低酰基和高酰基結冷膠對模型飲料中百香果皮花色苷熱穩定性的影響

程宏楨，蔡志鵬，王 靜，徐明生，沈勇根*，盧劍青，劉馥源，李曉明

（江西農業大學食品科學與工程學院，江西省發展與改革委員會農產品加工與安全控制工程實驗室，江西 南昌 330045）

百香果，學名西番蓮（Passiflora coeruleaL.），是西番蓮科西番蓮屬的一種多年生蔓生草質藤本植物，主要分布于熱帶和亞熱帶地區，我國廣西、海南和廣東等地廣泛種植[1]。百香果最常見的是將其加工為果汁，其果汁色澤金黃、香氣馥郁、甜酸可口，深受消費者喜愛。然而百香果皮（passion fruit peel，PFP）通常被丟棄，導致果皮利用率極低，造成資源的浪費和環境的污染。PFP中除含有果膠、纖維素、多糖、礦物質外，還富含活性成分花色苷。研究表明，PFP花色苷具有抗氧化[2]、抗炎[3]、降血壓[4]、抗焦慮[5]、降血糖[6]等功效。因此，對PFP花色苷進行系統研究和資源開發具有廣泛的應用前景和實用意義。

花色苷是一種廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬于黃酮類化合物[7]。花色苷在貯藏、加工和使用過程中，受到熱、氧、光和生物等外界因素影響，使其內部分子結構發生變化，產生降解[8]。抗壞血酸是微量營養素，因其可以延長保質期、提高營養和調節風味，通常用于商業飲料中，但花色苷作為食品成分使用時，雖然果汁中的內源性抗壞血酸不會對花色苷降解產生顯著影響，但由于飲料基質中抗壞血酸濃度的增加，強化抗壞血酸會損害花色苷結構導致褪色[9-10]，這限制了花色苷在飲料體系中的應用。

結冷膠是生物體鞘氨醇單細胞菌在有氧發酵條件下分泌的羧基化細胞外多糖[11]，具有成膠用量少、凝膠形成能力好、透明度高、復配性好等優越性[12]，還能賦予食品極佳的香氣、質地和口感。目前市售2 種結冷膠，從發酵液中直接回收多糖產生高酰基（high acyl，HA）結冷膠，而通過堿處理進行的脫酰作用產生低酰基（low acyl，LA）結冷膠，但LA結冷膠和HA結冷膠由于酰化程度不同，可能與花色苷之間的空間相互作用也不同，導致穩定性有差異。前人研究證明多糖與花色苷的復配可以提高花色苷穩定性[13-14]。Xiong Shaoyuan等[15]研究表明用葡聚糖凝膠包封花色苷與用大豆油相比，回收率從25%提高至33%。Buchweitz等[16]研究表明在pH 5.0條件下加入果膠和果膠多糖可顯著提高黑加侖汁中花色苷穩定性。Guan Yongguang等[17]研究表明阿拉伯膠提高了花色苷在80?℃和126 ℃條件下降解的半衰期和在pH 5.0條件下的熱穩定性。由此，多糖與花色苷的復配成為一種彌補花色苷降解的綠色、安全的有效途徑。結冷膠可通過氫鍵、疏水作用力和離子作用力等介導與花色苷相互作用產生非共價化合物，從而提高花色苷穩定性[18]，解決抗壞血酸強化且富含花色苷的飲料中變色問題，這對于結冷膠在食品中的應用具有重要的指導意義。

目前，結冷膠作為新型微生物多糖，其優越的凝膠性能遠高于其他親水膠體，但結冷膠作為一種食品添加劑在飲料體系中鮮有應用，且國內外對PFP花色苷的研究主要集中在色素提取和貯藏中的氧化褐變，鮮見有關LA/HA結冷膠與PFP花色苷的復配體系以改善花色苷降解的研究報道。為此，本實驗以PFP花色苷為原料，研究LA和HA結冷膠對含有抗壞血酸的模型飲料中PFP花色苷熱穩定性的影響。分析不同濃度的LA結冷膠和HA結冷膠對花色苷穩定性的影響，探究LA結冷膠和HA結冷膠在含抗壞血酸的模型飲料中花色苷的熱降解動力學和色差的變化情況，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜儀分析鑒定PFP花色苷組分，以期為PFP花色苷的穩定化控制及結冷膠的推廣應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

百香果為紫果，采自廣西崇左某農戶果園，于-80 ℃冰箱超低溫保藏。

果膠酶 河南萬邦實業有限公司；HP-20大孔吸附樹脂 北京索萊寶科技有限公司甲酸、乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國天地有限公司；LA和HA結冷膠（純度99%） 蘇州威晟生物科技有限公司；乙醇、冰乙酸、乙酸鈉、鹽酸、氯化鉀、磷酸氫二鈉、檸檬酸、抗壞血酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機、SB-3200DTDN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Q500B高速多功能粉碎機 上海冰都電器有限公司；LXJ-IIB離心機 上海安壽科學儀器廠；ColorQuest XE色差儀美國HunterLab公司；WFJ 2100可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；MALDI SYNAPT MS超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜聯用儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 PFP花色苷的提取純化

1.3.1.1 PFP花色苷的提取

選擇發育成熟、表皮紫紅的百香果用蒸餾水洗凈，取皮切塊，冷凍干燥，打粉后過60 目篩，4 ℃干燥避光保存，備用。稱取適量PFP粉，采用超聲酶法提取花色苷，按料液比1∶10（g/mL）加入含85%乙醇和0.05% HCl的提取液中，先進行酶法提取，果膠酶添加量5 mg/g、酶解pH 3.0、酶解溫度25 ℃、酶解時間60 min，然后在功率108 W條件下超聲提取20 min，4 000 r/min離心10 min，經過分離得到含有PFP花色苷的上清液，備用。

1.3.1.2 PFP花色苷的純化

選用經預處理后的HP-20大孔樹脂對花色苷粗提液進行濕法上柱，柱高15 cm，調節吸附流速為3.5 BV/h，待吸附飽和后用蒸餾水以2 BV/h的流速沖柱洗滌，隨后用含85%乙醇和0.05% HCl的混合溶液解吸，沖柱流速為3 BV/h，待樹脂層接近無色，對洗脫液進行真空濃縮，得到純化的花色苷濃縮液，經冷凍干燥，得到深紫色的PFP花色苷粉末。

1.3.2 樣品溶液的制備

PFP：精確稱取0.09 g PFP花色苷粉末于50 mL棕色試劑瓶，加入30 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 3）中溶解充分，配制成含有0.3%的PFP花色苷溶液。

PFP＋VC：精確稱取0.09 g PFP花色苷粉末和0.24 g抗壞血酸粉末于50 mL棕色試劑瓶，加入30 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 3）中溶解充分，配制成含有0.3%花色苷和0.6% VC的混合體系。

PFP＋VC＋LA/HA：精確稱取0.09 g LA/HA結冷膠于50 mL棕色試劑瓶，加入15 mL超純水溶解，80 ℃水浴30 min，攪拌直至完全水合，冷卻至室溫后，用檸檬酸調節pH值為3。精確稱取0.12 g PFP花色苷和0.24 g抗壞血酸粉末于50 mL燒杯中，加入20 mL 0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 3）中溶解完全，隨后迅速取15 mL該溶液轉移至上述棕色試劑瓶，混合均勻，配制成含有0.3%花色苷、0.6% VC和0.3% LA/HA的混合體系。

1.3.3 樣品溶液的熱處理

將配制好的PFP、PFP＋VC、PFP＋VC＋LA和PFP＋VC＋HA 4 種不同的混合體系于85 ℃水浴加熱0、1、2、3、4、5 h，隨后冷卻至室溫，測定吸光度。

1.3.4 抗壞血酸質量分數對PFP花色苷穩定性的影響

精確稱取適量抗壞血酸，分別用0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH 3）配制成質量分數分別為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的抗壞血酸溶液，在PFP質量分數0.3%、水浴溫度85℃、加熱時間5 h條件下，探究不同質量分數的抗壞血酸溶液對PFP花色苷穩定性的影響。

1.3.5 LA/HA質量分數對PFP花色苷穩定性的影響

精確稱取適量LA和HA結冷膠，分別用超純水配制成質量分數為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的溶液，用檸檬酸調節pH值為3.0，在花色苷質量分數0.3%、抗壞血酸質量分數0.6%、水浴溫度85 ℃、加熱時間5 h條件下，研究不同質量分數LA和HA結冷膠對PFP花色苷的影響。

1.3.6 總花色苷質量濃度的測定

參照李恩惠等[19]的方法稍作修改，采用pH示差法測定花色苷質量濃度。吸取0.025 mol/L（pH 1.0）的KCl-HCl緩沖液和0.4 mol/L（pH 4.5）的乙酸鈉-乙酸緩沖液各4.5 mL于試管中，分別加入待測樣品0.5 mL，室溫避光放置30 min，分別測定波長520 nm和700 nm處吸光度。按式（1）、（2）計算花色苷質量濃度：

式中：mw為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質量（449.38 g/mol）；DF為稀釋倍數（10）；ε為消光系數（26 900 L/（mol·cm））；L為光程（1 cm）。

1.3.7 色差的測定

采用全自動色差儀在總透射模式下對花色苷溶液的L*（亮/暗）、a*（紅/綠）和b*（黃/藍）進行測定。按式（3）計算：

式中：L*、a*、b*為加熱后值；L0、a0、b0為加熱前值。

1.3.8 降解動力學分析

根據處理前和處理后PFP花色苷質量濃度，按式（4）計算保留率：

式中：Ct為處理第t分鐘花色苷質量濃度/（mg/L）；C0為處理第0分鐘花色苷質量濃度/（mg/L）。

研究表明，運用指數速率模型可以較大范疇地模擬有機物的降解過程[20]。有機物的降解速率與有機物質量質量濃度的關系表達，見式（5）：

式中：ω為有機物的質量濃度/（mg/L）；k為降解速率常數/min－1；t為反應時間/min；n為反應級數。

假設降解動力學反應符合零級、一級、二級和三級動力學模型，即當n為0、1、2、3時，式（5）的積分形式，見式（6）～（9）：

式中：k0、k1、k2和k3分別為零級、一級、二級和三級反應降解速率常數/min－1。

當，即PFP花色苷質量濃度下降一半時，所需要的衰變時間為半衰期t1/2。對于一級反應，對應的半衰期為：

1.3.9 PFP花色苷的結構鑒定

1.3.9.1 高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；用1%甲酸溶液（A相）和100%乙腈（B相）進行洗脫；洗脫條件：0～10 min，100% A；10～15 min，60% A；16～25 min，100% A。柱溫45 ℃，進樣量2 μL，流速0.3 mL/min，洗脫液中花色苷檢測波長520 nm。

1.3.9.2 質譜分析

電噴霧離子源，正離子模式掃描；質量掃描范圍m/z20～1 500；毛細管電壓3.5 kV；錐孔電壓20 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流速700 L/h；錐形氣體流量50 L/h；碰撞能量6/20 V；檢測器電壓1 800 V。

1.4 數據處理

使用Excel 2016對實驗數據進行整合處理，每組實驗均重復3 次，結果以 ±s表示，采用Origin 8.5繪制圖表，使用SPSS 20.0進行差異顯著性分析（Duncan多重比較）。

2 結果與分析

2.1 抗壞血酸質量分數對PFP花色苷穩定性的影響

分別配制質量分數為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的抗壞血酸溶液，在PFP花色苷質量分數為0.3%、水浴溫度85 ℃和加熱時間5 h條件下，探究不同抗壞血酸質量分數對PFP花色苷穩定性的影響，結果見圖1。

由圖1可知，隨著抗壞血酸質量分數的升高，花色苷質量濃度呈下降趨勢。在0%～0.6%范圍內，花色苷質量濃度下降趨勢較快，當抗壞血酸質量分數超過0.6%時，下降趨于平緩，說明抗壞血酸的加入不利于花色苷的穩定，且抗壞血酸質量分數越高，花色苷降解越多，但質量分數超過一定限額，降解反應變慢。這可能是大量的抗壞血酸可以表現出關于Fenton反應的促氧化作用，其通過與飲料中的金屬離子螯合而增加活性氧物質的形成，其中特別是·OH，可以進一步降解花青素結構，導致顏色損失[21]。因此，后續實驗選取質量分數0.6%的抗壞血酸。

圖 1 抗壞血酸質量分數對PFP花色苷穩定性的影響Fig. 1 Effects of ascorbic acid concentration on the thermal stability of anthocyanins from passion fruit peel

2.2 加熱時間對抗壞血酸存在下PFP花色苷模型飲料熱穩定性的影響

按1.3.2節方法配制PFP和PFP＋VC 2 種飲料體系，在水浴溫度85 ℃、加熱時間5 h條件下，研究抗壞血酸對PFP花色苷熱穩定性的影響，結果見圖2。

圖 2 抗壞血酸對PFP花色苷熱穩定性的影響Fig. 2 Thermal stability of anthocyanins from passion fruit peel in the presence of 0.6% ascorbic acid

由圖2可知，隨著加熱時間的延長，2 種模型飲料體系中花色苷質量濃度都呈下降趨勢，僅有花色苷的體系在熱處理后花色苷質量濃度下降較緩慢，而添加抗壞血酸的體系下降趨勢更快。說明在質量分數0.6%的抗壞血酸存在下，花色苷的穩定性降低，并且在熱處理期間顯示出褪色現象，這是由于抗壞血酸與花色苷B環羥基之間的縮合反應以及抗壞血酸氧化過程產生的過氧化氫導致的[22]。雖然抗壞血酸對花色苷有不利影響，但是抗壞血酸作為營養強化劑和抗氧化劑以及其特殊的風味，仍被廣泛加入到商業飲料中。

2.3 LA和HA結冷膠對PFP花色苷熱穩定性的影響

分別配制質量分數為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的LA結冷膠和HA結冷膠溶液，在PFP花色苷質量分數為0.3%、抗壞血酸質量分數為0.6%、水浴溫度85 ℃、加熱時間5 h條件下，研究不同質量分數LA和HA結冷膠對PFP花色苷穩定性的影響，結果見圖3。

圖 3 LA和HA結冷膠體系質量分數對PFP花色苷穩定性的影響Fig. 3 Effects of LA and HA concentration on the stability of anthocyanins from passion fruit peel

由圖3可知，隨著2 種結冷膠質量分數的不斷升高，PFP花色苷保留率均呈先升高后下降的趨勢。在0%～0.3%范圍內，LA和HA結冷膠的添加使保留率上升較快，在0.3%的結冷膠體系中保留率達到頂峰，這可能歸因于在低質量分數下，結冷膠分子中構象的延伸性更好，從而暴露出更多的糖蛋白，通過與花色苷相互作用，增強花色苷的穩定性[23]。但隨著結冷膠質量分數不斷升高，保留率開始下降，花色苷穩定性降低，說明花色苷的穩定不依賴于高質量分數的結冷膠，這可能是高質量分數的結冷膠分子間空隙太過緊密導致結冷膠分子構象更加緊湊，伴隨著空間位阻的減少，花色苷與糖蛋白間的相互減少，穩定性降低[24]。同時，HA體系對花色苷的穩定性始終高于LA體系，可能是因為HA結冷膠擁有更高程度的酰化，與花色苷間具有更加良好協同作用，并在酸性條件下形成更穩定的分散體系，從而達到穩定膠體的作用[25]。因此，添加較低質量分數（0.2%～0.5%）的結冷膠更有助于花色苷的穩定。

2.4 PFP花色苷的降解動力學分析

Nakamura等[26]研究表明，凝膠長時間暴露在高溫環境中，其機械性能改變。在高熱環境暴露5 h后，結冷膠結構弱化，體積模量下降，結冷膠膠體鏈之間交聯性變差，所以高溫對結冷膠有破壞作用，但其仍能夠在一定程度上緩解花色苷的降解。

圖 4 4 種模型飲料體系中花色苷保留率的變化Fig. 4 Changes in anthocyanin residues in four model beverage systems

由圖4可知，花色苷隨加熱時間和模型飲料體系的變化發生了不同程度的降解反應。花色苷隨加熱時間的延長，保留率持續降低，不斷地發生降解反應，熱處理5 h后，4 種模型飲料體系中花色苷的保留率分別為53.08%、20.05%、28.82%、34.53%。結果表明，LA體系和HA體系在抗壞血酸存在下均能顯著提高花色苷的穩定性（P＜0.05），且HA體系比LA體系對于增強花色苷穩定性表現出更優越的性能，與Xu Xuejiao等[27]研究結果一致，這可能由于HA結冷膠酰化程度更高，其酰基在高溫下帶電而發生的相互排斥作用比LA結冷膠小，導致其糖苷鍵構象的變化也小，所以HA比LA結冷膠在穩定花色苷方面更有效。

圖 5 4 種模型飲料體系中花色苷的降解動力學Fig. 5 Degradation kinetics of anthocyanins in four model beverage systems

一般而言，降解動力學模型的判斷主要取決于擬合方程的線性回歸系數R2最高的模型。由表1可知，4 種模型飲料體系中花色苷的降解動力學模型均為一級動力學模型，這與Zhang Zhaoqi等[28]研究結果一致。由圖5可知，ln（C/C0）與t線性關系良好（R2＞0.99），說明4 種模型飲料體系中PFP的降解動力學模型仍然符合一級動力學模型。

表 2 4 種模型飲料體系中花色苷動力學參數Table 2 Kinetic parameters for degradationof anthocyanins in four model beverage systems

由表2可知，PFP花色苷熱降解速率k和半衰期t1/2受不同的模型飲料體系的影響。在單純的花色苷溶液體系中，該體系表現出最低的降解速率0.002 3 min-1和半衰期308.44 min，但抗壞血酸的存在顯著加速了花色苷的降解（P＜0.05），k增至0.004 5 min-1，且半衰期155.09 min比未添加時降低近一半。向花色苷和抗壞血酸體系中添加LA和HA結冷膠，顯著減緩了花色苷的降解（P＜0.05），在含有LA和HA結冷膠的體系中t1/2分別為189.69 min和217.92 min，說明結冷膠的添加有助于花色苷的穩定，且HA結冷膠效果更好，這表明HA結冷膠的糖蛋白與花色苷之間有更大的相互作用，在高溫處理后HA結冷膠構象排序，從無序的線圈狀態轉換為雙螺旋結構，形成一個更有凝聚力的網絡[29]。另外，HA結冷膠對抗壞血酸中帶正電的質子比LA結冷膠更敏感，促使形成額外的氫鍵，整體凝膠的強度增加，從而帶來更高的穩定性[30]。

2.5 4 種模型飲料體系對PFP花色苷色澤的影響

表 3 4 種模型飲料體系色澤的變化Table 3 Color changes of four model beverage systems

由表3可知，4 種模型飲料體系色澤受加熱時間延長而變化，當4 種模型飲料體系未熱處理時，各組L*、a*和b*值相差不大，在0～1 h范圍內，其L*、a*和b*值均有顯著增加（P＜0.05），即4 種模型飲料系統呈色變亮，紅色和黃色加深，這可能是高溫加熱初期花色苷發生了急劇的降解反應和氧化褐變反應，說明熱處理1 h對花色苷穩定性不利影響較大，褪色較快。在1～5 h范圍內，L*值顯著增加，a*值顯著減小，b*值顯著減小（P＜0.05），即4 種模型飲料系統呈色變亮、紅色變淡、黃色加深，但1～5 h內每小時之間L*、a*、b*值變化較0～1 h小，這說明加熱超過1 h時花色苷溶液仍出現廣泛褪色現象，但較0～1 h褪色反應慢。由圖6可知，隨著加熱時間的延長，只添加抗壞血酸的體系總色差總體呈上升趨勢，其余3 個系統的總色差均持續下降。在加熱1 h時，只添加VC的體系總色差比純花色苷溶液總色差小，但加熱2 h后只添加VC的體系總色差均大于純花色苷溶液，這可能是抗壞血酸作為一種天然的抗氧化劑，在加熱初期對花色苷具有一定的保護作用，但隨著加熱時間的延長，抗壞血酸在氧化過程中容易產生質子，然后轉化為脫氫抗壞血酸，質子的存在也會導致過氧化氫的存在，它會分解成·OH，從而加速花色苷的降解，導致顏色褪減[31]。同時，LA體系和HA體系總色差均比其余2 個體系低，且HA體系的護色性能明顯比LA體系優越，這與上述結果一致。

圖 6 4 種模型飲料體系總色差的變化Fig. 6 Variations in total color difference of four model beverage systems

2.6 PFP花色苷的結構鑒定

圖 7 PFP花色苷組分的高效液相色譜圖Fig. 7 HPLC chromatogram of anthocyanin components in passion fruit peel

圖 8 PFP花色苷組分的二級質譜圖Fig. 8 Tandem spectra of anthocyanin components from passion fruit peel

PFP花色苷含量豐富，運用pH示差法測得PFP花色苷含量為46.18 mg/g。使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜分析對PFP花色苷進行結構鑒定。從圖7可以看出，樣品檢測到4 個峰：2 個主峰和2 個小峰，其相應的二級質譜圖見圖8。

由圖8可知，PFP樣品中含有相對分子質量為611、449、595、463的花色苷，通過其對應的二級碎片離子進一步分析，可以推測出PFP花色苷結構，結果見表4。

表 4 PFP花色苷組分的質譜信息Table 4 Mass spectral data of anthocyanin components from passion fruit peel

從表4可知，PFP中含有4 種花色苷，分別是矢車菊素-3-槐糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷，其中矢車菊素-3-槐糖苷在PFP中為首次發現，該結論與祝慧[32]和Kid?y等[33]研究結果基本一致，鑒定出的4 種花色苷的化學結構如圖9所示。

圖 9 PFP中4 種花色苷組分的化學結構Fig. 9 Chemical structures of four anthocyanins from passion fruit peel

3 結 論

通過研究HA/LA結冷膠對含有抗壞血酸的模型飲料中花色苷的熱穩定性的影響，得出以下結論：

在85 ℃水浴0～5 h條件下，PFP、PFP＋VC、PFP＋VC＋LA和PFP＋VC＋HA這4 種模型飲料體系中花色苷含量均呈下降趨勢，花色苷的降解符合一級動力學模型，其半衰期分別為308.44、155.09、189.69 min和217.92 min。低質量分數（0.2%～0.5%）的結冷膠可以提高花色苷的穩定性，且HA結冷膠與花色苷結合的相互作用強于LA結冷膠。

在加熱1～5 h范圍內，L*值顯著增加，a*值顯著減小，b*值顯著減小（P＜0.05），即4 種模型飲料體系呈色變亮、紅色變淡、黃色加深，PFP花色苷仍出現廣泛褪，但較0～1 h褪色反應慢色現象。

PFP富含花色苷，利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜儀分析鑒定出4 種花色苷，分別為矢車菊素-3-槐糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖、矢車菊素-3-蕓香糖苷和芍藥素-3-葡萄糖苷。