鮮切蓮藕腐敗的熒光檢測(cè)方法

劉永樂(lè)，唐 倩，俞 健，劉小芳，陳善輝，李 彥，王發(fā)祥

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

蓮藕營(yíng)養(yǎng)成分豐富、口感微甜而脆，同時(shí)又可消食止瀉、開(kāi)胃清熱、滋補(bǔ)養(yǎng)性，是優(yōu)良的水生蔬菜和副食佳品，深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。我國(guó)是蓮藕產(chǎn)銷大國(guó)，近年來(lái)產(chǎn)銷量均持續(xù)增長(zhǎng)，2017 1 122.2萬(wàn) t，居世界前茅。目前我國(guó)蓮藕消費(fèi)仍以鮮食為主，加工比例僅約5%，深加工領(lǐng)域發(fā)展空間較大。鮮切蓮藕是將新鮮蓮藕進(jìn)行清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等加工流程后得到的即食或即用蓮藕制品，因其具有清潔、衛(wèi)生、新鮮和方便等特點(diǎn)而十分暢銷[3-5]，已成為我國(guó)蓮藕加工的主要方式。然而，蓮藕水分含量高，加之加工過(guò)程中的去皮、切分等工序使其細(xì)胞受損，導(dǎo)致其生理生化反應(yīng)加劇、容易發(fā)生微生物侵染，極易腐敗變質(zhì)[5-6]，嚴(yán)重影響到其質(zhì)量與安全。因此，研究準(zhǔn)確評(píng)價(jià)鮮切蓮藕產(chǎn)品是否腐敗變質(zhì)的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

食品變質(zhì)腐敗泛指在微生物為主的各種因素作用下，食品降低或失去食用價(jià)值的一切變化，是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程[7-8]。因此，目前尚無(wú)統(tǒng)一的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)方法，主要借助微生物菌落總數(shù)、致病菌等傳統(tǒng)的衛(wèi)生指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)[9-10]。然而，傳統(tǒng)的微生物學(xué)檢驗(yàn)方法具有操作復(fù)雜、專業(yè)性較強(qiáng)、檢驗(yàn)周期較長(zhǎng)、特異性較弱等缺點(diǎn)[11-14]，不能滿足鮮切果蔬產(chǎn)品便捷檢測(cè)的需求，急需建立一種方便快捷的檢測(cè)方法。熒光檢測(cè)具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代食品安全檢測(cè)領(lǐng)域[15-17]，但利用熒光指示菌表征果蔬產(chǎn)品微生物腐敗的研究報(bào)道較少。

關(guān)于蓮藕制品貯藏過(guò)程中的微生物污染和腐敗分析，目前的研究主要集中在其優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離鑒定[6,18-19]、產(chǎn)品貨架期預(yù)測(cè)模型[20-21]等方面，而針對(duì)其腐敗變質(zhì)快速檢測(cè)或評(píng)價(jià)方法的研究較少。在前期研究中，課題組基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)對(duì)鮮切蓮藕冷藏過(guò)程中微生物菌相結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析，明確了兩種能自發(fā)產(chǎn)生熒光的特異腐敗菌Pseudomonas fluorescens和P. asturiensis可作為潛在的腐敗指示菌用于鮮切蓮藕產(chǎn)品質(zhì)量安全的評(píng)價(jià)和快速檢測(cè)研究[22]。本研究在此基礎(chǔ)上，根據(jù)該指示菌自發(fā)熒光的特性，建立一種基于熒光顯影檢測(cè)鮮切蓮藕產(chǎn)品微生物腐敗的方法，并進(jìn)行檢測(cè)條件的優(yōu)化、驗(yàn)證和相關(guān)性分析，以期為相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量安全評(píng)價(jià)和便捷檢測(cè)新技術(shù)開(kāi)發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮蓮藕：成熟度適中，藕節(jié)完整，無(wú)機(jī)械傷的帶泥蓮藕，購(gòu)自本地農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場(chǎng)；大腸桿菌（Escherichia coliBL21），由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

金氏B（KB）培養(yǎng)基[23]、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

C2 Plus激光掃描共聚焦顯微鏡 日本尼康公司；Champ Ge15000增強(qiáng)型全自動(dòng)凝膠成像儀 北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司；THZ-98AB恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮮切蓮藕樣品及其懸液制備

新鮮蓮藕按文獻(xiàn)[20]方法切片后置于4 ℃冰箱中冷藏，分別于第0、3、6、9、12天從冰箱取出，在無(wú)菌條件下稱取25 g，剪碎（大小約5 mm×5 mm），加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，于恒溫振蕩器以25 ℃、120 r/min振蕩15 min制成樣品懸液，用于后續(xù)指標(biāo)分析。

1.3.2 微生物菌落總數(shù)測(cè)定

按照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》方法進(jìn)行。

1.3.3 指示菌自發(fā)熒光實(shí)驗(yàn)

稱取適量KB培養(yǎng)基，按使用說(shuō)明加入蒸餾水和適量甘油，加熱溶解、滅菌后傾注平板。待固體平板冷卻后，用接種環(huán)分別點(diǎn)接種對(duì)照組（大腸桿菌培養(yǎng)液）和3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組（系列蓮藕懸液樣品），于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，分別于可見(jiàn)光和紫外光下觀察結(jié)果。

1.3.4 激光共聚焦顯微鏡測(cè)定樣品懸液熒光強(qiáng)度

分別取冷藏0、3、6、9、12 d的蓮藕樣品懸液及冷藏第6天的蓮藕懸液稀釋10、100、1 000、10 000 倍，用微量移液槍移取2 μL置于載玻片上，蓋上蓋玻片以激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)其熒光強(qiáng)度，其中熒光激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，電壓為105 V，激發(fā)器輸出功率為14%；標(biāo)本在不同視野進(jìn)行拍攝，將圖片分為強(qiáng)、中、弱3 個(gè)等級(jí)，選取中等強(qiáng)度的視野代表該樣品的熒光強(qiáng)度[24]，以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的熒光值表示，計(jì)算平均值。

1.3.5 熒光指示菌的便捷檢測(cè)方法建立

取不同冷藏時(shí)間點(diǎn)的蓮藕樣品懸液，用接種環(huán)劃線接種至KB培養(yǎng)基斜面試管，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，利用凝膠成像系統(tǒng)的紫外模式觀察熒光并拍照，根據(jù)檢測(cè)到的熒光情況與樣品菌落總數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系驗(yàn)證利用熒光指示菌檢測(cè)樣品腐敗的可行性。每一樣品接種3 支斜面，同時(shí)接種1 支大腸桿菌斜面作為陰性對(duì)照。

1.3.6 熒光檢測(cè)條件的優(yōu)化

取不同冷藏時(shí)間點(diǎn)的蓮藕樣品懸液，分別稀釋0、2.5、5、10、20 倍，用微量移液槍移取10 μL至KB培養(yǎng)基斜面，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后拍照，以樣品圖像的積分光密度（integrated optical density，IOD）平均值表示熒光強(qiáng)度，根據(jù)IOD值變化規(guī)律篩選合適懸液稀釋比例；懸液按最佳比例稀釋后，分別接種5、10、15、20、25 μL，按同樣的條件分析計(jì)算其IOD值，篩選最佳接種量。

1.3.7 熒光檢測(cè)方法的驗(yàn)證

按1.3.1節(jié)方法制備鮮切蓮藕樣品（30 袋），分別在冷藏第0、5、6、7天隨機(jī)取樣制備懸液，按1.3.5節(jié)的最優(yōu)條件進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光信號(hào)是否檢出判定樣品是否腐敗；同時(shí)按傳統(tǒng)的菌落總數(shù)指標(biāo)法檢測(cè)樣品是否腐敗，驗(yàn)證熒光檢測(cè)方法的可靠性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3～6 個(gè)平行，以 ±s表示，以Microsoft Excel軟件計(jì)算并繪制結(jié)果圖；激光共聚焦顯微鏡測(cè)定的DAPI值采用Leica LSCM軟件計(jì)算，KB培養(yǎng)基法獲得的照片采用Gel-Pro Analyzer軟件分析計(jì)算IOD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮切蓮藕冷藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化

圖 1 鮮切蓮藕冷藏過(guò)程中菌落總數(shù)變化Fig. 1 Changes in total colony count of lotus root samples during cold storage

如圖1所示，冷藏過(guò)程中菌落總數(shù)一直呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，新鮮（第0天）樣品為2.1×103CFU/g，冷藏前3 d增加緩慢；此后菌落總數(shù)增長(zhǎng)加快，第6天時(shí)達(dá)6.4×104CFU/g。根據(jù)浙江大學(xué)食品科學(xué)與發(fā)酵工程研究所2005年起草的《蔬菜（凈菜）質(zhì)量安全要求》，要求其菌落總數(shù)不得超過(guò)5×104CFU/g，因此可以認(rèn)為樣品在冷藏第6天時(shí)已開(kāi)始腐敗變質(zhì)；冷藏第9天后，樣品菌落總數(shù)開(kāi)始急劇增加，至第12天時(shí)已達(dá)到4.3×105CFU/g，表明已嚴(yán)重腐敗。

2.2 自發(fā)熒光指示菌的確認(rèn)

圖 2 蓮藕樣品懸液接種KB培養(yǎng)基的熒光檢測(cè)顯影結(jié)果Fig. 2 Fluorescence detection of the bacterial colonies in KB plate from different lotus root samples

在前期研究中，課題組通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)研究了冷藏期間蓮藕的優(yōu)勢(shì)腐敗菌類型和菌相結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細(xì)菌在腐敗關(guān)鍵期開(kāi)始大量增殖，逐漸成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，可以作為評(píng)價(jià)鮮切蓮藕產(chǎn)品是否腐敗的重要指示菌；尤其是優(yōu)勢(shì)腐敗菌P. asturiensis的檢出時(shí)間與腐敗時(shí)間一致[22]，且可產(chǎn)生水溶性黃綠色熒光色素[25-26]，可以通過(guò)熒光顯影技術(shù)檢測(cè)[15]。

如圖2所示，第0、3天樣品懸液接種后沒(méi)有在KB平板上長(zhǎng)出明顯菌落，可能與懸液中微生物數(shù)量較少有關(guān)；第6天后的樣品才開(kāi)始長(zhǎng)出菌落，且在可見(jiàn)光下呈黃綠色，但對(duì)照菌液接種后一直為灰白色菌落。將平板置于紫外光下，在接種第6～12天樣品處可觀察到明顯的熒光，對(duì)照菌則不會(huì)產(chǎn)生熒光，說(shuō)明熒光的產(chǎn)生與蓮藕樣品的腐敗菌有關(guān)。此外，樣品檢測(cè)出熒光的時(shí)間與DGGE圖譜[22]中P. asturiensis出現(xiàn)的時(shí)間一致，也與通過(guò)菌落總數(shù)指標(biāo)判定蓮藕樣品腐敗變質(zhì)的時(shí)間一致。因此，理論上通過(guò)檢測(cè)熒光表征樣品腐敗變質(zhì)可行。

2.3 熒光強(qiáng)度與微生物數(shù)量的關(guān)系

表 1 不同冷藏時(shí)間和稀釋度蓮藕樣品懸液的DAPI值Table 1 Fluorescence intensities of suspension cultures of lotus root samples with different cold storage times and dilution factors

激光掃描共聚焦顯微鏡可以定量檢測(cè)生物體自發(fā)熒光強(qiáng)度[27-28]。如圖3所示，隨著蓮藕冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品懸液的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，尤其是第6天后熒光強(qiáng)度急劇上升，至第12天時(shí)達(dá)到最強(qiáng)（圖3A、表1），說(shuō)明樣品懸液中熒光指示菌產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與其冷藏過(guò)程中菌落總數(shù)（圖1）的變化趨勢(shì)基本一致。由于蓮藕樣品在冷藏第6天開(kāi)始腐敗，將冷藏6 d的蓮藕樣品懸液稀釋后進(jìn)行激光共聚焦熒光檢測(cè)。樣品原液的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨著稀釋度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸減弱（圖3B、表1），說(shuō)明熒光強(qiáng)度與指示菌數(shù)量間具有一定的正相關(guān)關(guān)系，可以根據(jù)指示菌的熒光強(qiáng)度表征樣品的微生物污染程度，從而直觀地分析其腐敗情況[29]。

2.4 熒光檢測(cè)方法的建立

激光共聚焦熒光檢測(cè)可以較好地根據(jù)指示菌的熒光強(qiáng)度表征樣品的微生物腐敗程度，但受限于激光掃描共聚焦顯微鏡的購(gòu)置和檢測(cè)成本，目前采用該方法檢測(cè)鮮切蓮藕樣品微生物腐敗仍不現(xiàn)實(shí)。因此，需要發(fā)展一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)又便捷的熒光指示菌檢測(cè)方法。圖4為不同冷藏時(shí)間的蓮藕樣品懸液接種KB斜面后利用凝膠成像系統(tǒng)照相獲得的照片。各組陰性對(duì)照的斜面試管（第4支）均無(wú)熒光產(chǎn)生，樣品試管從冷藏第6天開(kāi)始檢測(cè)到熒光，這一時(shí)間點(diǎn)與圖1的結(jié)論（開(kāi)始腐敗的時(shí)間點(diǎn)為第6天）吻合。因此，可以用樣品熒光指示菌的檢出表征樣品的微生物腐敗，該方法較激光共聚焦檢測(cè)更實(shí)惠，同時(shí)較傳統(tǒng)衛(wèi)生指標(biāo)檢測(cè)法更簡(jiǎn)單快捷。然而，可能由于劃線接種量的不確定性，樣品的熒光強(qiáng)度與其微生物菌落總數(shù)的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系還不理想，尚需對(duì)其熒光檢測(cè)條件進(jìn)一步優(yōu)化。

圖 4 不同蓮藕樣品懸液接種KB斜面后的熒光檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Fluorescence detection of suspension cultures of different lotus root samples inoculated on KB slopes

2.5 熒光檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.5.1 稀釋度的選擇

圖 5 不同稀釋度蓮藕懸液接種KB斜面后的熒光檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples with different dilution factors inoculated on KB slopes

如圖5所示，對(duì)照和第0天樣品斜面試管均無(wú)熒光產(chǎn)生，而冷藏6 d以后樣品的各稀釋度斜面均檢測(cè)到熒光，且強(qiáng)度基本隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，再次印證了利用指示菌熒光檢測(cè)表征樣品微生物腐敗的可行性；然而，原液和稀釋2.5、5 倍的第3天樣品各有1 支試管檢測(cè)到微弱熒光，說(shuō)明不合適的樣品懸液稀釋度可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此，后續(xù)選取稀釋10 倍作為最佳稀釋度。

2.5.2 接種量的確定

在不同蓮藕樣品均稀釋度懸液均稀釋10 倍的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同接種量實(shí)驗(yàn)，斜面培養(yǎng)后的熒光檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。接種量為5、10 μL的樣品均第6天開(kāi)始出現(xiàn)熒光，且隨著接種量的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；而接種量大于15 μL后，冷藏第3天樣品試管也能檢測(cè)到熒光，說(shuō)明接種量太大造成假陽(yáng)性結(jié)果。分析計(jì)算接種5 μL和10 μL實(shí)驗(yàn)組樣品圖像的IOD值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種量為5 μL時(shí)其與冷藏時(shí)間的相關(guān)性更好（圖7）。因此，最終確定樣品懸液稀釋10 倍、接種量5 μL為熒光指示菌便捷檢測(cè)方法的最優(yōu)條件。

圖 6 不同接種量蓮藕懸液于KB斜面培養(yǎng)后的熒光檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Fluorescence detection of suspension cultures of lotus root samples at different inoculum amounts inoculated on KB slopes

圖 7 最佳檢測(cè)條件下的樣品IOD值與冷藏時(shí)間的關(guān)系Fig. 7 Relationship between cold storage time of lotus root samples and fluorescence intensity under optimal conditions

2.6 檢測(cè)方法的驗(yàn)證

隨機(jī)選取10 個(gè)不同凍藏時(shí)間的鮮切蓮藕樣本，分別以本研究的熒光檢測(cè)方法和傳統(tǒng)的微生物菌落總數(shù)分析法進(jìn)行樣品微生物腐敗檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果如表2所示。除冷藏第5天的樣品檢測(cè)到微弱熒光外（導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能與樣品腐敗菌的個(gè)體差異和稀釋或接種操作有關(guān)[30]），其余樣品均與傳統(tǒng)方法檢測(cè)的結(jié)果一致，準(zhǔn)確率高達(dá)90%，說(shuō)明本研究建立的利用熒光指示菌檢測(cè)鮮切蓮藕腐敗的方法可行。

表 2 熒光檢測(cè)法與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果比對(duì)Table 2 Comparison of the results of fluorescence detection and traditional detection methods

3 結(jié) 論

本研究基于前期PCR-DGGE技術(shù)明確了鮮切蓮藕冷藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)腐敗菌P. asturiensis的檢出時(shí)間與腐敗時(shí)間點(diǎn)的一致性，應(yīng)用其自發(fā)熒光的特點(diǎn)建立了一種基于熒光顯影表征鮮切蓮藕產(chǎn)品微生物腐敗情況便捷檢測(cè)方法。通過(guò)熒光指示菌的確認(rèn)、熒光強(qiáng)度與微生物數(shù)量的相關(guān)性分析、熒光檢測(cè)方法建立及其檢測(cè)條件的優(yōu)化，最終對(duì)實(shí)際樣品腐敗檢測(cè)的驗(yàn)證結(jié)果與傳統(tǒng)菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法基本一致。與傳統(tǒng)微生物衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)方法相比，該熒光檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀，而且檢出準(zhǔn)確率高，是一種便捷可行的蓮藕腐敗檢測(cè)方法。