清醬香型白酒陶壇發酵細菌群落結構多樣性分析

胡小霞，黃永光,,*，蔣 想，朱家合，金 磊

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州巖博酒業有限公司，貴州 盤州 553523；3.無錫市振太酒業有限公司，江蘇 無錫 214092）

中國白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一[1]，在其發展進程中，基于釀酒原料、釀造工藝、自然環境、糖化發酵劑等因素的差異，逐漸形成了各具特色、風格典型的醬香、濃香、清香等12 種香型白酒[2]。隨著消費需求發展，白酒釀造工藝和科技也隨之進步，白酒香型不斷創新，清醬香型白酒正是香型創新的代表產物，目前在全國已獲得廣大消費者認可和青睞。清醬香型人民小酒采用本地產糯高粱為原料，高溫水泡糧煮糧，小曲糖化培菌、大曲堆積發酵生香，陶壇發酵或窖池長期發酵，分級取酒，分類貯存，陳釀勾兌而成。其釀造工藝有機融合了清香型、醬香型白酒釀造之精華，酒體風格“清亮透明，清醬協調，香氣幽雅，醇厚豐滿，細膩柔順，回味悠長，空杯留香”，既滿足了清香型白酒的幽雅、凈爽，又富有醬香白酒的醇厚、細膩、回味悠長風格[3]。

眾所周知，白酒釀造的產質量與釀造過程微生物菌群結構及其代謝密不可分，清醬香型白酒風格之所以不同于典型的清香型和醬香型白酒，除在釀造工藝上的創新和不同外，更根本原因在于其釀酒微生物結構的差異和釀造環境的獨特。目前研究普遍認為，在白酒釀造微生物體系中，細菌有產酶和產香的能力[4]，通過代謝產生豐富的風味物質決定白酒的香型和品質[5-6]。白酒釀造過程中細菌群落結構也一直是白酒界的研究熱點[7-9]。

清醬香白酒作為創新香型白酒，還處于發展起步階段，釀造過程的細菌群落結構體系尚不明確，這在一定程度上制約了它的發展。因此，為揭示釀酒微生態、功能微生物多樣性結構對清醬香型人民小酒釀造及其酒體風格影響的機理以及清醬香型白酒釀造過程中重要發酵微生物的調節機制，本研究通過高通量測序策略并結合數理統計系統，分析清醬香型白酒陶壇發酵過程中的細菌群落結構，并進一步研究其主要細菌群落在發酵過程中的變化規律及調控機制，以期推動清醬香型白酒的創新發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

樣品采集自貴州省YB酒業有限公司2 個陶壇發酵生產車間（分別記為YB1和YB2，其入壇發酵時間和發酵工藝一致）2018年6—7月生產發酵酒醅，發酵期為21 d。每個車間同一天有50 壇酒醅入壇發酵，從中隨機抽取10 壇進行跟蹤取樣，由于陶壇質地、糟醅入壇溫度、水分、酸度、糟醅疏松度等相關因素影響，酒醅上層、中層、下層及內層、外層微生物分布存在一定差異，因此，每次采集酒醅上、中、下3 個發酵酒醅層次的發酵酒醅樣品，每個發酵酒醅層采集中間和邊緣位置（圖1），然后將6 個點樣品均勻混合為一個樣品以消除取樣誤差，混合后取200 g存于無菌自封袋中。再將從10 個發酵壇中采集的樣品各取20 g混合為綜合樣。每次采集酒醅樣品樣均采用專業的取樣器定時定位取樣，取樣器消毒滅菌后，瞬間打開封壇蓋膜，取樣器刺穿到糟醅層面，迅速、嚴格進行取樣操作，因取樣器直徑很小，只會留下1 個小孔，且取樣時間很短，取樣完畢后則立即將小孔密封，封壇。根據前期基礎研究和生產實際，由于發酵10 d后，發酵進入穩定階段，因此取樣時間定為發酵第1、5、10、20天。綜合樣分別記為YB1的1F 1 d、1F 5 d、1F 10 d、1F 20 d和YB2的2F 1 d、2F 5 d、2F 10 d、2F 20 d。樣品采集完畢則即時進行DNA提取。

圖 1 陶壇發酵酒醅取樣圖Fig. 1 Schematic of sampling positions of fermented grains from the pottery jar during fermentation

1.1.2 試劑

DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、引物合成上海生物工程股份有限公司；E.Z.N.A. Soil DNA Kit美國Omega BioTek公司；異丙醇（分析純）、TAE（Tris acetate-EDTA）緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術有限公司；Goldview染料 上海賽百盛有限公司；rTaqDNA聚合酶試劑盒北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Zealway G154DW高壓蒸汽滅菌鍋 致徽（廈門）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；GeneAmp?9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；MiSeq測序儀 美國Illumina公司；QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統 美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理[6,10-11]及DNA提取

分別取1.1.1節最后混勻的8 個綜合樣各16 g于100 mL離心管中，用30 mL滅菌后的0.1 mol/L PBS懸浮，加入3～5 顆玻璃珠，旋渦振蕩7 min，400 r/min離心5 min，取上清液。沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩4 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。將沉淀用PBS洗滌，旋渦振蕩2 min，400 r/min離心5 min，收集上清液。全部上清液于12 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細胞沉淀。預處理結束后，根據E.Z.N.A.?soil DNA Kit的操作說明提取各樣品中的微生物總DNA。

1.3.2 16S rRNA基因擴增及Illumina MiSeq測序

應用引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）擴增V3和V4高變區。PCR體系及反應條件見黃蘊利等[12]的方法；每個樣本做3 個重復。將同一樣品的PCR產物混合后用1.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫；1.1%瓊脂糖電泳檢測。

參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統進行檢測并定量，再按照每個樣本的測序量要求，進行相應比例的混合。連接“Y”字形接頭，使用磁珠篩選去除接頭自連片段，利用PCR擴增進行文庫模板富集，氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段，制備MiSeq PE文庫。再在Illumina MiSeq（PE300）平臺上機測序。

1.4 數據及圖像處理

采用Microsoft Office Excel 2016進行數據計算，IBM SPSS Statistics進行顯著性分析，R語言繪制氣泡圖和群落差異分析圖，Cytoscape繪制共線性網絡分析圖和相關性網絡圖。

2 結果與分析

2.1 陶壇發酵過程細菌群落結構分析

對兩組樣品細菌的高通量測序結果進行統計分析，圖2為清醬香型白酒陶壇發酵過程的細菌群落結構氣泡圖。

圖 2 發酵過程細菌群落結構多樣性在屬水平上的分布圖（相對豐度＞1%）Fig. 2 Distribution of microbial community at the genus level(relative abundance ＞ 1%)

從YB1中檢出11 個門，從YB2中檢出9 個門，YB1和YB2酒醅樣品中共檢出Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Deinococcus-Thermus、p_unclassified_k__norank、Fusobacteria、Saccharibacteria、Planctomycetes、Acidobacteria 11 個門，其中優勢細菌門（平均相對豐度＞10%）為Firmicutes（67.09%）和Proteobacteria（31.42%），這與清香型[11,13]和醬香型[7,14]白酒發酵過程的優勢細菌門一致。Firmicutes在清醬香型白酒發酵酒醅中占絕對主導地位，在清香型和醬香型白酒發酵酒醅中同樣如此，但豐度占比有所差異[7,11]。

從YB1中檢出166 個屬，從YB2中檢出146 個屬，YB1和YB2酒醅樣品中共檢出178 個屬。如圖2所示，有21 個屬相對豐度至少在一個樣品中超過1%，分別是：Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus、Oceanobacillus、Bacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Leuconostoc、g_unclassified_o_Bacillales、Gluconobacter、Pseudomonas、Acetobacter、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Kozakia、Pantoea、Psychrobacter和g_unclassified_c_Alphaproteobacteria、Chryseobacterium。

上述21 個細菌屬中，Weissella、Leuconostoc、Lactobacillus和Pediococcus屬于乳酸菌。乳酸菌在發酵過程可通過產乳酸、乙酸等有機酸，直接影響酒體風味。同時，乳酸和乙酸是白酒中重要風味成分乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體。乳酸菌還可通過代謝有機酸、競爭營養成分、產生抗菌素等抑制其他微生物的生長，從而調節發酵過程的微生物群落結構，間接影響酒體的品質。此外，乳酸菌還能為酵母發酵過程的酯化作用提供前體物質，具有促進釀酒發酵和美拉德反應及維持釀酒微生態環境等作用[15-17]。Gluconobacter、Acetobacter、Komagataeibacter和Kozakia屬于醋酸菌[18]。醋酸菌是一類嚴格好氧的革蘭氏陰性細菌，能氧化葡萄糖或乙醇生成乙酸，是乙酸代謝的主要來源。乙酸是白酒中主要風味成分之一。少量的乙酸對改善白酒風味、促進酒體清香有重要作用[6]。Weissella和Leuconostoc可啟動發酵，Leuconostoc還可利用葡萄糖進行異型乳酸發酵產生D-型乳酸和乙酸[19]。Gluconobacter能產生乙酸[20]。Acetobacter能產細菌纖維素[21]，具有氧化乙醇生成乙酸并進一步氧化乙酸的能力[22]。Fan Guangsen等[20]在清香型大曲中檢測到一種Acetobacter orientalis，該細菌將葡萄糖發酵成乙醇，將乙醇轉化成乙酸，通過生產乙酸異戊酯和2-苯基乙酸乙酯等酯類對酒體風味有積極作用。Komagataeibacter的部分菌株可產生細胞纖維素，可以由甘油產生二羥基丙酮，可以氧化葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、乙醇產生有機酸等[22]，Komagataeibacter在葡萄酒和有機蘋果酒浸泡醋生產中，被確定為葡萄酒醋和蘋果醋發酵中的主要微生物[23]，但尚未在白酒發酵中見到報道。Kozakia能利用蔗糖或D-果糖生產類似果聚糖的黏性物質，也能氧化乙酸鹽和乳酸鹽，利用乙醇生產食醋[18]。Oceanobacillus是大曲中的主要微生物[24]，具有產乳酸的功能[25]。Bacillus是醬香型白酒生產中的主要功能菌，能在55 ℃及以上高溫下生長，促進以葡萄糖、甘氨酸和氯化鈉為原料的美拉德反應迅速發生，生成乙酸、乙酸乙酯、乙醛、乙縮醛、丁二醇等風味物質，是重要的產酸和產香菌，促進濃郁的醬香風味形成；并且Bacillus還能代謝酶水解淀粉、蛋白質等，產生丁酸和己酸等，還有助于雙乙酰等芳香物質和吡嗪、醛類、酮類、醇類等揮發性化合物形成[6]。Enterobacter存在于大曲和小曲中[26]。Wang Peng等[27]發現在大曲發酵8 d后，Enterobacter便成為優勢微生物。黃瑩娜等[28]認為Enterobacter是白云邊窖泥中特有的優勢菌屬，對其濃醬兼香風格的形成有重要貢獻。且Enterobacter中的某些菌可產纖維素酶和乳酸[29-31]。Acinetobacter是具有呼吸和發酵代謝作用的細菌[31]，以葡萄糖和其他碳水化合物代謝產酸，是醬香型[31]和清香型[32]白酒酒醅中的主要微生物。酸類物質具有平衡酒味、協調香氣的作用。同時酸類物質也是形成酯類化合物的前體物質，而酯類化合物是構成清醬香型人民小酒揮發性香氣的重要物質[3]。綜上表明，上述微生物具有促進清醬香白酒風味物質富集的作用。

Pseudomonas是清香型白酒酒醅中的主要微生物[28]。Liu Xiu等[33]在大曲發酵的風干階段檢測到Pseudomonas。Staphylococcus為醬香型酒曲和部分堆積前、中期酒醅中的優勢菌群，文獻報道[17]部分Staphylococcus在香腸、火腿等發酵食品生產過程可產生獨特的風味物質。Pantoea、Kroppenstedtia和Lentibacillus都是大曲中的主要微生物[26,34]。清醬香型白酒采用大小曲共同發酵，發酵工藝和酒體風格融合了清、醬香型白酒二者之優勢。因此，清香型或醬香型白酒發酵過程中的主要微生物，如果在清醬香型白酒中的相對豐度較高（相對豐度＞1%），對清醬香型白酒發酵也有一定影響作用。

高通量測序結果表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter和Komagataeibacter在酒醅中的平均相對豐度大于1%，Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea在發酵結束階段平均相對豐度大于1%。以上微生物在清醬香型白酒陶壇發酵過程中的相對豐度及其功能作用表明，Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobcter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea共17 種屬是清醬香型白酒發酵過程的主要細菌屬。其中優勢細菌屬（平均相對豐度＞10%）為Weissella（20.61%）、Staphylococcus（14.19%）、Lactobacillus（12.08%）和Gluconobacter（14.17%）。而前人研究表明，清香型白酒中的主要細菌屬是Lactobacillus、Streptpcoccus、Pediococcus、Aerococcus、Bacillus、Acetobacter、Pseudomonas、Kroppenstedtia、Weissella、Acinetobacter和Leuconostoc[6,11,32,35]。如圖3所示，Weissella、Lactobacillu、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Acinetobacter和Leuconostoc是清香型和清醬香型白酒酒醅共有的主要細菌屬，Streptpcoccus和Aerococcus在清香型白酒釀造中是主要細菌屬，但Streptpcoccus在清醬香型白酒發酵過程中未檢出，Aerococcus在清醬香型白酒發酵過程中含量很低（在各樣品中相對豐度均低于0.01%）。醬香型白酒酒醅中的主要細菌屬為Acidithiobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Acetobacter、Pediococcus、Bacillus、Pantoea、Weissella、Thermoactinomyces、Enterobacter、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Acinetobacter、Lactococcus、Staphylococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospor[10,14,31,36-37]。其中Weissella、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Acinetobacter、Pantoe是醬香型和清醬香型白酒酒醅共有的主要細菌屬，Acidithiobacillus、Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Phyllobacterium、Shewanella、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Clostridium、Sensu stricto1、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Peptoclostridium、Citrobacter、Lactococcus、Enhydrobacter、Burkholderia、Desmospora、Serpens是醬香型白酒酒醅中的主要細菌屬，但Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在清醬香型白酒發酵過程中未檢出，Thermoactinomyces、Stenotrophomonas、Chryseobacterium、Escherichia-Shigella、Streptococcus、Actinobacillus、Bifidobacterium、Lactococcus和Enhydrobacter在清醬香型白酒發酵過程中含量很低（在各樣品中平均相對豐度介于0%～0.35%）。與清香型和醬香型白酒相比，Gluconobacter、Oceanobacillus、Lentibacillus、Komagataeibacter、Kozakia是清醬香型白酒酒醅中特有的主要細菌屬。正是由于發酵菌群結構的差異，其發酵動力和風味動力上也會存在差異，從而導致了醬香、清香、清醬香白酒發酵產率及其酒體風格特征上的差異。

圖 3 不同香型白酒主要細菌屬水平分布Venn圖Fig. 3 Venn map of main bacterial genera in Chinese liquors of different flavors

上述結果表明，在門水平，清醬香、清香、醬香型白酒釀造微生物差異不大，都是Firmicutes和Proteobacteria為優勢細菌門，且Firmicutes占主導地位。在屬水平，清醬香型白酒釀造過程主要細菌屬與清香型、醬香型白酒堆積發酵過程的主要細菌屬有很大重合，但又有各自特有的主要細菌屬。說明清醬香型白酒釀造過程的細菌群落結構與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性，但又不同于清香型白酒和醬香型白酒釀造細菌群落結構，具有其自身獨特性。清醬香型白酒釀造過程的主要細菌群落結構兼具了清香和醬香白酒釀造主要細菌的群落結構特點。

2.2 發酵起始和結束階段細菌群落結構

2.2.1 發酵起始和結束階段酒醅樣品與物種共線性分析

為獲得細菌在發酵起始和結束階段的表型差異和共存在關系，必須對清醬香型白酒陶壇發酵過程細菌群落結構進行解析，進一步認識其調控作用，對兩車間發酵1 d和發酵20 d酒醅樣品的細菌進行相關性分析，結果見圖4。

圖 4 發酵1 d和20 d酒醅樣品與物種共線性網絡分析圖Fig. 4 Collinearity analysis of bacterial genera in 1 d and 20 d fermented grains

對比YB1發酵起始（1F 1 d）和發酵結束（1F 20 d）時的酒醅，從圖4a可看出，有Candidatus_Saccharimonas等6 個屬只出現在發酵1 d酒醅中，發酵結束時未檢出，說明這6 個屬受發酵條件調控明顯。這6 個屬在發酵1 d時相對豐度和占0.03%，在發酵過程所占菌群結構比例很小。此外，有56 個屬在發酵1 d未檢出，但在發酵結束階段檢出（相對豐度和占0.48%），這些屬與發酵工藝變化存在協同性，并富集于發酵過程。值得注意的是，有79 個屬同時出現在發酵開始和結束階段，其中有73 個屬同時出現在YB1的4 個采樣階段，在各階段的豐度和分別占99.96%、98.91%、99.38%和98.05%，表明這些屬在發酵過程起主導性作用。對比YB2酒醅在發酵開始（2F 1 d）和發酵結束（2F 20 d）階段的菌群結構（圖4b）可知，有26 個屬只出現在發酵1 d，發酵結束時未檢出，這部分屬在發酵1 d的相對豐度和占0.20%。此外，有33 個屬在于發酵1 d未檢出，但在發酵結束時有檢出，其相對豐度和占0.20%。同時出現在發酵開始和結束階段的有79 個屬，其中有66 個屬同時出現在YB2樣品的4 個采樣階段，這66 個屬在各階段的豐度和分別占99.68%、99.54%、99.60%和97.83%，同樣表明這些屬在發酵過程具有重要作用。

在YB1酒醅樣品中，共檢出166 個屬，有43.96%的屬存在于發酵起始階段并穩定遷移、維持至發酵結束階段，這些屬在各階段的相對豐度和高達98%以上。另外，有33.73%的屬在發酵起始階段未檢出，在發酵進程中富集，但在發酵結束時相對豐度和僅占0.48%。在YB2酒醅中共檢出146 個屬，有45.21%的屬從發酵起始階段一直穩定至發酵結束，其在各階段的相對豐度和高達97.83%以上。另外，有22.60%的屬在發酵起始階段未檢出，但在發酵過程得到富集，到發酵結束時相對豐度和為0.20%。上述結果表明，在清醬香型白酒（人民小酒）發酵過程中，YB1、YB2平均有10.71%的細菌發生消亡，同時平均有28.17%的新物種得到富集，但其相對豐度和均不超過1.9%，所起的調控和發酵作用不明顯，起主導作用的微生物菌群從發酵起始階段就存在并穩定維持至發酵結束。雖然兩個車間的微生物存在一定差異，但調控發酵的主要微生物結構相似度高，且穩定性較好，部分微生物存在差異主要來源于隨發酵時間延長，發酵工藝參數變化和微生物結構變化之間的相互影響和調控。

2.2.2 發酵起始和結束階段主要細菌群落差異分析

根據上述主要細菌菌群豐度數據，運用統計學方法，對發酵1 d和發酵20 d酒醅的主要細菌屬進行假設檢驗，評估物種豐度差異的顯著性水平，獲得發酵起始和結束階段樣品的顯著性差異物種及主要細菌屬變化結果，以進一步解析發酵過程主要細菌屬的調控作用，結果如圖5所示。

上述17 個主要細菌屬，在YB1（圖5a）中相對豐度高度顯著（P＜0.001）下降的有Weissella、Gluconobacter和Pseudomonas3 個屬，其余14 個屬全部呈高度顯著（P＜0.001）上升。在YB2（圖5b）中相對豐度下降的有Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus、Bacillus和Lentibacillus5 個屬，其余12 個屬相對豐度呈現上升。其中，Weissella、Gluconobacter、Staphylococcus和Lentibacillus4 個屬相對豐度呈現高度顯著（P＜0.001）下降，Lactobacillus、Pseudomonas、Acetobacter、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc和Pantoea11 個屬相對豐度呈現高度顯著（P＜0.001）上升，Bacillus和Kozakia無顯著性變化（P＞0.01）。

圖 5 發酵起始和結束階段主要細菌群落差異分析Fig. 5 Analysis of differences in major bacterial community at the initial and final stages of fermentation

同時也可看出，在發酵階段，主要細菌屬的相對豐度存在變化。兩個車間平均73.53%的主要細菌屬呈現高度顯著（P＜0.001）上升，平均20.59%的主要細菌屬呈現高度顯著（P＜0.001）下降，僅有2 個屬無顯著性變化。發酵結束階段，細菌群落組成結構相對比較穩定，沒有占絕對優勢的微生物。在YB1中僅有Gluconobacter和Staphylococcus兩個屬是優勢細菌屬，相對豐度分別是18.20%和20.46%；在YB2也只有Weissella和Lactobacillus兩個屬是優勢細菌屬，相對豐度分別為12.03%和25.97%。

綜上，發酵階段會發生主要細菌群落結構的內部調控機制，平均73.53%的主要細菌屬相對豐度呈高度顯著（P＜0.001）上升，20.59%的主要細菌屬相對豐度呈高度顯著（P＜0.001）下降。細菌在發酵過程的含量變化主要受發酵過程發酵酒醅理化指標變化和微生物群落結構的雙向調控。到發酵結束階段，因酒醅理化指標所導致的發酵環境相對穩定，所以該階段的主要細菌組成結構呈現相對穩定，其相對豐度均小于25.97%。

2.3 主要細菌群落之間相關性

上述結果表明發酵過程的主要細菌群落結構之間通過共生、競爭及拮抗等關系形成復雜的相互調控機制，進而形成一個相對穩定的發酵微生物群落。為深入挖掘主要細菌群落之間的相關性及其變化規律，采用網絡分析方法對17 個主要細菌屬進行了相關性分析，結果如圖6所示。

圖 6 酒醅樣品中的主要細菌群落相關性網絡圖（屬水平）Fig. 6 Correlation network of major bacterial genera in fermented grain samples

從圖6可看出，發酵過程平均81.12%的細菌菌屬之間呈顯著正相關（P＜0.05）。在YB1中，正相關性占總相關性的85.19%，負相關性占總相關性的14.81%。在YB2中，正相關性占總相關性的77.05%，負相關性占總相關性的22.95%。表明這些微生物菌群在發酵過程存在一定程度上相似生態位。

Hubs種類及多少在一定程度上可反映特定環境中微生物菌群結構的穩定性。從YB1的同現性網絡圖譜（圖6a）中共發現Komagataeibacter、Pantoea、Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus、Pediococcus、Staphylococcus和Bacillus8 個Hubs（這里指至少與其他4 個屬的微生物存在正相關的節點）。Komagataeibacter是Proteobacteria門下的醋酸菌，與Bacillus、Kozakia、Acetobacter、Pantoea、Pediococcus和Enterobacter顯著正相關（P＜0.05）。Pantoea與Leuconostoc顯著正相關（P＜0.05）。Lentibacillus與Oceanobacillus、Staphylococcus和Kroppenstedtia顯著正相關（P＜0.05）。Bacillus與Pantoea顯著正相關（P＜0.05）。Staphylococcus與Oceanobacillu和Kroppenstedtia顯著正相關（P＜0.05）。Pediococcus與Bacillus、Leuconostoc和Pantoea顯著正相關（P＜0.05）。Lentibacillus與Oceanobacillu、Staphylococcus和Kroppenstedtia顯著正相關（P＜0.05）。Enterobacter與Bacillus、Staphylococcus、Oceanobacillu和Lentibacillus顯著正相關（P＜0.05）。從YB1的負相關網絡（圖6b）可發現Pseudomonas1 個負相關Hub（這里指至少與其他3 個屬的微生物存在負相關的節點）。Pseudomonas與Gluconobacter、Acetobacter和Kozakia顯著負相關（P＜0.05），此外乳酸菌Weissella和醋酸菌Acinetobacter顯著負相關（P＜0.05）。

從YB2的共現性網絡圖譜（圖6c）中共發現10 個Hubs，分別是Firmicutes下的Pediococcus、Lactobacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus和Leuconostoc；Proteobacteria下的Komagataeibacter、Acetobacter、Enterobacter、Acinetobacter和Pantoea。這些微生物中，除Leuconostoc與Acinetobacter，Kroppenstedtia與Oceanobacillus、Pediococcus之間相關性不顯著外（P＞0.05），其余全部兩兩顯著正相關（P＜0.05）。從YB2的負相關網絡（圖6d）發現Staphylococcus和Pseudomonas兩個Hubs。Staphylococcus與Acetobacter、Leuconostoc、Pantoea、Enterobacter、Komagataeibacter、Kroppenstedtia、Lactobacillus和Acinetobacter顯著負相關（P＜0.05），這幾個微生物屬全都是正相關Hubs。而在YB1中，Staphylococcus與Lentibacillus、Enterobacter、Oceanobacillus和Kroppenstedtia顯著正相關（P＜0.05）。該結果與Staphylococcus在兩個車間的含量不同有關。在YB1中，Staphylococcus總體呈上升趨勢，相對豐度從起發階段的9.07%上升至發酵結束時的20.46%。而在YB2，Staphylococcus的相對豐度從起酵時的28.03%下降至發酵結束時為0.95%。在YB2中，Pseudomonas和Lentibacillus、Bacillus、Kozakia顯著負相關（P＜0.05），Pseudomonas在YB1中也與3 個屬的微生物存在顯著負相關（P＜0.05）。

從主要細菌群落在兩個車間酒醅的相關性分析結果發現，其發酵過程平均81.12%的主要細菌菌屬之間呈顯著正相關（P＜0.05），18.88%的主要細菌菌屬之間呈顯著負相關（P＜0.05）。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清醬香型白酒（人民小酒）兩個車間發酵體系中共有的正相關Hubs，對維持發酵體系的正常、穩態發展和酒體風味的形成起到非常重要的作用。Pseudomonas是兩個車間發酵體系中共有的負相關Hub。

3 結 論

清醬香型白酒發酵過程的優勢細菌門與清香型、醬香型白酒相同，均為Firmicutes和Proteobacteria，主要細菌屬為Weissella、Gluconobacter、Lactobacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Acetobacter、Bacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lentibacillus、Pediococcus、Enterobacter、Komagataeibacter、Acinetobacter、Leuconostoc、Kozakia和Pantoea，優勢細菌屬為Weissella、Staphylococcus、Lactobacillus和Gluconobacter。Streptpcoccus在清香型白酒釀造過程中是主要細菌屬，Acidithiobacillus、Phyllobacterium、Shewanella、Clostridium、Sensu stricto1、Actinobacillus、Peptoclostridium、Citrobacter、Burkholderia、Desmospora和Serpens在醬香型白酒酒醅中是主要細菌屬，但在清醬香型白酒發酵過程中均未檢出。與清香型、醬香型白酒釀造過程微生物對比，清醬香型白酒釀造過程的細菌群落結構與清香型白酒、醬香型白酒釀造均有一定的相似性，但又不同于典型的清香型和醬香型白酒釀造過程的細菌群落結構，具有其自身獨特性，本研究對清醬香型白酒釀造微生物群落結構差異分析，為探究清醬香型白酒風味形成的微生物成因（菌系基礎）和風味特征凝練和品質創新奠定了必要基礎。

發酵過程平均有10.71%的細菌發生消亡，平均28.17%的物種得到富集，但其相對豐度都很低，相對豐度和均小于1.9%；主要細菌屬的群落組成結構發生了變化，平均73.53%的主要細菌屬呈高度顯著上升，20.59%的菌屬呈高度顯著下降。在發酵結束階段，主要細菌群落組成結構相對穩定，相對豐度均不超過25.97%；發酵過程，平均81.12%的主要細菌菌屬之間呈顯著正相關，18.88%的主要細菌菌屬之間呈顯著負相關。Komagataeibacter、Pantoea、Enterobacter、Oceanobacillus和Pediococcus是清醬香型白酒（人民小酒）發酵體系中共有的正相關Hubs，對維持清醬香白酒發酵體系的正常、穩態發展和酒體風味的形成起了非常重要的作用。