辛弗林分子印跡聚合物的制備及其在固相萃取中的應用

李 玲，蘇學素*，張耀海，焦必寧，劉金濤，董家吏

（1.西南大學化學化工學院，重慶 400715；2.中國農業科學院柑桔研究所（西南大學柑桔研究所），農業農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室，重慶 400712）

辛弗林是一種生物堿，是麻黃屬植物的主要活性成分，我國每年至少有5.5萬 t的辛弗林急待開發和利用[1]。Pellati等[2]研究發現辛弗林可提高新陳代謝、氧化脂肪，是一些減肥藥物的有效成分，在治療因肥胖引起的輕度和中度抑郁癥中顯示了良好的療效。胡源祥等[3]研究表明枳實中的辛弗林對腸胃運動具有調節作用，肯定了辛弗林為枳實作用于胃腸運動的有效成分之一。除此以外，辛弗林具有擴張氣管和支氣管、收縮血管、升高血壓的作用，臨床用于治療支氣管哮喘以及手術和麻醉過程中出現的低血壓、虛脫、休克、體位性低血壓等癥狀[4-6]。隨著研究的深入和美國、加拿大、澳大利亞和新西蘭等國家相繼禁止銷售含有麻黃和麻黃堿的膳食補充劑后[7]，辛弗林由于結構與麻黃堿相似，在食品、藥品、飲料等保健行業顯示出了極大的應用潛力[8-9]。巨大的應用潛力和良好的生理活性導致辛弗林的需求量不斷增加，它的開發和利用受到了極大的關注，提取和純化更是近些年研究的熱點之一。目前辛弗林的分離純化方法主要有超臨界提取法[10]、微波提取法[11]、真空氣流提取法[12]、大孔樹脂吸附法[13]、反膠束提取法[14]、溶劑提取法[15-16]、煎煮法[17]等，但這些技術普遍存在提取率低、純度低、有機溶劑消耗量大、工藝繁瑣等缺點，而且對辛弗林的提取和純化不具有特異性，因此，開發經濟、高效、簡潔的提純化辛弗林的方法尤為重要。

分子印跡固相萃取（solid phase extraction，SPE）技術是一種有望在生物工程、臨床醫學、環境監測、食品工業等行業形成產業化應用的新型SPE技術[18-19]。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIPs）一般具有特定的結合位點，這些位點可以選擇性地識別模板分子或與模板分子結構相似的化合物，具有高選擇性、化學和物理穩定性、可重復使用性和低成本制備性等優點[20-22]。由于其突出的優勢，MIPs在食品分析、藥物分析、藥物輸送、SPE等領域顯示出良好的應用前景。Ghasemi等[23]利用分子印跡技術制造具有特定納米空腔的聚砜膜，從純凈溶液和紫杉樹提取物中選擇性分離和富集紫杉醇；Zhang Jiawei等[24]利用合成的MIPs為特定的吸附劑，首次從檸檬汁中去除檸檬苦素，然后將含有檸檬苦素的MIPs直接制成水溶性凝膠治療小鼠的炎癥；Xie Jing等[25]制備了毛蕊花素MIPs，通過SPE程序使用毛蕊花素分子印跡材料用于扣除雌激素受體中的類黃酮糖苷配基。目前合成分子印跡的方法主要有沉淀聚合法、本體聚合法、懸浮聚合法、原位聚合法、表面印跡法、溶脹聚合法等。本體聚合法由于在制備過程中聚合物內部的印跡孔穴經過研磨可能被破壞，在一定程度上會降低MIPs的選擇性和吸附性，原位聚合法聚合程度難以控制，溶脹聚合法制備工藝繁瑣、耗時長，懸浮聚合法受溶劑影響大，表面印跡法過程復雜且需要載體材料[26-27]。由于沉淀聚合法制備過程簡單、成本低、產率和印跡效果好，因此本實驗采用沉淀聚合法制備辛弗林MIPs，測定MIPs的吸附性和選擇性，并利用MIPs對枳實粗粉中的辛弗林進行SPE研究，以期為辛弗林的提取和純化提供一種高效、經濟的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辛弗林標準品、甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、偶氮二異丁腈（azobisisobutyronitrile，AIBN） 上海泰坦科技股份有限公司；丙烯酸羥乙酯（2-hydroxyethyl acrylate，HEA） 上海源葉生物科技有限公司；丙烯酰胺 重慶姣姣商貿有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸羥乙酯（ethyleneglycol dimethacrylate，EGDMA） 上海騰懷生物科技有限公司；甲醇重慶躍翔化工有限公司；乙酸 上海麥瑞爾化學科技有限公司；乙腈 上海阿拉丁生化科技有限公司；乙酸乙酯（ethyl acetate，EA） 西格瑪奧德里奇貿易有限公司；實驗試劑均為色譜純，水均為超純水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 安捷倫科技有限公司；SZCL-3A數顯智能控溫磁力攪拌器 鄭州科泰實驗設備有限公司；SB-5200D超聲波清洗器 寧波新芝生物科技有限公司；TM-1810紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；旋渦機 重慶瑞麗電子儀器設備有限公司；純水機 法國MilliQ公司；CZX-GFC.101-2-BS電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博泰實驗設備有限公司；梅特勒AB304-S/FACT電子天平 上海志榮電子科技有限公司；IECCL31R臺式冷凍離心機 德國Thermo Fisher公司；SPE柱 美國Agilent科技有限公司；Sμpelco真空SPE裝置 上海楚定分析儀器有限公司；SM8010型掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 MIPs的制備和表征

1.3.1.1 沉淀聚合法制備MIPs

以MIPs2為例，使用沉淀聚合法制備MIPs2時，在加入0.22 mmol MAA和0.18 mmol HEA作為雙功能單體的條件下，準確稱取0.1 mmol模板分子（辛弗林）溶于10.0 mL致孔劑（乙腈）中，加入20 mmol交聯劑EGDMA，超聲30 min靜置過夜，再加入0.2 mmol引發劑AIBN，超聲處理30 min通氮氣除氧20 min后置于60 ℃恒溫水浴中反應24 h得聚合物。用甲醇-乙酸8∶2（V/V）混合溶液索氏提取除去聚合物中的模板分子及未反應的單體，再用甲醇溶液洗脫除去剩余的乙酸分子，將反應所得固體顆粒用丙酮反復沉降除去細小粒子，過濾，干燥得辛弗林MIPs。非印跡聚合物（non-imprinted polymer，NIPs）的合成方法與MIPs合成方法一致，只是在合成時不加入模板分子。

1.3.1.2 MIPs形態表征

利用SEM對合成的MIPs2進行形貌表征。首先將待測的樣品均勻涂覆到導電膠上，然后采用離子濺射儀對MIPs進行噴金30 s后，室溫下進行SEM測試。

1.3.2 吸附實驗

1.3.2.1 靜態吸附

準確稱取10 mg MIPs和NIPs于10 mL離心管中，加入100 mg/L的辛弗林標準液，搖床恒溫振蕩2 h，10 000 r/min高速離心5 min，取出上清液，氮氣吹干后用甲醇復溶至1 mL，過0.22 μm濾膜，用HPLC測定其濃度并計算吸附量和印跡因子（IF），公式如下：

式中：Q為MIPs對辛弗林的吸附量/（μmol/g）；Qc為溶液中辛弗林的初始質量濃度/（mg/L）；Qe為吸附平衡時辛弗林的質量濃度/（mg/L）；V為辛弗林溶液的體積/mL；m為加入的MIPs的質量/mg；QMIP為MIPs對辛弗林的吸附量/（μmol/g）；QNIP為NIPs對辛弗林的吸附量/（μmol/g）。

1.3.2.2 吸附等溫線和Scatchard模型考察

準確稱取10 mg MIPs2，加入不同濃度的辛弗林標準液，搖床恒溫振蕩2 h，10 000 r/min高速離心10 min，取出上清液，氮氣吹干后用甲醇復溶至1 mL，過0.22 μm濾膜，用HPLC測定并計算其濃度。應用Scatchard模型以Q/Ce對Q作圖，根據線性關系的斜率和截距可求得吸附平衡常數Kd和最大表觀結合量Qmax。如式（3）所示：

式中：Ce為吸附平衡時的濃度。

1.3.2.3 吸附動力學

準確稱取10 mg MIPs2，分別加入100 mg/L的辛弗林標準液，搖床恒溫振蕩吸附10、20、30 min后10 000 r/min高速離心10 min，取出上清液，氮氣吹干后用甲醇復溶至1 mL，過0.22 μm濾膜，用HPLC測定其濃度。采用準一級動力學方程和準二級動力學方程研究MIPs2對辛弗林的吸附速率和吸附機理。

準一級動力學方程式：

式中：Qe為平衡時吸附量/（μmol/g）；Qt為測量時間為t時的吸附量/（μmol/g）；t為時間/min；k1為一級動力學常數；k2為二級動力學常數。

1.3.2.4 選擇性吸附

稱取3 份10 mg的MIPs2放入10 mL離心管中，分別加入100 mg/L的辛弗林、酪胺、大麥芽堿標準溶液，于室溫下恒溫振蕩2 h，10 000 r/min高速離心10 min，取出上清液，氮氣吹干后用甲醇復溶到1 mL，溶液過0.22 μm濾膜，用HPLC測定其濃度。3 種被測物結構如圖1所示。

圖 1 辛弗林、酪胺、大麥芽堿結構Fig. 1 Structures of synephrine, tyramine and maltine

1.3.3 分子印跡SPE

用MIPs2作填充材料制備分子印跡SPE柱。準確稱取一定質量MIPs2溶于2 mL丙酮，裝入SPE柱（Agilent，3 mL）中，用篩板壓嚴實。依次用甲醇、乙腈、水各2 mL對SPE柱進行活化，然后加入一定體積的枳實粗粉提取液吸附一定時間后，進行淋洗和洗脫，分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液，濃縮至干，再用甲醇復溶，進行HPLC分析。

1.4 數據統計及圖表繪制

實驗采用Excel對測量結果進行統計計算，用Origin進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 MIPs制備條件的優化

2.1.1 模板分子和功能單體的相互作用

功能單體能否與模板分子相互作用形成穩定的聚合物是MIPs能否具有高選擇性和高吸附性的關鍵點。本研究利用紫外分光光度計測定辛弗林與不同的功能單體MAA、HEA、丙烯酰胺（acrylamide，AM）、MAAHEA的混合溶液預聚合后紫外最大吸收峰的變化情況。如圖2所示，當功能單體為MAA-HEA時，預聚合物的紫外最大吸收峰發生了較明顯的紅移，可能原因是辛弗林雖然同時具有弱酸性和弱堿性，但其堿性大于酸性所以更易于與具有弱酸性的MAA結合，而加入HEA具有穩定分子間作用力的用途[28]，所以預聚合物發生了相對明顯的紅移。故本研究選擇MAA-HEA作為雙功能單體。

圖 2 辛弗林與不同功能單體預聚合后紫外波長變化Fig. 2 Change in maximum ultraviolet absorption wavelength after prepolymerization of synephrine with different functional monomers

圖 3 辛弗林與不同比例MAA-HEA預聚合后紫外波長變化Fig. 3 Change in maximum ultraviolet absorption wavelength in synephrine after prepolymerization with different ratios of MAA to HEA

圖 4 不同濃度功能單體與模板分子作用紫外吸收值差異Fig. 4 Comparison of UV absorption values of complexes between functional monomers at different concentrations and template molecules

模板分子與功能單體的比例同樣影響MIPs的選擇性和吸附性，同理利用紫外分光光度計檢測辛弗林與MAAHEA在不同的物質的量之比（1∶0、1∶2、1∶4、1∶6）預聚合后最大吸收峰的變化，從圖3可以看出，當辛弗林與功能單體的比例為1∶4時，紫外最大吸收發生了較顯著的紅移，所以模板分子與MAA-HEA的最佳比例為1∶4。為了進一步探究辛弗林與功能單體的結合機理，參照文獻[29]固定辛弗林的濃度為0.1 mmol/L，從0.05～1 mmol逐漸增加功能單體的濃度，在紫外分光光度計上測得混合溶液的吸光度，從而繪制出紫外吸光度差光譜圖4，在理論上，模板分子（T）與功能單體（M）形成復合物的過程，可以用下式表示：

式中：k為結合常數，n＝1、2、3……。

由于功能單體的濃度（b0）遠大于模板分子的濃度（a0），因此復合物的濃度（c）可推導為：

由于功能單體與模板分子以及其主客體復合物最大吸收在234 nm波長處，所以功能單體與模板分子在甲醇溶液中作用前后吸光度差ΔA可表示為：

式中：A0為開始時的吸光度；A為平衡時的吸光度；?ξ為波長差/nm；b0為功能單體質量濃度/（mg/L）；K為結合速率常數；ΔξC為復合物波長變化/nm；a0為模板分子質量濃度/（mg/L）；l為平衡時波長/nm。

以ΔA/b0n對ΔA作圖可以推導出n值，從而得知在甲醇溶液中一個模板分子的周圍有幾個功能單體與其作用，從而揭示分子印跡作用機理。

從圖5可以看出，當n＝2時，ΔA/b0n對ΔA作圖是一條直線（R2＝0.913 1），說明在研究的濃度范圍內主客體主要存在形式為1 個辛弗林分子與2 個MAA-HEA發生作用。但是單獨通過氫鍵識別是不穩定的，因為空間效應也可能對識別有很大作用。

圖 5 ΔA/b0 n與ΔA在234 nm波長處的關系Fig. 5 Plots of ΔA/b0 n versus ΔA at 234 nm

功能單體和模板分子間的結合強度、聚合物形態結構以及動力學性質取決于溶劑的種類及用量，本研究測定了不同種類溶劑和同一溶劑不同體積對聚合物吸附量的影響。引發劑也是影響聚合物吸附量的一個重要因素，參照文獻[30]關于辛弗林MIPs的研究，引發劑的量應為功能單體和交聯劑質量的1%，但是在本研究中按照此比例卻不能得到MIPs，所以本研究探討引發劑用量對辛弗林MIPs吸附量的影響，結果見表1。制備辛弗林MIPs的最優條件為當辛弗林為0.1 mmol，功能單體MAA（0.22 mmol）-HEA（0.18 mmol），致孔劑為乙腈且體積為10 mL、引發劑為AIBN且用量為32.0 mg、EDGMA為交聯劑且用量為20 mmol時，聚合物的吸附效果最好。

表 1 MIPs的制備條件及吸附性能Table 1 Preparation conditions of MIPs and corresponding adsorption capacity

2.1.3 SEM分析

取少量MIPs2和NIPs2通過SEM對聚合物的形貌進行表征，如圖6所示。MIPs2結構疏松，具有網狀結構的孔道，模板分子可通過這些孔道進入“預定”的孔穴，并與之發生相互識別。網狀結構使聚合物在SPE過程中具有較大比表面積與較低流動阻力，這些優點有助于增強其在樣品中特異性吸附性能。而NIPs2結構致密，尺寸結構均一、空穴較少，導致相應的吸附能力降低。

圖 6 MIPs2 （a）和NIPs2（b）SEM圖Fig. 6 Scanning electron microscopic images of MIPs2 (a) and NIPs2 (b)

2.2 聚合物靜態吸附

2.2.1 MIPs和NIPs的識別屬性

25 ℃條件下MIPs2和NIPs2的吸附等溫線結果如圖7a所示（多次測量統計結果），隨著溶液中辛弗林質量濃度的增大，MIPs2和NIPs2對辛弗林的吸附量均逐漸升高，但MIPs2吸附量的增加幅度顯著大于NIPs2，表明MIPs的吸附性能顯著強于NIPs。結合圖7b Scatchard模型討論MIPs的吸附特性，對于MIPs2，以Q/Ce對Q作圖呈現兩條不同斜率的直線，說明MIPs對辛弗林的吸附存在2 種不同的結合位點（高親和力結合位點和低親和力結合位點）。其中，高親和力結合位點的存在反映出MIPs2對辛弗林的特異性吸附，NIPs2對辛弗林的結合能力遠低于MIPs2，這意味著NIPs2不具有與辛弗林匹配的特異性結合位點，并且僅具有差的非特異性吸附。通過分子印跡實現MIPs2的特異性吸附是顯而易見的。

圖 7 辛弗林吸附在MIPs和NIPs上的吸附等溫線（a）和Scatchard圖（b）Fig. 7 Corresponding adsorption isotherms (a) of synephrine adsorption onto MIPs and NIPs and Scatchard plots (b)

2.2.2 吸附動力學

圖 8 MIPs2和NIPs2對辛弗林的吸附動力學分析Fig. 8 Adsorption kinetics of synephrine by MIPs2 and NIPs2

為確定吸附平衡時間，對MIPs2和NIPs2做吸附動力學實驗。由圖8（3 次測量后統計結果）可以看出，MIPs2對辛弗林的吸附量在60 min內快速增加，在60 min左右達到平衡后吸附量基本不變。因此，MIPs2的吸附平衡時間確定為60 min。并且MIPs2吸附量高于NIPs2，這是因為MIPs2的孔穴被辛弗林成功印跡，隨著時間的推移，MIPs2的孔穴逐漸被填滿導致吸附速度變緩最終達到動態平衡。而NIPs2由于沒有特定的印跡孔穴，只能依靠聚合物表面的非特異性吸附作用進行少量的吸附，所以吸附量有限。為進一步探究吸附過程的動力學機理，對其進行了一級動力學模型和二級動力學模型擬合。

表 2 動力學方程擬合參數Table 2 Kinetic parameters of pseudo first-order and pseudo secondorder equations for synephrine adsorption by MIPs2 and NIPs2

對表2準一級動力學方程和準二級動力學方程的擬合結果進行分析可知，準一級動力學方程的擬合結果相關系數R2均較準二級動力學方程的R2要好，且由準一級動力學計算的平衡吸附量QeMIPs2和NIPs2（分別為205.43 μmol/g和50.81 μmol/g）接近于實驗值（分別為228.82 μmol/g和54.91 μmol/g），說明MIPs2和NIPs2對辛弗林的吸附過程更符合準一級動力學方程。

為了保證對花溪區紅巖水庫數據錄入的準確性和效率性，需要采用本地數據和遠程數據結合錄入方式對應基礎工程數據的錄入。如果在對相關工程數據進行錄入發現格式錯誤，可調用WEbService軟件出發數據庫存儲過程，對于相關數據直接對應數據庫列表進行文件域名修改。

2.2.3 選擇性吸附

圖 9 樣品標準溶液和MIPs2吸附后HPLC圖Fig. 9 HPLC chromatograms of synephrine standard solution and synephrine-rich extract from Fructus Aurantii immaturus after MIPs2 adsorption

選取與辛弗林結構類似的酪胺和大麥芽堿作為底物進行吸附選擇性研究，結果見圖9。對比吸附前后溶液的HPLC可知，MIPs2對3 種物質都具有吸附性能，但對辛弗林的吸附性能明顯優于其他2 種。這是由于MIPs2中具有與辛弗林結構相匹配的印跡孔穴，對辛弗林有特異識別性，由于酪胺和大麥芽堿與辛弗林結構相似，分子中具有一部分相同的基團，所以也能被少量的吸附。

2.3 分子印跡SPE條件優化

以MIPs2作為SPE吸附填充物，洗脫液中辛弗林含量和提取率為比較標準，用HPLC法分別檢測并計算上樣液、淋洗液、洗脫液中辛弗林含量，優化聚合物與枳實提取液的最佳比例、優化淋洗液種類及比例、洗脫液比例。當聚合物質量為200 mg，柱壓適中時，淋洗和洗脫操作方便快速，所以MIPs質量為200 mg為基礎進行研究，淋洗劑是SPE中至關重要的因素，它應盡可能地消除MIPs對模板分子非特異性相互作用而最大限度地保留住特異性相互作用，所以本研究在優化了上樣量、洗脫液比例后，特別比較了不同極性溶劑（乙腈-水、乙腈-EA不同比例混合溶劑）對辛弗林SPE的影響，平行測定3 次，測量結果取平均值，見表3。當MIPs質量為200 mg，枳實提取液為0.20 mL，淋洗液為EA-乙腈（6∶4，V/V），洗脫液為甲醇-乙酸（8∶2，V/V）時，SPE效果最佳，洗脫液中辛弗林質量分數達最大值為93.34%，提取率為73.90%。

表 3 固相提取條件優化Table 3 Optimization of solid phase extraction conditions

3 結 論

采用沉淀聚合法制備一系列辛弗林MIPs，當辛弗林添加量為0.1 mmol、交聯劑選擇 EDGMA（2 mmol）、單體選擇MAA（0.22 mmol）和HEA（0.18 mmol）、致孔劑為10 mL乙腈，交聯劑為0.2 mmol AIBN時，MIPs2對辛弗林有特異吸附性能且吸附量大，最大吸附量為228.82 μmol/g，此吸附量優于報道的辛弗林MIPs吸附量73.91 μmol/g[30]和155.54 μmol/g[31]。將MIPs用于SPE填充物對枳實中的辛弗林進行提取和純化，當聚合物質量為200 mg，枳實提取液體積為0.2 mL，淋洗液為EA-乙腈6∶4（V/V），洗脫液為甲醇-乙酸8∶2（V/V）時，辛弗林的質量分數由1.93%提高到93.34%，提取率為73.90%。該方法具有快速、經濟、高效的特點，可應用于枳實粗粉中辛弗林的提取和純化。