糙米酒釀工藝優化與揮發性成分分析

蘇佳佳，楊 天，佟恩杰，趙雪瑩，何程豪，楊 哪,3，徐學明,3,4，吳鳳鳳,3,

（1.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2.中糧麥芽（大連）有限公司，遼寧 大連 116000；3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；4.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

酒釀（甜米酒）是我國備受歡迎的固態發酵食品[1]。傳統酒釀通常以支鏈淀粉含量較高的精白糯米為原料，經蒸煮糊化，加入米根霉（酒曲）糖化發酵制備而成[2]。微生物的自然發酵賦予了酒釀較高的營養價值：在適宜條件下，米根霉大量生長繁殖，進而分泌糖化酶、蛋白酶、酒化酶等各種酶類[3]。淀粉在糖化酶的作用下分解生成葡萄糖、麥芽糖等，這些小分子還原糖是酒釀甜味的主要來源，小部分糖會在酒化酶的作用下被進一步轉化生成乙醇等醇類物質。另一方面，蛋白質大分子在蛋白酶作用下降解為活性短肽和游離氨基酸，復雜的糖化發酵過程還產生了檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸等有機酸類，使酒釀形成酸酸甜甜的口感，具有獨特風味而深受消費者喜愛[4]。

糙米是稻谷壟谷僅脫去最外層稻殼的米粒，是典型的全谷物食品之一[5-6]。由于保留了胚與糊粉層，其蛋白質、膳食纖維、微量元素等營養物質含量遠高于精白米[7]。糙米含有谷胱甘肽（glutathione，GSH）、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、γ-谷維醇等活性功能因子，具有預防糖尿病、改善記憶、抗氧化、降血脂等作用[8]。雖然糙米營養價值頗高，但直接蒸煮食用的口感粗糙，較硬難以咀嚼，且有糠味，因此難以被大眾廣泛接受，而將糙米制備成酒釀是開發糙米產品的優良途徑。研究顯示發酵能明顯提升原料米γ-氨基酸的含量，以及提升抗氧化等功能特性[9-10]。而對糙米酒釀的制備工藝的現有研究甚少，對于其風味的分析更是缺乏。

本研究為開發風味獨特的糙米酒釀產品，通過單因素和正交試驗結合模糊數學感官評價法優化糙米酒釀的制備工藝，并采用氣相色譜-嗅聞-質譜（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GC-OMS）聯用技術結合偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析法對糙米酒釀和糯米酒釀的揮發性成分進行對比分析，以期進一步探究糙米酒釀風味組分與感官屬性的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糙米（糙糯米）、糯米（糙糯米碾后的精白糯米）江南農副產品批發市場有限公司；甜味型甜酒曲 安琪酵母股份有限公司；糖化酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸、丙三醇、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、碘、碘化鉀、硫酸、硫代硫酸鈉國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PQX型多段可編程人工氣候箱 寧波東南儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴 上海一恒科技有限公司；KQ-3OODE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CAR/PDMS萃取頭 上海安普科學儀器有限公司；QP2010SE/MS氣相色譜-質譜聯用儀（配DB-Wax毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm））日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

糙米→除雜→清洗→浸泡→蒸煮→冷卻→拌曲→搭窩→糖化發酵→滅酶→成品糙米酒釀

1.3.2 浸泡吸水規律的測定[11]

稱取糙米20 份，每份20 g，浸泡在含有足量蒸餾水的容器中，氣候箱中靜置（溫度25 ℃，相對濕度60%），每隔20 min取樣一次，瀝干米粒表面的水分，將米粒平鋪在吸水紙上，靜置60 s，立即稱質量，按下式計算浸泡含水量：

式中：RW為浸泡含水量/%；M0為未浸泡米質量20 g；W為原料米含水量/%；Mt為浸泡后第t次稱取的糙米質量/g。

1.3.3 蒸煮糊化度測定[12]

酶水解法，在原料米蒸煮過程中，每隔5 min取樣，取樣后立即放入-40 ℃冰箱冷凍，經冷凍干燥，樣品粉碎過100 目篩，經索式抽提器提凈脂肪，通過酶水解法進行糊化度測定。

1.3.4 糙米酒釀單因素試驗

探究酒曲添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、發酵溫度（26、29、32、35、38 ℃）、發酵時間（24、36、48、60、72、84 h）各因素對糙米酒釀品質的影響，測定還原糖、總酸含量等指標及并進行感官評定。

1.3.5 正交優化試驗[13]

在單因素試驗的基礎上，分析選取影響試驗結果顯著的酒曲添加量、發酵溫度、發酵時間3 個因素，進行L9（33）正交試驗，以還原糖、總酸含量及感官評分為評定指標，對糙米酒釀的發酵工藝進行進一步優化。正交試驗設計因素與水平見表1。

表 1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.6 總酸含量測定

采用酸堿中和滴定法，取樣品酒液置于錐形瓶，加蒸餾水以一定比例稀釋，以酚酞作為指示劑，先以鄰苯二甲酸氫鉀標定氫氧化鈉，再用標定后的氫氧化鈉滴定樣品，當到達滴定終點時，指示劑顯紅色，根據消耗堿液的體積計算總酸含量。

1.3.7 還原糖含量測定[14]

采用3,5-二硝基水楊酸法，顯色劑用量為2 mL，顯色時間為5 min，在540 nm波長下測定各樣品吸光度。

1.3.8 模糊數學感官評價

感官評價小組由12 名經過感官評定分析專業培訓且有一定評價經驗的人員組成（6 名男性，6 名女性），于特定的感官評定室中各自獨立進行評價。糙米酒釀的品質評價需要綜合考慮多方面的因素，包括香氣、滋味、色澤、適口性和外觀，所有的評價指標分為4 個等級：優秀、良好、中等、較差，各等級對應的評分為90、80、70、60 分。綜合感官評定標準如表2所示。

表 2 綜合感官評定標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of rice wine

1.3.8.1 確定評價指標權重

表 3 評價指標權重分布Table 3 Weight distribution of sensory attributes for comprehensive evaluation

以上5 個指標對糙米酒釀品質都有一定的影響，綜合評價無法平等進行比較，需根據影響的大小，采用數學方式確定各指標的權重[15]。將各指標之間進行兩兩比較，如果重要程度較大則記為1，否則為0，指標自身不進行比較。所有指標的權重之和等于1。評價結果如表3所示。

1.3.8.2 建立模糊綜合評價模型[16]

將評價指標用集合A表示，則A=（a1，a2...am）=（香氣，滋味，色澤，外觀，適口性），B為等級的集合，B=（b1，b2...bn）=（優秀，良好，中等，較差），權重的集合為U，U=（u1，u2...um）=（0.12，0.33，0.08，0.13，0.34）。根據A集、B集合建立如下模糊關系矩陣：

式中：R表示每個樣品的等級評分集合，r為每一指標對應的等級評分，rij＝?j（Xi）表示第i個評價隸屬于該項目中的j等級，i=1,2…m，j=1,2…n。每個樣品的評判結果向量轉化為矩陣U和R的乘積，設為Y，則：Y＝U×R＝（y1，y2…ym）。樣品的感官綜合評分H等于評判結果向量Y乘以各等級對應評分，最終得出各樣品綜合評分結果。

1.3.9 糙米酒釀風味物質分析[17]

香氣萃?。翰捎庙斂展滔辔⑤腿。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）。準確稱取4.00 g酒釀樣品于20 mL頂空瓶中，置于60 ℃水浴中平衡10 min。插入經老化的萃取頭（250 ℃老化30 min）頂空吸附萃取30 min，將萃取頭插入GC-MS進樣口，解吸10 min。

色譜條件：采用DB-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細管柱；載氣高純He（99.999%），流速1.00 mL/min。進樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度為45 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升至230 ℃，保持4 min。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度240 ℃。

嗅聞條件：樣品中的揮發性成分在潮濕的空氣推動下以40 mL/min的速率泵入嗅吸口，由3 位經驗豐富的小組成員對分流部分進行聞香分析，記錄每個揮發性香氣成分的保留時間、強度和香氣描述。以3 名感官評價員評定的平均值為最終結果。

1.3.10 風味物質與感官屬性相關性分析[18]

香氣屬性細分為酒香、米香、果香、花香、異味5 個指標，對各樣品分別進行感官定量分析，以GC-O-MS鑒定的發酵不同階段樣品各風味物質含量為X變量，各感官屬性得分為Y變量，采用PLSR研究糙米酒釀風味物質與感官屬性的相關性。

1.4 數據處理

應用Origin 2017軟件進行數據圖形化處理，采用Xcalibur軟件處理GC-MS數據，未知化合物經計算機檢索并與NIST譜庫（107 k Compounds）及Wiley譜庫（320 k Compounds，version 6.0）進行匹配，結合文獻查閱進行圖譜解析。使用The Unscrambler X 10.4分析軟件進行PLSR分析。

2 結果與分析

2.1 最佳浸泡時間、蒸煮時間的確定

圖 1 浸泡時間（a）、蒸煮時間（b）對糙米酒釀品質影響曲線圖Fig. 1 Effect of soaking time (a) and cooking time (b) on the quality of brown rice wine

浸泡吸水能夠促進原料米蒸煮過程中的熱量傳遞，保證米粒中淀粉顆粒充分糊化，但是長時間的浸泡會促進微生物的生長繁殖[19]。由圖1a可看出，糙米在浸泡前期迅速吸水增重，浸泡后期增速放緩，由于纖維素、木質素和果膠等物質組成的糙米皮層的存在，浸泡8 h左右其含水量才趨于穩定，飽和浸泡含水量在36.83%左右，由此可以確定糙米最佳浸泡時間為8 h。原料米蒸煮實則是淀粉顆粒吸水膨脹，晶體熔解的過程[20]，但蒸煮不僅可以促進淀粉的糊化，同時也能對原料起到一定的滅菌作用，為后期起發酵糖化作用的米根霉快速生長繁殖創造有利條件。蒸煮時間過短無法充分熟化，過長則會導致米粒軟爛，不利于拌曲搭窩發酵。由圖1b可知，隨蒸煮時間的延長，糙米糊化度呈逐漸上升趨勢，但由于皮層的存在，糙米的糊化度隨時間的增速顯著慢于糯米，5～10 min增速緩慢，10～30 min時，糊化度從18.34%快速增加至94.95%，后增速放緩，逐漸趨于穩定。為保證充分糊化，確定糙米酒釀制備所需的最佳蒸煮時間為35 min。

2.2 酒曲添加量對糙米酒釀品質的影響

圖 2 酒曲添加量對酒釀品質的影響Fig. 2 Effect of the amount of koji added on rice wine quality

酒曲是糙米糖化發酵成糙米酒釀的關鍵，其所含的主要菌種為米根霉，米根霉經活化增殖，分泌各種酶類。還原糖是糖化酶作用于淀粉的產物，可間接表征糖化作用效果。在復雜的有氧發酵過程中，一部分糖會轉換為乳酸、延胡索酸等有機酸，是酒釀形成酸口感的主要原因[21]。由圖2可知，在酒曲添加量為0.2%～0.8%時，隨著酒曲添加量的增加，還原糖含量呈增長趨勢，此時酒曲添加越多，產糖能力越強，糖化效果越好。當酒曲添加量提高至0.8%～1%時，表觀還原糖含量不再增加反而下降。由圖可知，隨酒曲添加量增大，總酸始終呈增長趨勢，因此在0.2%～1%添加范圍內，米根霉的產酸能力隨酒曲添加量增加而增強。酒曲添加量過少，會導致菌種的適應期與對數期過長，進而增加酒釀被其他菌污染的幾率；過多的酒曲添加量雖然能夠縮短發酵期，但是菌種數量劇增會產生過多的代謝廢物，影響酒釀品質，故而有“曲多易壞酒”之稱，由實驗結果可知，在酒曲添加量為0.4%左右的酒釀整體感官評分較高。

2.3 發酵溫度對糙米酒釀品質的影響

圖 3 發酵溫度對酒釀品質的影響Fig. 3 Effect of fermentation temperature on rice wine quality

發酵溫度直接影響米根霉的生長代謝情況，溫度過低或者過高都不利于糖化發酵作用[22]。由圖3可知，在26～35 ℃范圍內，隨著發酵溫度的升高，還原糖質量濃度開始呈上升趨勢，從204 mg/mL升高到296.4 mg/mL，表明糖化產還原糖的能力逐漸增強，當到達35～38 ℃時，還原糖含量有所下降。總酸含量隨著發酵溫度升高呈增長趨勢。感官實驗顯示，32 ℃左右的糙米酒釀品質較好。

2.4 發酵時間對糙米酒釀品質的影響

圖 4 發酵時間對酒釀品質的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on rice wine quality

如圖4所示，由于根霉菌具有較強的產酸能力[23]，總酸含量隨著發酵時間的延長呈逐步增長趨勢。隨著發酵時間延長，還原糖生成量逐漸增多，24～36 h還原糖增速較大，后逐級放緩，72 h時達到315.1 mg/mL。72 h之后，由于微生物大量繁殖，原料米中淀粉已大部分糖化完全，此時微生物代謝消耗糖的速度已超過其糖化產糖的速度，故而隨發酵時間再延長，表觀還原糖含量開始下降，這與劉昭明等[24]的研究結果相似。經感官評定分析，經過72 h左右的恒溫發酵制備的糙米酒釀品質較好。

2.5 正交試驗結果

表 4 正交試驗結果及極差分析Table 4 Orthogonal array design with range analysis of experimental results

從表4可知，各因素對酒釀品質的影響程度不同，各因素對還原糖影響大小順序為發酵溫度＞發酵時間＞酒曲添加量，對總酸影響順序為發酵時間＞發酵溫度＞酒曲添加量，對感官評分影響順序為發酵溫度＞發酵時間＞酒曲添加量，這與鄭煥芹等[25]研究的糯米酒釀品質影響因素排序一致。通過模糊數學感官評定結合還原糖含量、總酸值的綜合衡量，最終確定糙米酒釀最優發酵工藝參數組合為A2B3C1。由此可知：糙米經過8 h的浸泡，蒸煮35 min，冷卻至室溫，添加0.4%的酒曲，搭窩，在35 ℃的發酵溫度下，恒溫發酵60 h制備得到的糙米酒釀最佳。

2.6 糙米與糯米酒釀風味對比分析

圖 5 糯米酒釀（a）和糙米酒釀（b）GC-MS總離子流圖圖Fig. 5 Total ion current chromatograms of glutinous rice wine (a) and brown rice wine (b)

表 5 糙米酒釀和糯米酒釀中的揮發性成分GS-MS鑒定結果Table 5 GS-MS identification of volatile components in brown rice wine and glutinous rice wine

續表5

對酒釀復雜風味的詮釋需要風味化合物分子層面的數據[26]。由圖5、表5可知，傳統的糯米酒釀的總風味物質36 種，且以醇、酯類為主，這與高瑩瑩等[27]的研究結果相吻合。醇類物質有14 種，乙醇相對含量較高，達到了19.13%，其次為異戊醇，相對含量為14.05%，然后是己醇，相對含量為3.33%。酯類物質共6 種，最高的酯類物質棕櫚酸乙酯，相對含量為3.95%。醛類物質7 種，含量最高的是糠醛，相對含量為1.70%。酸類物質3 種，己酸含量最高，相對含量為0.13%。酮類物質4 種，含量最高的是二羥基丙酮，相對含量為2.04%。呋喃類1 種，為2-正戊基呋喃。萜烯類1 種，為β-石竹烯。

糙米酒釀的總風味物質47 種，同樣以醇、酯類為主，但比糯米酒釀的風味要更加豐富。其中醇類物質22 種，乙醇相對含量較高，達到了28.66%，其次為異戊醇，相對含量為12.48%，之后為己醇，相對含量為5.43%。酯類物質共10 種，最高的酯類物質為肉豆蔻酸乙酯，相對含量為1.12%。醛類物質5 種，含量最高的是己醛，相對含量為0.18%。酸類物質3 種，異戊酸含量最高，相對含量為0.22%。酮類物質5 種，含量最高的是甲基庚烯酮，相對含量為0.47%。呋喃類1 種，為2-正戊基呋喃。萜烯類1 種，為β-石竹烯。

圖 6 糙米酒釀與糯米酒釀香風味屬性感官定量分析（A）及風味化合物種類分布（B）Fig. 6 Quantitative analysis of sensory flavor properties (A) and distribution (B) of flavor compounds

GC-MS從分子水平對兩者的風味進行了分析對比，宏觀上的風味感官分析則更為直觀。由圖6可知，兩者的風味整體分布相似，糙米酒釀與糯米酒釀的米香味與酒香味均較為突出，花香與果香較弱，兩者均無明顯異味。酒香屬性上，糙米酒釀強于糯米酒釀，可能是糙米酒釀中醇類物質比糯米酒釀多所致。感官定量分析得到糙米酒釀的豐富度強于糯米酒釀，這與GC-MS鑒定所得糙米酒釀的總風味物質多于糯米酒釀的結果相照應。

2.7 糙米與糯米酒釀關鍵風味物質分析

氣味是影響酒釀品質的重要因素之一，宜人的氣味可以激發食欲，為進一步探究各種揮發性化合物對酒釀氣味的貢獻程度[28]，實驗用HS-SPME法快速富集樣品中的風味物質，采用分流進樣法，通過GC-O嗅聞辨別結合GC-MS定量分析，得到對整體風味有貢獻的氣味活性物質。

表 6 揮發性成分對風味貢獻程度GC-O-MS鑒定結果Table 6 GS-O-MS identification of the contribution of volatile components to the flavor of rice wine

由表6可知，糯米酒釀能被嗅聞鑒定的化合物有19 種，而糙米酒釀能被嗅聞鑒定的揮發性化合物則有29 種，因此糙米酒釀的氣味豐富度比傳統糯米酒釀要高。隨著分流稀釋倍數增加，能被嗅聞識別的風味化合物逐漸減少，在糙米酒釀進樣氣體量分流稀釋到27 倍時，乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、己醇、蘑菇醇6 種風味化合物仍舊能被嗅聞到。由此可知，乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、己醇、蘑菇醇等對糙米酒釀風味貢獻較大，是糙米酒釀的關鍵風味物質。對照組糯米酒釀風味主要貢獻的化合物為乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、己醇和異戊醇。進一步可知，乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、己醇為糙米酒釀和糯米酒釀共有的關鍵風味物質。

2.8 發酵各階段糙米酒釀的風味變化分析

圖 7 發酵過程中5 種香氣屬性感官定量分析（A）及風味化合物種類分布（B）Fig. 7 Sensory quantitative analysis of five aroma attributes of rice wine during fermentation (A) and distribution of flavor compounds (B)

對糙米酒釀發酵不同時段氣味屬性進行定量感官分析，并對GC-O鑒定的發酵各階段有風味貢獻的化合物進行分類匯總。由圖7可知，發酵全過程中無明顯異味，發酵初期，米香最為明顯，酒香、果香、花香均最弱，隨著發酵時間的延長，酒香逐漸增強突出，發酵成熟后的花香與果香味明顯強于發酵初期，而米香則隨著發酵進程呈減弱趨勢。從整體上看，醇、酯、醛、酸類等風味化合物隨糙米酒釀發酵時間延長種類逐漸豐富。

2.9 風味物質與感官屬性相關性分析

GC-O是一種從復雜混合物中鑒別氣味成分的有用方法，但它沒有顯示出風味物質與香氣的相關性[29]。因此本研究采用PLSR對發酵不同時間糙米酒釀GC-O-MS檢測出的34 種揮發性組分和5 種感官屬性進行相關性分析[30]。

優化的PLSR模型包含2 個主成分，由圖8可知，兩個主成分對X變量解釋方差為87%，對Y變量的解釋方差為91%，大部分變量均位于r2為0.5和1.0的橢圓之間，說明該模型能很好地解釋糙米酒釀的酒香、花香、果香、米香、異味與其揮發性風味物質的相關性[31]。

圖 8 糙米酒釀香氣屬性與風味物質之間的相關性分析載荷圖Fig. 8 Loading plot showing the correlation between the aroma attributes and flavor substances of brown rice wine

由圖8可知，大部分風味物質分布在橢圓左右兩側，丁酸、3-羥基己酸乙酯等個別風味物質位于r2為0.5橢圓以內，表明不是所有的揮發性組分都對糙米酒釀的氣味有貢獻作用。乙醇、丁酸乙酯、D-香茅醇、肉豆蔻酸乙酯、異戊酸、苯乙醇等21 種風味物質與酒香、花香、果香同位于載荷圖的左側，說明這21 種風味物質與這3 個感官屬性呈正相關。PLSR模型性質表明分布越近，相關性越強[32]，圖8顯示乙醇、己醛、天竺葵醇、D-香茅醇、戊酸乙酯等與酒香、果香屬性分布較近，由此可判定乙醇、己醛、天竺葵醇、D-香茅醇、戊酸乙酯等風味物質含量的增加是引起糙米酒釀的酒香、果香風味增強的主要因素；與花香屬性相關性較強的風味物質是丁酸乙酯，通過改善丁酸乙酯的含量可以增強酒釀花香感官特征。己醇、2-戊基呋喃、苯乙醇、香葉基丙酮、壬醛等11 種風味物質和米香、異味屬性同位于荷載圖的右側，呈正相關；甲基庚烯酮、2-戊基呋喃、蘑菇醇、壬醛等分布在米香屬性周圍，表明了在發酵過程中，甲基庚烯酮、2-戊基呋喃等風味物質含減少是導致酒釀的米香逐漸減弱的主要因素。異味屬性周圍的風味物質不多，只有β-石竹烯對異味有一定的貢獻作用，整體香氣無明顯異味。

3 結 論

本研究優化了糙米酒釀的制備工藝，實驗得出：經過8 h浸泡，蒸煮35 min，添加0.4%的酒曲，在35 ℃恒溫發酵60 h制備得到的糙米酒釀最佳。與傳統糯米酒釀相對比，糙米酒釀的風味物質種類更加豐富。經優化工藝制備得到的糙米酒釀的總風味物質有47 種，能被GC-O鑒定的揮發性化合物有29 種，其中乙醇、丁酸乙酯、2-戊基呋喃、己醇、甲基庚烯酮、蘑菇醇等在分流稀釋27 倍條件下仍能被嗅聞識別，為糙米酒釀主體香氣成分。進一步的PLSR分析結果顯示乙醇、丁酸乙酯等風味組分與糙米酒釀的酒香、果香、花香呈較強的正相關，是糙米酒釀酒香、果香、花香屬性的主體呈香物質；2-戊基呋喃、甲基庚烯酮、己醇、蘑菇醇等與米香呈較強的正相關，是糙米酒釀米香屬性的主體呈香物質。