鐵蛋白-海藻酸鈉納米包埋ACE抑制肽

夏偉榮，李 瑩，柴 智，陳小娥，周劍忠，馮 進，方旭波,

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014）

血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽丙氨酸-組氨酸-亮氨酸-亮氨酸（Ala-His-Leu-Leu，AHLL）是從泥鰍蛋白酶解物中分離純化的一種具備抑制ACE活性的四肽。泥鰍經蛋白酶可控降解，釋放出優異的ACE活性肽[1]。有研究[2-3]表明它可以抑制ACE活性，在原發性高血壓大鼠上具有一定降血壓效果，通過Caco-2細胞模型研究發現AHLL具有較好的吸收性，細胞吸收的表觀滲透系數達到1×10-6cm/s數量級。然而，AHLL穩定性較差，容易被消化道中蛋白酶降解，導致ACE抑制活性顯著下降[4]，從而減少了活性肽AHLL有效進入吸收系統的量。

鐵蛋白是一類鐵貯藏蛋白質，廣泛存在于動植物以及微生物體內，具有調節各類生物體內鐵代謝平衡、抗氧化及解毒等作用[5]。生物體內鐵蛋白主要由蛋白質外殼和化合態鐵核兩部分組成[6]。鐵蛋白的鐵核可以通過在無氧條件下加入還原劑透析的方式除去[7]。含有鐵核的鐵蛋白稱為含鐵鐵蛋白，不含礦化鐵核的鐵蛋白稱為脫鐵鐵蛋白。近年來鐵蛋白的可逆組裝特性受到廣泛關注[8-10]。脫鐵或重組鐵蛋白在變性條件下（極酸或極堿性環境）解離為單亞基，當pH值恢復至中性時，鐵蛋白會恢復球形結構[11]。利用這一性質，將鐵蛋白外殼作為納米載體，在鐵蛋白的變性復性過程中添加小分子營養物質，包埋于鐵蛋白的空腔內，可使小分子物質免受外界干擾，從而提高其穩定性[12]。

作為首個被分離并獲得結晶的鐵蛋白，馬脾鐵蛋白備受關注，其在醫藥新材料、免疫電子顯微鏡分析技術、疾病診斷等多領域都有廣泛應用[13]。馬脾鐵蛋白單獨作納米顆粒載體時，往往存在穩定性差、體系易受環境因素影響的缺陷。多糖作為另一類常見的生物高聚物，易與蛋白質發生復凝聚[14]，從而用其復配應用在納米顆粒載體的材料領域。海藻酸鈉（sodium alginate，SA）作為天然高分子聚合物，具有生物相容性良好、可在體內降解、毒性低、來源廣泛、價格便宜的優勢，因此受到越來越多地關注[15]。研究表明，SA具有增稠性、凝膠性、成膜性等一系列優良的理化性質及生理活性，形成的納米顆粒往往具有良好的球形外觀和控釋功能[14]。已有研究表明將此兩種物質結合運用，既可發揮鐵蛋白可逆組裝特性又兼具多糖的控釋效果[16]。本實驗以馬脾脫鐵鐵蛋白（horse spleen apoferritin，HSF）及SA為載體材料包埋ACE抑制肽AHLL，利用鐵蛋白和多糖的相互作用，制備均勻分散的HSF-ACE抑制肽（HSFAHLL）及HSF-SA-ACE抑制肽（HSF-SA-AHLL）納米復合體系，以期提高AHLL在消化系統中的吸收效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ACE抑制肽AHLL（純度＞99%，摩爾質量452 g/mol）上海強耀生物科技有限公司；馬脾鐵蛋白（摩爾質量443 kg/mol）、SA、醋酸鈉、連二亞硫酸鈉美國Sigma Aldrich公司；MOPS緩沖液 美國Amresco公司；27 MM透析袋（截留分子質量12 000～14 000 Da） 美國Biosharp公司；乙腈（色譜純）江蘇漢邦公司；三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）上海源葉生物科技有限公司；DMEM培養基（4.5 g/LD-葡萄糖）、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、Hank’s平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS） 美國Gibco公司。其他試劑均為分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

TG16-WS臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；JB-10雷磁攪拌器、ZD-2雷磁自動電位滴定儀上海儀電科學儀器股份有限公司；KQ-400KDB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ZNCL-GS數顯加熱磁力攪拌器 上海越眾儀器有限公司；HT7700透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Malvern Nano ZS90粒度電位儀 英國Malvern儀器公司；1260 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀美國Agilent公司；500型精密電子天平 意大利BEL公司；DK-8D電子恒溫水浴槽 上海精宏實驗設備有限公司；Synergy UV超純水儀 廣州東銳科技有限公司；Millicell ERS-2電阻儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液的制備

1.3.1.1 HSF溶液的制備

按照柴智[14]的方法制備。調節醋酸鈉緩沖溶液的pH值為5.2，用3 g/100 mL的連二亞硫酸鈉將鐵蛋白中三價鐵離子還原為二價鐵離子，透析除去。再加入1 mmol/L的2,2-聯吡啶螯合以除去痕量的鐵，最后，在pH 7.0的50 mmol/L MOPS緩沖液中透析除去2,2-聯吡啶，樣品溶解在5 mmol/L MOPS緩沖溶液中備用。用BCA試劑盒（微量酶標法）測定蛋白質濃度。蛋白質純化過程中除特殊指出，其他步驟均在4 ℃低溫操作。

1.3.1.2 多糖溶液的制備

稱取一定量的SA溶于去離子水中，25 ℃攪拌24 h使其充分水合備用。

1.3.2 HSF-AHLL的制備

準確稱取20 mg的AHLL標準品，溶解在HBSS平衡鹽溶液中制備成質量濃度為20 mg/mL的母液，4 ℃避光保存待用。將2 mL 2 μmol/L的蛋白溶液（5 mmol/L MOPS，pH 7.0）置于瓶中，用1 mol/L HCl溶液調節溶液pH值至2.0，室溫攪拌20 min，使蛋白解離為單個亞基狀態。隨后邊攪拌邊逐滴緩慢加入20 μL AHLL母液（20 mg/mL），使其終質量濃度為200 μg/mL，此時蛋白和AHLL的物質的量比為1∶200。室溫攪拌20 min后，用1 mol/L NaOH將溶液pH值調至7.4，于4 ℃層析冷柜中攪拌2 h以上。再將上述混合液裝入截留分子質量為12 000～14 000 Da的透析袋，在pH 7.4、5 mmol/L MOPS溶液里進行透析處理，除去未包埋的游離AHLL，每隔8 h換一次透析液，待透析完成后取出包埋物備用。

1.3.3 HSF-SA-AHLL的制備

調節SA溶液的終質量濃度為5～25 mg/L。分別調節HSF-AHLL納米顆粒懸浮液和SA溶液的pH值至3.0[14]，然后將SA溶液逐滴滴入納米顆粒懸浮液中，同時不斷攪拌獲得HSF-SA-AHLL復合納米運載體系。然后，將包埋物置于截留分子質量為12 000～14 000 Da的透析袋中，使用MOPS緩沖液（pH 7.0，5 mmol/L）在4 ℃層析柜中避光透析4 次，每隔8 h換一次透析緩沖液，以除去未結合的AHLL，獲得HSF-SA-AHLL包埋物，置于4 ℃避光保存。

1.3.4 納米粒粒徑和Zeta電位的測定

將按1.3.2節和1.3.3節制備的納米粒放入Malvern Nano ZS90粒度電位儀的槽中[17]，散射光角度固定在90°，測定溫度固定在（25±1）℃。儀器所用光源是固定激光，操作波長為353 nm，功率為30 W，測定納米粒的粒徑和Zeta電位。

1.3.5 納米粒中AHLL含量的測定

采用HPLC方法測定載入納米粒中AHLL的含量。將制備好的HSF-AHLL或HSF-SA-AHLL納米粒溶液在10 000 r/min離心2 min，取上清液，用0.22 μm的水系膜過濾，進行HPLC定量。

色譜條件[18]：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2 μm）；樣品采用梯度洗脫，流動相A為超純水（含體積分數0.1%的三氟乙酸），流動相B為乙腈（含體積分數0.1%的三氟乙酸）；程序為11 min內流動相B為15%～40%；檢測波長220 nm，流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL，程序時間15 min。用純度為99%的AHLL標準品建立標準曲線。根據標準曲線計算樣品中AHLL的含量，每個樣品至少做3 組平行，取平均值。

1.3.6 納米粒對AHLL包封率的測定

納米粒中樣品包封率是指被載入納米粒中的樣品量占投入體系樣品總量之比。用HPLC方法檢測體系中游離的AHLL含量，包封率計算見式（1）：

式中：A1為投入的AHLL總含量；A2為游離的AHLL含量。

1.3.7 透射電子顯微鏡分析[19]

用移液槍吸取制備好的納米粒，懸滴到帶有支持膜的銅網上，室溫靜置2 min后用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體，稍晾干后用2%的磷鎢酸溶液負染30 s，而后用濾紙吸去染液，靜置待液體揮發干凈后放入樣品槽觀察。

1.3.8 包埋肽在Caco-2細胞單層模型中的體外轉運

分別將ACE抑制肽AHLL、HSF和AHLL混合物及HSFAHLL包埋肽經0.22 μm膜過濾除菌并在37 ℃預熱備用。

當Transwell板上的Caco-2細胞的跨膜電阻大于250 Ω/cm2，可進行細胞轉運實驗[20]。用pH 7.4的HBSS溶液洗3 次，第3次洗滌時與細胞置于37 ℃培養箱中共浴15 min，將各孔內HBSS液吸凈。對于AP側到BL側轉運：將0.5 mL樣品加入AP側作為供給池，同時BL側加入1.5 mL空白HBSS作為接收池；對于BL側到AP側的轉運：將1.5 mL樣品加入BL側作為供給池，AP側加0.5 mL空白HBSS作為接收池。每次取樣150 μL，同時相應補加37 ℃ 150 μL空白HBSS溶液，所有實驗都3 次平行。樣品中AHLL含量用HPLC法測定。以表觀滲透系數Papp表示AHLL的轉運量[21]，計算見式（2）：

式中：dQ×dt-1為滲透速率/（μmol/s），根據樣品在不同時間轉運量對時間回歸得到的直線斜率；A為Transwell膜表面積/cm2；C0為加入Caco-2細胞模型的樣品初始質量濃度/（μg/mL）。

1.4 數據處理

數據分析與統計采用SPSS 13.0分析軟件，結果以 ±s表示，采用t檢驗分析比較各組之間的差異性，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 AHLL質量濃度對納米粒包埋效果的影響

在HSF濃度為2 μmol/L條件下，裝載不同終質量濃度的AHLL溶液，制備過程中其他條件不變，研究AHLL質量濃度對其包封率的影響。由圖1可以看出，隨著AHLL質量濃度的增大，納米粒的包封率先顯著增大，之后出現平緩趨勢，又顯著減小。這可能是由于隨著AHLL質量濃度不斷增大，載體蛋白包埋到一定程度后，包裹單位分子AHLL的鐵蛋白數量相對變少，載體包埋AHLL的概率降低，導致AHLL包埋不完全，載體蛋白對AHLL的包封率逐漸下降?？紤]到包埋濃度過低會造成AHLL在胃腸道中吸收作用不明顯，以及Caco-2細胞實驗中AHLL的存活率，綜合比較，選擇AHLL終質量濃度范圍在100～200 μg/mL之間。

圖 1 AHLL質量濃度對納米粒包封率的影響Fig. 1 Effect of AHLL concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles

2.2 HSF濃度對納米粒包埋效果的影響

改變包埋體系中載體HSF濃度，相同實驗條件下，體系中AHLL終質量濃度為150 μg/mL，研究載體蛋白濃度對AHLL納米粒包封率的影響。從圖2可以看出，隨著HSF濃度的增大，納米粒的包封率先顯著增大至一定數值后趨于平緩，之后又出現顯著下降的趨勢，可見納米粒的包封率并不與載體蛋白濃度呈正相關關系。這可能是因為，當載體蛋白濃度較小時，可以用來包埋AHLL的數量也較少，隨著HSF濃度的增加，可以形成HSF-AHLL納米粒的數量也增大，包封率隨之升高。然而，當包埋的AHLL溶液達到飽和，納米粒的包封率也隨之趨于平緩。但是，再增大載體蛋白濃度后，體系中蛋白濃度過大而發生聚集形成較大顆粒[22]，會影響包埋效果，導致納米粒包封率出現下降趨勢。因此，選擇載體蛋白濃度在1～2 μmol/L范圍內制備納米粒。

圖 2 HSF濃度對納米粒包封率的影響Fig. 2 Effect of HSF concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles

2.3 SA質量濃度對納米粒包埋效果的影響

在HSF濃度2 μmol/L、載入AHLL終質量濃度150 μg/mL、其他條件相同的條件下制備HSF-AHLL納米粒。調體系pH值為3.0，加入一系列不同質量濃度的SA溶液，研究多糖質量濃度對納米粒包封率的影響。從圖3可以看出，包封率開始顯著升高，直到多糖質量濃度為10 mg/L后趨于平衡。這是由于隨著SA質量濃度的增加，與HSF-AHLL納米粒表面結合過程中包裹的AHLL也越多；但當蛋白表面完全被過量的SA分子占據時，大量多糖的親水鏈朝向水相，靜電斥力和空間位阻效應阻止了體系中顆粒進一步的相互靠近、接觸和聚集，溶液中粒徑較小的顆粒占主導[23]，獲得的HSF-SA-AHLL復合納米粒變得穩定，從而納米粒的包封率也基本不變。因此，SA質量濃度為10 mg/L就可以使復合納米粒包封率達到最高。

圖 3 SA質量濃度對納米粒包封率的影響Fig. 3 Effect of SA concentration on the encapsulation efficiency of nanoparticles

2.4 粒徑和電位分析

表 1 HSF和HSF-AHLL的粒徑和電位Table 1 Particle size and potential of HSF and HSF-AHLL

如表1所示，空殼的HSF粒徑為19.62 nm，粒徑分布均勻。載入ACE抑制肽后，HSF-AHLL納米粒粒徑增大至28.19 nm，比空殼的HSF粒徑約大9 nm。由此，從粒徑大小證明了納米包埋體系是存在的，AHLL有可能被包埋在納米粒中。納米粒作為一種活性物質的傳輸載體，其Zeta電位是考察體系的重要因素之一。納米粒電位的大小體現了納米粒膠體溶液的穩定性，Zeta電位值越大，其表面同種電荷的相互排斥作用也越大，納米粒越不容易出現團聚現象，均勻地分散在溶液中，整個納米粒體系更加穩定。表1中Zeta電位測定結果顯示HSF-AHLL和HSF表面都帶負電荷，HSF的電位為-39.9 mV，HSF-AHLL的電位約-34 mV，這些電荷保證了整個包埋體系的穩定性。

柴智[14]研究表明，作為一種陰離子多糖，SA在pH 2.0～10.0范圍內均帶有負電荷。為利用蛋白和多糖分子在酸性條件下的靜電吸引作用形成結構緊密的絡合物，本實驗選擇在pH 3.0的條件下制備HSF-SA-AHLL復合納米粒。圖4為SA質量濃度對復合納米顆粒Zeta電位和粒徑的影響。結果顯示，隨著SA質量濃度的增加，體系的Zeta電位值不斷降低，而粒徑值逐漸增加，至鐵蛋白表面電荷被完全中和，體系電荷呈中性狀態，再進一步增大SA添加量，體系電位變成負值，聚合物解聚過程占主導地位，粒徑也逐漸變小。

圖 4 不同SA質量濃度下復合納米粒的粒徑和Zeta電位Fig. 4 Particle size and zeta potential of composite nanoparticles with different SA concentrations

由于隨著SA質量濃度的增加，體系中負電荷量逐漸增大，蛋白表面也完全被過量的SA分子占據，大量多糖的親水鏈朝向水相，同時靜電斥力和空間位阻效應阻止了體系中顆粒進一步的相互靠近、接觸和聚集，導致溶液中粒徑較小的顆粒占主導，均勻分布在其中，使得體系更加穩定[23]。本實驗研究表明，SA質量濃度高于10 mg/L后，體系的Zeta電位和粒徑均處于平臺期，不再隨其質量濃度的變化而變化，制備的HSF-SA-AHLL復合納米粒體系更穩定。

2.5 透射電子顯微鏡分析

圖 5 透射電子顯微鏡圖Fig. 5 Transmission electron micrographs

如圖5所示，空殼HSF為均一的球形，蛋白中心有少許黑點，這可能是馬脾蛋白脫鐵時殘留的Fe元素。由圖5B可以看出，納米粒HSF-AHLL也是球形，鐵蛋白空殼中有一顆顆小分子物質被包裹其中，ACE抑制肽AHLL在鐵蛋白亞基重組過程中被包埋進去，說明此包埋納米粒體系是存在的[24]。圖5C顯示：SA沒有出現明顯的多糖聚集狀態。而且，HSF-SA-AHLL復合納米粒也有與HSF-AHLL納米粒相似的球形形態，只是直徑較前者大。透射電子顯微鏡結果表明HSF的粒徑約20 nm，HSFAHLL納米粒的粒徑為30 nm，HSF-SA-AHLL復合納米粒的粒徑約為150 nm，與Malvern Nano ZS90納米粒徑儀測定的粒徑值基本一致，表觀證明了HSF-AHLL和HSF-SAAHLL形成了穩定的納米體系。

2.6 不同處理的AHLL在Caco-2細胞單層模型上吸收效果

圖6顯示了AHLL、AHLL和HSF混合物以及HSFAHLL包埋納米粒在Caco-2細胞單層模型上的吸收量在AP→BL和BL→AP兩個方向隨時間的變化情況。隨著時間的延長，不同處理的AHLL在兩個方向的轉運量都呈現不斷升高的趨勢，反映了AHLL的雙向轉運對時間的依懶性[25-26]。而其在Caco-2細胞單層的滲透在90 min以內呈線性增長，在150 min時呈飽和狀態，這個平臺可能是由于濃度梯度的缺少和一些活性載體的飽和造成的[27-28]，表明主動運輸和被動轉運同時存在。在AP→BL和BL→AP兩個方向，其表觀滲透系數均大于10-6cm/s（表2），表明AHLL在人體腸道中的吸收較好[29]。

圖 6 不同處理的AHLL在Caco-2細胞模型上雙向轉運的時效關系Fig. 6 Time-effect relationship of two-way transport of AHLL with different treatments in Caco-2 cell model

表 2 不同處理的AHLL表觀滲透系數（n=3）Table 2 Apparent permeability coefficients of AHLL with different treatments (n= 3)

對于AP→BL方向的轉運，同一時間內，HSF-AHLL包埋納米粒明顯比單獨的AHLL及HSF和AHLL混合物在Caco-2細胞單層模型上轉運量大，且表觀滲透系數（第90分鐘）也明顯高于后兩者，這是由于HSF作為納米包埋材料，對AHLL形成保護壁壘[30]，減少了消化道中蛋白酶對其降解量，從而有效提高了AHLL在人體消化系統中的吸收效果。對于BL→AP方向的轉運，如表2所示，HSF和AHLL混合物以及HSF-AHLL納米粒相比單獨的AHLL，其表觀滲透系數沒有顯著差異（P＞0.05），如何減小外排作用還需進一步研究。

3 結 論

本實驗利用鐵蛋白在強酸條件下可逆組裝性質和多糖的控釋作用，通過HSF和SA靜電吸引形成良好的復合包埋載體。將ACE抑制肽AHLL裝載到鐵蛋白的空腔內，以期研究得到的高活性HSF-AHLL及HSF-SA-AHLL納米粒，其形態呈球形。研究表明制備納米粒的最優條件為載體HSF濃度1～2 μmol/L、多糖質量濃度10 mg/L、AHLL終質量濃度100～200 μg/mL，可制備出包封率較高的納米粒體系。通過粒徑和電位測定分析，相比游離的ACE抑制肽AHLL，裝載在HSF空腔中形成的納米粒體系更加穩定。同時，通過HSF-AHLL在Caco-2細胞單層模型中的體外轉運實驗，其比游離AHLL在小腸中吸收效果更好。因此，鐵蛋白和SA作為一種雙壁材納米載體，可成功用于包埋ACE抑制肽AHLL，且HSF-AHLL納米粒有效提高了ACE抑制肽AHLL在消化系統中的吸收效果。本實驗可對食品加工中小分子活性營養物質的穩定性保持和高效吸收提供一定的參考依據。