性[9]：1）納入到QSAR模型中的數(shù)據(jù)可能不是在相同實(shí)驗(yàn)條件下獲得的，如前所述，實(shí)驗(yàn)條件對(duì)獲得的潛能值有非常大的影響；2）建立QSAR模型時(shí)應(yīng)考慮到肽的作用模式，因?yàn)橹挥性谙嗤饔脵C(jī)制的肽之間才能建立起生物學(xué)活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系；3）在預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值之間常有較大差異。

5 結(jié) 語(yǔ)

抑制DPP-IV的活性是防治II型糖尿病的有效途徑之一，近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)某些食源蛋白制備的肽具有DPP-IV抑制活性，因此開(kāi)發(fā)有調(diào)控血糖之功效的食源肽制品備受關(guān)注。迄今為止，在DPP-IV肽的制備、鑒定、抑制模式及功效關(guān)系等方面已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)姆e累。然而，從科研以及最終要應(yīng)用于人體的角度來(lái)說(shuō)，還有許多問(wèn)題有待解決。1）目前對(duì)于DPP-IV抑制肽只有定性的鑒定，而沒(méi)有定量的報(bào)道。要保證這些食源肽在體內(nèi)發(fā)揮功效，首先需要保證其達(dá)到一定的濃度，因此，有必要進(jìn)行DPP-IV抑制肽的定量研究。2）有關(guān)DPP-IV抑制肽的研究多停留在體外研究的水平，部分做了模擬消化道消化的實(shí)驗(yàn)，只有少數(shù)涉及到細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，尚無(wú)相關(guān)的人體實(shí)驗(yàn)的報(bào)道。下一步的研究方向就是要獲得DPP-IV抑制肽在人體內(nèi)的生物利用度及生物可給性的信息。3）已報(bào)道的DPP-IV抑制肽的抑制潛能都要明顯低于藥品，因此就目前來(lái)看，不適宜將DPP-IV抑制肽作為藥品的替代品用于糖尿病的治療。然而對(duì)于糖尿病高危人群，DPP-IV抑制肽有防控的潛力。此外，已有報(bào)道稱DPP-IV抑制肽對(duì)抗糖尿病的藥物有輔助治療的作用，有必要在DPP-IV抑制肽與藥物的相互作用方面開(kāi)展更加深入的研究。4）現(xiàn)有研究側(cè)重于制備高潛能的DPP-IV抑制肽，而對(duì)其感官性能往往關(guān)注不夠。DPP-IV抑制肽若要應(yīng)用于食品，產(chǎn)品的感官性狀就必須加以考慮。研究表明，疏水性氨基酸對(duì)DPP-IV抑制肽的抑制活性有重要影響，而疏水性氨基酸的暴露常常會(huì)導(dǎo)致苦味的產(chǎn)生。針對(duì)性地制備出高活性與低苦味并存的DPP-IV抑制肽也是今后的發(fā)展方向。